Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Detta arbete stöds av stiftelsen brittiska hjärtat, Richard Bright VEGF forskning lita och MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. De kritiska steg i varje metod möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, inklusive bedömning av permeabiliteten i njurarna som helhet (uACR och plasma kreatinin mätningar), permeabiliteten i enskilda glomeruli (glomerulär LpA / Vjag), undersökning av strukturella förändringar (PAS, Trichrome blå och EM), protein lokalisering (om), och glomerulär genuttryck (RT-PCR och Western blotting). Dessa metoder är nyckeln till den fullständiga utvärderingen av glomerulär funktion i musmodeller av njursjukdom.
Vid bedömningen av permeabiliteten i GFB, har många studier valt för att använda den konventionella uACR eller 24 h albumin utsöndring kursen som en effektiv åtgärd17,18. Även om dessa tekniker tillåter bedömning av GFB permeabilitet som helhet, tillåter det inte för enskilda glomerulär permeabilitet bedömning och variation bland glomeruli. Tidigare studier har hittat mätning av den glomerulära LpA / Vi att vara ett känsligare mått på förändringar till GFB permeabilitet5,9. Faktiskt, i de representativa resultat visat i detta papper, på 14 veckor post induktion av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss har en betydligt lägre uACR jämfört med VEGF-A KO möss; men detta resultat inte återspeglas i den glomerulära LpA / Vjag mätningar, där VEGF-A165b betydligt inte hindrade ökar i GFB permeabilitet (figur 1 och figur 2)5. Detta visar vikten av att använda flera analyser för att bedöma både njure permeabilitet och genomträngligheten av enskilda glomeruli. Dessutom den glomerulära LpA / Vjag oncometric analysen antyder att permeabiliteten av enskilda glomeruli från samma njuren kan variera kraftigt, särskilt i sjukdom modeller5,10, 19. en begränsning till mätning av glomerulär LpA / Vjag är att den endast kan utföras på experimentell slutpunkten; regelbundna uACR mätningar måste således ge en indikation av experimentella slutpunkten.
Förutom att bedöma funktionella fenotypen, uppmuntrar denna metod också bedömning av strukturella och ultrastrukturella fenotypen. Detta kan göras med hjälp av ett urval av fläckar som PAS, trikrom, och silver fläckar; var och en att bedöma olika aspekter av glomerulär morfologi. I akut modeller av glomerulär sjukdom, som ofta är fallet i musmodeller, kan vara svårt att upptäcka eventuella stora strukturella avvikelser med dessa fläckar om du är en utbildad nedsatt patolog. Därför föreslås genomför EM för att bedöma ultrastruktur av den GFB, som tillåter kvantitativ mätning av parametrar såsom GBM, endothelial fenestrae storlek och antal och podocyte egenskaper. Sådana mätningar kräver minimal utbildning för att utföra och gör utredaren att avgöra de cell-typer/strukturer påverkas i en sjukdom modell. I exemplet som visas i de representativa resultat, VEGF-A KO musen konstaterades vara en mild modell av glomerulär sjukdom, således var inga stora strukturella avvikelser närvarande vid PAS färgning. Dock inducerade podocyte-specifika VEGF-A KO förändringar till GBM, podocytes och endotelceller vid prövningen av den glomerulära ultra-struktur5. Utarbetandet av njuren för EM som beskrivs i denna metod kan tyvärr inte upptäckt av den endothelial glykokalyx, som också är känd att ha betydande effekter på permeabilitet av GFB19. För att noggrant mäta glykokalyx djupet, bör njurarna BEGJUTA-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå endothelial glykokalyx märkning, som beskrivs i Nicolae Oltean et al19.
När den funktionella och strukturella fenotypen har bedömts, kan uttryck/aktivering mönster av olika gener och vägar då bedömas särskilt i glomeruli. Ultra strukturella förhandsbedömning kan ge viss information om cellen typer/glomerulär strukturer involverade, som anger om podocyte - eller endotel-specifika gener/vägar bör undersökas. Exempelvis i representativa resultat från VEGF-A KO möss observerades en minskning av antalet endothelial fenestrae (figur 3D); Därför undersöktes glomerulär proteinuttryck för en endothelial markör kända för att vara involverade i VEGF-A väg; VEGFR-2 (figur 4B)5. Förutom att uttrycket av proteiner i glomeruli, kan deras localization också visualiseras med om. I en studie av Zhang et al20bekräftades podocyte-specifika överuttryck av GLUT1 i podocytes av om samtidig lokalisera den ökade GLUT1 med podocin.
I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument att bedöma njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom den glomerulära fenotypen utvärderas helt från flera aspekter. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoden kan enkelt tillämpas på framtida utredningar av glomerulär funktion både i bedömningen av sjukdom fenotyper och potentiella therapeutics.
Avslutningsvis beskriver detta generiska och anpassningsbar protokollet en full njure arbete upp för musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.

Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Sådan murina modeller inkluderar spontan modeller såsom spontant hypertensiva råttor (SHR)1, streptozotocin (STZ)-inducerad diabetiska råttor och möss2och db/db typ II diabetiker möss3, genetiskt modifierade modeller såsom primär podocyte-specifika fokal segmentell glomerulär skleros (FSGS) modeller4, den podocyte-specifika vaskulär endotelial tillväxtfaktorn (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, och Alport syndrom modeller6, och förvärvade modeller såsom den 5/6 nefrektomi7 och den ensidiga uretär obstruktion (UUO) modell8. För att bedöma olika aspekter av glomerulär funktion i dessa modeller, finns flera tekniker tillgängliga. Syftet med denna metod papper är att visa en omfattande arbete-up som bör utföras i musmodeller av njursjukdom för att fullt ut bedöma glomerulär funktion.
Logiken bakom denna metod är att det möjliggör den glomerulära fenotypen utvärderas fullt ur flera aspekter. Detta inkluderar bedömning av glomerulär permeabilitet, både protein och vatten, glomerulär strukturella avvikelser och förändringar i den uttryck/skarvning av mRNA och proteiner viktiga för normal glomerulär funktion. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Detta är viktig information om mekanismen av sjukdom, som krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller.
I litteraturen är det vanligt att presenteras med en musmodell av glomerulär sjukdom där fenotypen bestäms av en ökad nivå av albumin i urinen. Det finns dock tecken som tyder på att en enda metod för att bestämma glomerulär funktion inte är alltid effektivt. mäta andelen urin albumin utsöndring eller urinvägar albumin kreatinin kvoten (uACR) endast ger information på totala njurfunktionen, och inte de enskilda glomeruli. Tidigare studier har visat att permeabiliteten kan variera i olika glomeruli från samma njure5,9,10. Bedömning av permeabiliteten av enskilda glomeruli är dessutom ett känsligare sätt att utvärdera glomerulär funktion; tekniken att mäta de enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet (LpA / Vjag) har visat sig vara mer känslig för förändringar i glomerulär funktion än mätning uACR9. Denna analys är fördelaktigt i musmodeller som är resistenta mot proteinuri, såsom de på en c57BL/6 bakgrunden11. Fördelen med det nuvarande metoden papperet är att det undersöker både totala nedsatt permeabilitet till albumin samt enskilda glomerulär permeabilitet för vatten.
Undersökning av glomerulär strukturella avvikelser bedöms ofta av ett batteri av fläckar såsom Perjodsyra Schiff (PAS), trikrom, och silver fläckar. Dessa möjliggör en utbildad nedsatt patolog att utvärdera nivån på njursjukdom via en Poängmetod. Även om alla bra metoder, förändringar i glomerulär makro-strukturen inte alltid iakttas i modeller akut njurskada12. Denna metod föreslår att utöver nedsatt histologi metoder som beskrivs ovan, bör glomerulär ultra-strukturen också bedömas via elektronmikroskopi (EM). En betsad glomeruli kan se relativt normalt under ett vanligt ljusmikroskop; dock vid bedömning med EM, små förändringar i den glomerulära basalmembranet (GBM) bredden, analyseras podocyte fot processen utplåning, endothelial fenestrations och sub-podocyte utrymme täckningen. Därför är det viktigt att både glomerulär ultra-struktur och mikrostruktur utvärderas för att bestämma mekanismen av glomerulär dysfunktion.
Förutom att bedöma glomerulär strukturella avvikelser, bör förändringar i mRNA och proteinuttryck och skarvning, samt protein aktivering (t.ex., fosforylering), undersökas för att ytterligare belysa mekanismerna av glomerulär sjukdom. När man tittar på glomerulär sjukdom, eller, till exempel när KO/över-expressing en gen specifikt i glomerulära celler, såsom i den podocyte-specifika VEGF-A KO mus5, är det viktigt att protein och mRNA ändringarna undersöks endast inom den glomerulära celler, och inte hela njuren. Det här protokollet beskriver en metod där glomeruli är isolerade från mus njure cortex, och sedan protein/RNA isoleras. Detta tillåter särskild analys av den protein/mRNA dysreglering i glomeruli av sjukdom modell.
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Vår forskning är inriktad på bedömning av glomerulär funktion i diabetisk nefropati och podocyte-specifika VEGF-A knock-out möss; Det här protokollet beskriver därför full njure arbete-upp används i vårt labb för att bedöma dessa mus-modeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument den glomerulära fenotypen utvärderas fullständigt från flera aspekter. Genom att använda denna metod kan forskaren avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionell bedömning av den glomerulära barriären genom mätning av den urin albumin kreatininclearance baserat och enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet, samt både strukturella och Ultra strukturella undersökning med hjälp av Perjodsyra-Schiff fläcken och elektronmikroskopi. Dessutom möjliggör analys av de gener dysreglerad på mRNA och protein nivå mekanistiska analys av glomerulär funktion. Detta protokoll beskriver de generiska men anpassningsbara metoder som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.

Urin samlades in med hjälp av metabolismburar från vildtyp (WT), inducerbara podocyte-specifika VEGF-A knock-out (VEGF-A KO) och VEGF-A KO X Neph-VEGF165b möss (VEGF-A KO möss som alltför express den humana VEGF-A165b isoformen i podocytes i en konstituerande sätt). Vid mätning av urin albumin kreatinin förhållandet vid vecka 0, 4, 10 och 14 efter doxycyklin induktion av VEGF-A KO utvecklat VEGF-A KO möss progressiva albuminuri av 10 veckor jämfört med WT littermate kontroller. De absoluta värdena kan ses i figur 2Aoch den normaliserade till baslinjen varje mus värdena i figur 2B. Albuminuri i inte observerats i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (figur 2), vilket indikerar att VEGF-A165b är dock skyddande i modellen av albuminuri5.
Den glomerulära LpAVjag var mätt i enskilda glomeruli siktas från WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b njurar. Ett exempel av hur en njure är fångad och krympning iakttas när perifused med 8% BSA visas i figur 3A. Denna krympning används sedan för att bestämma den glomerulära LpA / Vjag för varje glomeruli (figur 3B). VEGF-A KO möss hade en betydligt ökad glomerulär LpA / Vjag på 14 veckor post VEGF-KO induktion jämfört med WT kontroll glomeruli. Även om lägre i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss, de ökad glomerulär LpA / Vjag var inte hindras av över uttryck av VEGF-A165b vid 14 veckor5.
PAS färgning av njure cortex avsnitt 14 veckor efter induktion av VEGF-A KO visade inte någon glomerulär strukturella avvikelser i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (figur 4A). Dock vid analys av glomerulär ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO möss hade utvecklat en ökad GBM bredd, minskat antal endotelceller fenestrae, minskade SPS täckning och ökade genomsnittliga podocyte skåra bredd (figur 4 c-4F ). Genomsnittliga podocyte foten bearbeta bredd och antal slitsar oförändrad (figur 3B och 3 G). Över uttryck av VEGF-A165b i VEGF-A KO möss hindrade ändringarna till GBM och slits bredd (figur 4 c och 4F). VEGF-A165b hade dock ingen effekt på förändrade fenestrae antal och SPS täckning (figur 4 d och 4E)5.
RT-PCR utförs på RNA extraherade från Söll glomeruli avslöjade att den humana VEGF-A165b mRNA finns endast i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss (figur 5A). När utvinna protein från Söll glomeruli och bedöma nivåerna av proteiner via Western blotting, befanns glomerulär proteinuttryck för VEGFR-2 vara minskade i VEGF-A KO möss, som hindrades av över uttryck av VEGF-A165b ( Figur 5B och 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figur 1. Schematisk uppsättning upp glomerulär permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomeruli är fångad på (B) mikropipett inom en hållare med sug, som spänns fast på ett fäste för stabilitet. (C) rektangulära microslide. (D) 4 X-objektiv av ett Mikroskop med en videokamera. (E) 1% BSA lösning värmas till 37 ° C. (F) 8% BSA lösning värmas till 37 ° C. (G) Remote tryck uthärda två perifusate-innehållande linjer, som tillåter snabb perifusate exchange. (H) rutten av perifusate mot den microslide, som sedan badar i glomeruli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figur 2. Urin-albumin kreatininclearance baserat. (A) uACR värdena vid vecka 0, 4, 10 och 14 efter induktion av VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss. (B) samma uACR värden normaliseras till utgångsvärdet (vecka 0) av varje enskild mus. UACR ökat betydligt i VEGF-A KO möss vid vecka 10 och 14 jämfört med WT littermate kontroller, som förhindrades i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (* p < 0,05; Tvåvägs ANOVA, korrigering för jämförelse mellan paren; n = 4-12 möss per tidpunkt; felstaplar: standard standardfel [SEM]). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figur 3. Mätning av glomerulär vattengenomsläpplighet. (A) i glomeruli är fångad på mikropipett via sug; perifusate slås från 1% BSA (Ai) till 8% BSA (Aii) och glomerulär krympning observeras. (B) mätningar före och efter 8% BSA switch används för att bestämma den glomerulära LpA / Vjag. (C) VEGF-A KO möss utvecklar en ökad glomerulär LpA / Vjag på 14 veckor post induktion av VEGF-A KO jämfört med WT kontroller. Detta hindrades inte signifikant i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 4-9 möss, 15-30 glomeruli; felstaplar: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figur 4. Glomerulär strukturell analys. (A) PAS färgning av njure cortex indikerade inte några strukturella avvikelser i glomeruli från WT, VEGF-A KO och VEGF-A X Neph-VEGF-A165b möss (Ai - iii). EM avslöjade Ultra strukturella avvikelser i de VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) den genomsnittliga FPW förändrades inte mellan grupperna. (C) The GBM ökade i de VEGF-A KO glomeruli, som förhindrades av VEGF-A165b. (D) antalet fenestrae minskade i VEGF-A KO glomeruli, som förblev oförändrat av VEGF-A165b. (E) The SPS täckning var minskade i VEGF-A KO glomeruli, som också varit oförändrat av VEGF-A165b. (F) den genomsnittliga skåra bredd ökades i VEGF-A KO glomeruli, som förhindrades av VEGF-A165b. (G) antalet slit var oförändrad mellan de tre grupperna (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 3 möss, 9 glomeruli; felstaplar: SEM). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figur 5. mRNA och protein uttryck för markörer. (A) RT-PCR visade att humana VEGF-A165b mRNA uttryck endast var tydligt i de Söll glomeruli från VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss. (B) Western blotting anges att VEGFR-2 proteinuttryck var ned-reglerade i VEGF-A KO glomeruli, som hindrades i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Envägs ANOVA, Bonferroni korrigering för jämförelse mellan paren; n = 3 - 6 möss; felstaplar: SEM). Denna siffra har ändrats från Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.

Bedömning av njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bedömning av hjärtfunktionen och Energetics i isolerade Mus Hearts Använda 31 P NMR-spektroskopi

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metod för mus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Bedömning av hjärtfunktionen och Myocardial morfologi Använda Small Animal Look-skåp Inversion Recovery (SALLI) MRT i råttor

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Bedömning av höger kammare struktur och funktion i musmodell av lungartären Förträngning av Transthoracic Ekokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Bedömning av kärlfunktionen hos patienter med kronisk njursjukdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Mus Njurtransplantation: Modeller av allograftavstötning

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Användning av ultrahög Field MRI i Small Gnagare Modeller av polycystisk njursjukdom för<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotypning och narkotikamissbruk

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan bedömning av njurfunktion i medvetna Gnagare

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Kutan Kirurgisk denervering: En metod för att testa Krav på nerver i musmodeller av hudsjukdom

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Upprepade mätningar av andningsmuskelaktivitet och Ventilation i musmodeller av neuromuskulära sjukdomar

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...