Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

ونشكر أعضاء مختبر برودي للمساهمات لهذه المادة. ودعمت هذا العمل MH096832 R01s المعاهد الوطنية للصحة و MH084989 إلى كيلوبايت، والمعاهد الوطنية للصحة بريدوكتورال زمالة F31 MH111144 D.L.K.

1-اليرقات الغراء تشريح
<ol><li>مزيج دقيق 10 أجزاء من سيليكون الاستومر قاعدة مع جزء 1 من سيليكون الاستومر علاج عامل من مجموعة الاستومر (جدول المواد).</li>
	<li>معطف كوفيرسليبس الزجاج 22 × 22 ملم مع الاستومر وعلاج على صفيحة ساخنة في 75 ˚C لعدة ساعات (حتى لم يعد مثبت للمس).</li>
	<li>ضع ساترة واحد زجاج ا...

عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك+] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية29. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محليا...

وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية1. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك2. قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصالات متشابك. وفي وقت لاحق، SVs يتم استردادها من غشاء البلازما عن طريق إعادة تدوير قبله، وتشغيل أو كلاثرين بوساطة الالتقام (CME) لدورات متكررة exo/الالتقام. المورفولوجية NMJ يسهل الوصول إليها ومناسبة تماما لعزل ووصف SV دورة طفرات على السواء. استخدام شاشات الجينية إلى الأمام، أدت الطفرات الرواية إلى تحديد الجينات الجديدة الحاسمة ل دورة SV3. وعلاوة على ذلك، أدت عكس النهج الوراثية بدءاً من الجينات معروفة بالفعل لاستيضاح SV دورة آليات جديدة من خلال الوصف الدقيق للمسخ ركوب الدراجات تعمل4. المورفولوجية NMJ مثالي تقريبا كإعداد متشابك تجريبية لتشريح آليات SV الالتقام والرقابة عن طريق أساليب بصريا حويصلة المسار الدراجات خلال كبيرة.
تسمح مجموعة من علامات مضيئة التعقب البصرية من الحويصلات أثناء ركوب الدراجات الديناميات، ولكن أكثر تنوعاً FM صبغ النظير الذي يتم تصنيعه أولاً قبل ماو، واو، وآخرون. 5-هيكلياً، تحتوي على صبغات FM رأسه ماء وذيل محبتين متصلاً من خلال عصابة عطرية، مع منطقة الوسطى منح الخواص الطيفية. ستيريل هذه الأصباغ التقسيم عكسية في الأغشية وليس 'التقلب المفاجىء' بين منشورات الغشاء وحتى لا تكون ابدأ حرة في سيتوسول، وهي أكثر بكثير من الفلورسنت في أغشية من المياه5. عكسها الإدراج إلى بلير دهن يؤدي زيادة محاطاً fluorescence6. في نهايات الخلايا العصبية، تتكون كلاسيك FM صبغ تجارب وضع العلامات للاستحمام إعداد متشابك مع الصبغ أثناء ديبولاريزينج التحفيز لتحميل صبغة عن طريق الالتقام SV. صبغ خارجي ثم جرفت ويلقي القبض عليه في دورة SV في حل خالية من الكالسيوم في المسابقة للصورة المحملة نهايات7. جولة ثانية من التحفيز في حمام خالية من صبغة مشغلات إطلاق سراح وزير الخارجية من خلال الرقابة، عملية التي يمكن اتباعها من قبل قياس انخفاض كثافة الأسفار. ويمكن السكان SV من حويصلة واحدة لحمامات السباحة التي تحتوي على مئات حويصلات كمياً رصد6،7. وقد استخدمت الأصباغ FM لتشريح وتعتمد على نشاط تعبئة متميزة وظيفيا SV برك، ومقارنة قبله وتشغيل مقابل CME ركوب8،9. تم تعديل الأسلوب لكل على حدة بالانزيم أثارت، دورة متشابك عفوية ومصغر الأنشطة (مع معدات حساسة للغاية للكشف عن تغييرات صغيرة جداً الأسفار والحد من فوتوبليتشينج)10. فحوصات يمكن تمديدها إلى مستوى ultrastructural قبل فوتوكونفيرتينج إشارة FM الفلورية إلى تسمية وحدة إلكترون كثيفة لانتقال الميكروسكوب الإلكتروني11،،من1213،14 .
تاريخيا، كانت الاستعدادات الاستحمام متشابك في تركيزات عالية من البوتاسيوم (يشار إليه فيما يلي "عالية [ك+]") الأسلوب المفضل للتحفيز لحمل SV ركوب الدراجات؛ ديبولاريزينج بدءاً من الضفدع اتروبين NMJ5، إلى مثقف القوارض الدماغ الخلايا العصبية هيبوكامبال15، إلى المورفولوجية جلوتاماتيرجيك NMJ النموذجي16،17. هذا النهج [ك+] عالية بسيط، يتطلب أي معدات متخصصة، وهو وبالتالي الوصول إلى معظم المعامل، ولكن قيود لتطبيق وتفسير البيانات. أسلوب أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية مناسبة لاستخدام الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للعصب4،،من512. هذا النهج محركات نشر إمكانات العمل لحفز مباشرة للعصب بريسينابتيك المحطة الطرفية، ويمكن مقارنة النتائج مباشرة إلى فحوصات الكهربية كبيرة وظيفة13،14، 15، لكن يتطلب معدات متخصصة وتحديا تقنيا أكثر بكثير. ومع ظهور أوبتوجينيتيكس، استخدام تشانيلرهودوبسين الخلايا العصبية التحفيز على مزايا إضافية، بما في ذلك سيطرة الزمانية المكانية للتعبير قناة باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي20. هذا النهج هو من الناحية التقنية أسهل بكثير من التحفيز الكهربائي الشفط ويتطلب شيئا أكثر من مصدر ضوء LED رخيصة جداً. وهنا، نحن نوظف تصوير FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) بيريدينيوم dibromide) لكل مقارنة وهذه ثلاثة أساليب التحفيز المختلفة في المورفولوجية NMJ: عالية بسيطة [ك+ ]، تحدي النهج تشانيلرهودوبسين الكهربائية وجديدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك+] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.

ويبين الشكل 1 تدفق العمل لصبغ FM تعتمد على نشاط التصوير البروتوكول. التجربة يبدأ دائماً بتشريح الغراء اليرقات نفسها، بغض النظر عن أسلوب التحفيز المستخدمة في وقت لاحق. 1a الشكل تخطيطي ليرقة تشريح، عرض الحبل البطني العصب (فنك)، يشع الأعصاب ونم...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

التبعية للدولة التأثيرات على TMS : نظرة على سلوك الدافع وبصة

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

بعد المشبكي التسجيلات في وارد الاتصال الانشعابيات القوقعة خلايا الشعر الداخلية : رصد النسخة عديد الحويصلات في الشريط المشبك

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

التحقيق الخارجي على الحركة خلية الشعر مع مزيج من التحفيز الخارجي المتردد مجال كهربائي عالي السرعة وتحليل الصور

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

تقييم عصبي عضلي وظيفة عن طريق العصب عن طريق الجلد الكهربائية تحفيز

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

تحفيز المخ الكهربائي Transcranial في القوارض التنبيه

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

التحفيز المغناطيسي Transcranial مجتمعة والمخ من قشرة Dorsolateral Prefrontal

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...