Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikel. Dette arbejde blev støttet af NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 til D.L.K.

1. larve lim dissektion
<ol><li>Blandes grundigt 10 dele af silikoneelastomer base med 1 del af silikoneelastomer hærdning agent fra elastomer kit (Tabel af materialer).</li>
	<li>Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer og kur på en varm tallerken på 75 ˚C i flere timer (indtil ikke længere klæbrig at røre).</li>
	<li>Sted en enkelt elastomer-belagt glas coverslip ind i custom-made plexi glas dissektion salen (figur 1, bund) som forberedelse til larve dissekti...

Høj [K+] saltvand depolariserende stimulation er langt den letteste af de tre muligheder for aktivitet-afhængige FM farvestof cykling, men sandsynligvis den mindste fysiologiske29. Denne simple metode depolarizes alle tilgængelige celle i hele dyret, og så tillader ikke styret undersøgelser. Det kan være muligt at anvende lokalt høj [K+] saltvand med en mikropipette, men det vil stadig depolarisere pre/postsynaptiske celler og sandsynligvis synapse-associerede glia<sup...

Smukt karakteriseret Drosophila larve neuromuskulære junction (NMJ) glutamatergic synapse model er blevet brugt til at studere synapse dannelsen og funktionen med et stort spektrum af genetiske perturbationer1. Motor neuron terminal består af flere axon filialer, hver med mange udvidede synaptic boutons. Disse rummelige varicosities (op til 5 µm i diameter) indeholder alle neurotransmission maskiner, herunder ensartet glutamatergic synaptiske vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosole reserve og let frigøres swimmingpools2. Disse vesikler dock på de præsynaptiske plasmamembran fusion site aktive zoner (AZs), hvor exocytose medierer glutamat neurotransmitter frigivelse for trans-synaptic kommunikation. Efterfølgende, er SVs hentet fra plasma-membran via kys og Kør genanvendelse eller clathrin-medieret endocytose (CME) for gentagne exo/endocytose cyklusser. Drosophila NMJ er let tilgængelig og velegnet til både isolerer og karakteriserer SV cyklus mutanter. Brug fremad genetiske skærme, har roman mutationer ført til identifikation af nye gener kritisk for SV cyklus3. Desuden har omvendt genetiske tilgange starte med allerede kendte gener ført til udredning af nye SV cyklus mekanismer gennem en omhyggelig beskrivelse af mutant cykling fænotyper4. Drosophila NMJ er næsten ideel som en eksperimentel synaptic forberedelse til dissekere SV endocytose og exocytose mekanismer via metoder til optisk bane vesikel cykling under neurotransmission.
En vifte af fluorescerende markører tillader visuel sporing af vesikler cyklet dynamics, men den mest alsidige er FM dye analoger, som er først syntetiseret af Mao, F., mfl. 5. strukturelt, FM farvestoffer indeholder en hydrofil hoved og en lipofile hale forbundet gennem en aromatisk ring, med en central region giver spektrale egenskaber. Disse styryl farvestoffer partition reversibelt i membraner, ikke 'flip-flop' mellem membran foldere og så er aldrig fri i cytosol, og er langt mere fluorescerende i membraner end vand5. Vendbar indsættelse i en lipid tolagede forårsager en 40-fold stigning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassiske FM farvestof mærkning eksperimenter af badning i synaptic forberedelse med farvestof under depolariserende stimulation at indlæse farvestof via SV endocytose. Eksterne farvestof er derefter skyllet væk og SV cyklus er anholdt i en calcium-gratis ringetone løsning til billede indlæst synapser7. En anden runde af stimulation i et farvestof-gratis bad udløser FM udgivelse via exocytose, en proces, der kan efterfølges af måling fluorescens intensitet faldet. SV befolkninger fra en enkelt vesikel til puljer, der indeholder hundredvis af blærer kan være kvantitativt overvågede6,7. FM farvestoffer har været brugt til at dissekere aktivitet-afhængige mobilisering af funktionelt adskilte SV pools og sammenligne kys-og-Kør vs CME cykling8,9. Metoden er blevet ændret til separat assay fremkaldte, spontan og miniature synaptic cyklus aktiviteter (med meget følsomt udstyr til at detektere meget små fluorescens ændringer og reducere photobleaching)10. Assays kan udvides til at omfatte de ultrastrukturelle niveau af photoconverting de fluorescerende FM signal i en elektron-tætte etiket for transmissions Elektron Mikroskopi11,12,13,14 .
Historisk set, badning synaptic præparater i en høj koncentration af kalium (i det følgende benævnt "høj [K+]") har været den foretrukne metode for depolariserende stimulation for at fremkalde SV cykling; lige fra den frog kolinerge NMJ5, til kulturperler gnaver hjernen hippocampus neuroner15, Drosophila glutamatergic NMJ model16,17. Denne høje [K+] tilgang er simpelt, kræver ingen specialiseret udstyr, og er derfor tilgængelig for de fleste labs, men har begrænsninger for både program og data fortolkning. En langt mere fysiologisk passende metode er at bruge suge elektrode elektrisk stimulation af nerve4,5,12. Denne tilgang drev aktionspotentialet formering for direkte stimulering af den præsynaptiske nerve terminal, og resultaterne kan sammenlignes direkte med elektrofysiologiske assays neurotransmission funktion13,14, 15, men kræver specialudstyr og er teknisk meget mere udfordrende. Med fremkomsten af optogenetics har brug af channelrhodopsin neuronal stimulation yderligere fordele, herunder stramme spatiotemporelle kontrol af kanal udtryk ved hjælp af den binære Gal4/UAS system20. Denne tilgang er teknisk meget nemmere end at suge elektrode stimulation og kræver ikke andet end en meget billige LED lyskilde. Her, vi anvender billeddannelse af FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) til både at sammenligne og kontrast disse tre forskellige stimulation metoder på Drosophila NMJ: simple høj [K+ ], udfordrende elektriske og nye channelrhodopsin metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM farvestoffer anvendes til at studere den synaptiske vesikel (SV) cyklus. Disse amphipathic sonder har en hydrofil hoved og hydrofobe hale, hvilket gør dem vandopløselige med evnen til at reversibelt indtaste og afslutte membran lipid dobbeltlag. Disse styryl farvestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandigt medium, men indsættelse i den ydre folder af plasmamembran forårsager en > 40 X stigning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM farvestoffer internaliseret under SV endocytose, trafikerede både inden for og mellem SV pools og frigivet med SV exocytose, at levere et kraftfuldt værktøj til at visualisere præsynaptiske stadier af neurotransmission. En primær genetiske model af glutamatergic synapse udvikling og funktion er Drosophila neuromuskulære junction (NMJ), hvor FM farvestof imaging har været udbredt til at kvantificere SV dynamics i en bred vifte af mutant betingelser. NMJ synaptic terminal er let tilgængelige, med en smuk vifte af store synaptic boutons ideel til imaging applikationer. Her, vi sammenligner og kontrast de tre måder at stimulere Drosophila NMJ at drive aktivitet-afhængige FM1-43 farvestof optagelse/release: 1) bad anvendelsen af høj [K+] depolarisere neuromuskulære væv, 2) suge elektrode motoriske nerve stimulation til depolarisere den præsynaptiske nerve terminal, og 3) målrettet transgene udtryk af channelrhodopsin varianter for lys-stimuleret, fysisk kontrol af depolarisering. Hver af disse metoder har fordele og ulemper for studiet af genetiske mutation effekter på SV cyklus på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordele og ulemper ved at bistå udvalg af stimulation tilgang, sammen med de metoder, der er specifikke for hver strategi. Ud over fluorescerende imaging, kan FM farvestoffer være photoconverted til elektron-tætte signaler visualiseres ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM) for at studere SV cyklus mekanismer på ultrastrukturelle niveau. Vi levere sammenligninger af Konfokal og elektronmikroskopi imaging fra de forskellige metoder til Drosophila NMJ stimulation, til at hjælpe med at guide udvælgelse af fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Figur 1 viser arbejdsgangen for aktivitet-afhængige FM farvestoffet imaging protokol. Eksperimentet begynder altid med den samme larve lim dissektion, uanset metoden stimulation efterfølgende anvendes. Figur 1a er en skematisk af en dissekeret larve, der viser den ventrale nerve ledningen (VNC), udstrålende nerver og gentagne hemisegmental muskel mønster. VNC er fjernet og forberedelsen badet i en 4 µM løsning af FM1-43 (<s...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM farvestof cykling på Synapse: sammenligning af høje kalium depolarisering, elektriske og Channelrhodopsin Stimulation

Synaptic vesikel (SV) cykling er den centrale mekanisme for intercellulær kommunikation på neuronal synapser. FM farvestof optagelse og udgivelse er det primære middel til kvantitativt boltpistoler SV endo- og exocytose. Her, sammenligner vi alle stimulation metoderne til at drive FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulære junction (NMJ) model synapse.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Overvågning kløvet caspase-3 aktivitet og apoptose af udødeliggjort Oligodendroglial celler ved hjælp af Live-cell imaging og Cleaveable Fluorogenic-dye Substrater Efter Kalium-induceret membran depolarisering

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Vurdering af neuromuskulære funktion Brug Perkutan elektrisk nervestimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsafhængig stigning i netværksresponset til stimulering af neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transkranial elektriske Brain Stimulation i Alert gnavere

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkranial elektrisk Stimulation og Intracortical optagelse i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Kombinerede transkranial magnetisk Stimulation og electroencefalografi i den Dorsolateral præfrontale Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Billeddannelse af celle-specifikke Calcium signalerer på den tredelte Synapse mus membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...