Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Wij danken Broadie Lab leden voor bijdragen aan dit artikel. Dit werk werd gesteund door de NIH R01s MH096832 en MH084989 naar K.B., en NIH predoctoraal fellowship F31 MH111144 te D.L.K.

1. de larvale lijm dissectie
<ol><li>Grondig Meng 10 delen van silicone-elastomeer basis met 1 deel van silicone-elastomeer genezen van de agent uit de elastomeer kit (Tabel van materialen).</li>
	<li>22 x 22 mm glas coverslips met de elastomeer en genezen op een hete plaat op 75 ˚C jas voor enkele uren (tot niet meer plakkerig aanvoelt).</li>
	<li>Plaats een dekglaasje enkel elastomeer-gecoat glas aan in de op maat gemaakte plexi glas dissectie kamer (Figuur 1, beneden) ...

Hoge [K+] zoute depolarizing stimulatie is veruit de eenvoudigste van de drie opties voor activiteit-afhankelijke FM kleurstof fietsen, maar waarschijnlijk de minste fysiologische29. Deze eenvoudige methode depolarizes elke toegankelijk cel in het hele dier, en dus kan geen gerichte studies. Het mogelijk toe te passen lokaal hoog [K+] zoutoplossing met een micropipet, maar dit zal nog steeds depolarize pre/postsynaptisch cellen en waarschijnlijk synapse-geassocieerde glia<sup...

Het prachtig gekenmerkt Drosophila larvale motorische eindplaat (NMJ) glutamaterge synapse model is gebruikt synapse formatie en functie met een grote spectrum van genetische verstoringen1te gaan studeren. De motor neuron terminal bestaat uit meerdere takken van de axon, elk met vele uitgebreide synaptic los. Deze ruim varicosities (maximaal 5 µm in diameter) bevat alle van de transmissie-machine, met inbegrip van uniforme glutamaterge synaptische vesikels (SVs; ~ 40 nm diameter) in cytosolische reserve en gemakkelijk-vrij te geven zwembaden2. Deze blaasjes op het basisstation op de presynaptische plasmamembraan fusion site actieve zones (AZs), waar exocytose de glutamaat neurotransmitter release voor trans bemiddelt-synaptic communicatie. Vervolgens worden de SVs opgehaald uit het plasma-membraan via kus-en-run-recycling- of clathrin-gemedieerde endocytose (CME) voor herhaalde exo/endocytose cycli. De Drosophila NMJ is gemakkelijk toegankelijk en geschikt voor zowel isoleren en karakteriseren van SV cyclus mutanten. Met behulp van voorwaartse genetische schermen, hebben nieuwe mutaties geleid tot de identificatie van nieuwe genen kritisch voor de SV cyclus3. Bovendien, omgekeerde genetische benaderingen, beginnend met de reeds bekende genen hebben geleid tot de opheldering van nieuwe mechanismen van de cyclus van de SV door de zorgvuldige beschrijving van mutant fenotypen4fietsen. De Drosophila NMJ is bijna ideaal als een experimentele synaptic voorbereiding voor het ontleden van SV endocytose exocytose HORLOGEMECHANISMES via methoden om optisch track vesikel fietsen tijdens transmissie.
Een waaier van fluorescente markeringen visuele tracking van blaasjes tijdens het fietsen van dynamiek, maar de meest veelzijdige zijn FM kleurstof analogen die is voor het eerst gesynthetiseerd door Mao, F., et al.. 5. structureel, FM kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een lipofiele staart verbonden via een aromatische ring, met een centrale regio spectrale eigenschappen toekennen. Deze styryl kleurstoffen partitioneren omkeerbaar in membranen, niet 'flip-flop' tussen membraan folders en dus nooit zijn vrij in het cytosol en zijn veel meer tl in membranen dan water5. Omkeerbare inbrengen in een lipide dubbelgelaagde veroorzaakt een verhoging van de 40-fold in fluorescentie6. Bij neuronale synapsen bestaan klassieke FM kleurstof labeling experimenten uit Baden van de synaptische voorbereiding met de kleurstof tijdens depolarizing stimulatie te laden kleurstof via SV endocytose. Externe kleurstof wordt dan gewassen weg en de SV-cyclus wordt gearresteerd in een calcium-vrije ringer-oplossing om het imago van de geladen synapsen7. Een tweede ronde van stimulatie in een bad met kleurstof-vrije triggers FM release via exocytose, een proces dat kan worden gevolgd door het meten van de daling van de intensiteit van de fluorescentie. SV populaties van een enkele blaasje tot zwembaden met honderden blaasjes kunnen kwantitatief gecontroleerde6,7. FM kleurstoffen zijn gebruikt om te ontleden activiteit-afhankelijke mobilisatie van functioneel verschillende SV zwembaden, en te vergelijken kus-en-run vs. CME fietsen8,9. De methode is aangepast om afzonderlijk assay opgeroepen, spontane en miniatuur synaptic cyclus activiteiten (met uiterst gevoelige apparatuur op te sporen van zeer kleine fluorescentie wijzigingen en verminderen photobleaching)10. Testen kunnen worden uitgebreid tot de ultrastructureel niveau door photoconverting de fluorescerende FM-signaal in een elektron-dichte label voor Transmissie Electronenmicroscopie11,12,13,14 .
Historisch, de synaptische preparaten zwemmen in een hoog gehalte aan kalium (hierna te noemen "hoge [K+]") is de methode van keuze voor depolarizing stimulatie om te induceren SV fietsen; de kikker cholinerge NMJ5, variërend tot gekweekt knaagdier hersenen hippocampal neuronen15, de Drosophila glutamaterge NMJ model16,17. Deze hoge [K+] aanpak is eenvoudig, vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en daarom de meeste labs toegankelijk is, maar heeft beperkingen voor zowel de toepassing en de interpretatie van de gegevens. Een veel meer fysiologisch geschikte methode is het gebruik van zuiging elektrode elektrische stimulatie van de nervus4,5,12. Deze aanpak drijft actiepotentiaal vermeerdering voor directe stimulatie van de presynaptische zenuw terminal, en resultaten kunnen direct worden vergeleken met elektrofysiologische testen van transmissie functie13,14, 15, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en is technisch veel moeilijker. Met de komst van optogenetics heeft het gebruik van neuronale stimulatie van de channelrhodopsin extra voordelen, met inbegrip van strakke Spatio controle van kanaal expressie met behulp van de binaire Gal4/UAS systeem20. Deze aanpak is technisch veel gemakkelijker dan zuig elektrode stimulatie en vereist niets meer dan een zeer goedkope LED lichtbron. Hier, gebruiken we beeldvorming van FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) tot en met zowel vergelijken en het contrast van deze drie methoden van de verschillende stimulatie bij de Drosophila NMJ: eenvoudige hoge [K+ ], uitdagende channelrhodopsin van elektrische en nieuwe benaderingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM kleurstoffen worden gebruikt voor het bestuderen van de synaptische Vesikel (SV) cyclus. Deze amphipathic sondes hebben een hydrofiele kop en hydrofobe staart, waardoor ze wateroplosbaar met de mogelijkheid om omkeerbaar betreden en verlaten van membraan lipide bilayers. Deze styryl-kleurstoffen zijn relatief niet-belichting fluorescerende in waterig medium, maar de invoeging in het buitenste van de bijsluiter van het plasma-membraan veroorzaakt een > 40 X verhoging van fluorescentie. In neuronale synapsen, zijn FM kleurstoffen geïnternaliseerd tijdens SV endocytose, verhandelde zowel binnen als tussen SV zwembaden en vrijgegeven met SV exocytose, bieden een krachtig hulpmiddel om te visualiseren presynaptische stadia van transmissie. Een primaire genetische model van glutamaterge synapse ontwikkeling en functie is de Drosophila motorische eindplaat (NMJ), waar FM kleurstof imaging is gebruikt uitgebreid te kwantificeren SV dynamiek in een brede waaier van mutant voorwaarden. De NMJ synaptic terminal is gemakkelijk bereikbaar, met een prachtig scala aan grote synaptic los ideaal voor beeldtoepassingen. Hier, wij vergelijken en het contrast van de drie manieren om te stimuleren de Drosophila NMJ rijden activiteit-afhankelijke FM1-43 kleurstof opname/release: 1) bad toepassing van hoge [K+] 2) zuignap elektrode motorische zenuw te depolarize neuromusculaire weefsels stimulatie om te depolarize van de presynaptische zenuw terminal, en 3) gericht transgene expressie van channelrhodopsin varianten voor licht-gestimuleerd, ruimtelijke controle van depolarisatie. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen voor de studie van genetische mutatie gevolgen op de SV-cyclus op de Drosophila NMJ. We zullen bespreken deze voor- en nadelen bij de selectie van de stimulatie aanpak, samen met de methoden die specifiek zijn voor elke strategie. Naast fluorescerende imaging kunnen FM kleurstoffen photoconverted aan elektron-dichte signalen gevisualiseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om te studeren van SV cyclus mechanismen op ultrastructureel niveau. Wij bieden de vergelijkingen van confocale en elektronenmicroscopie beeldvorming van de verschillende methoden van Drosophila NMJ stimulatie, om te helpen guide de selectie van toekomstige experimentele paradigma's.

Figuur 1 toont de werk-stroom voor de activiteit-afhankelijke FM kleurstof imaging protocol. Het experiment begint altijd met de zelfde larvale lijm dissectie, ongeacht de methode van de stimulatie vervolgens gebruikt. Figuur 1a is een schematische voorstelling van een ontleed larve, toont het ventrale zenuw snoer (VNC), zenuwen en herhaalde hemisegmental spier patroon te stralen. De VNC wordt verwijderd en de voorbereiding baden...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

State-Dependency Effecten op de TMS: Een blik op Motive Phosphene Gedrag

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Onderzoeken van buitenste haarcel beweeglijkheid met een combinatie van externe Alternating elektrisch veld Stimulatie en High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Bepaling van neuromusculaire functie gebruiken percutane elektrische zenuwstimulatie

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcraniële elektrische hersenstimulatie bij Alert knaagdieren

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Gecombineerde Transcraniële magnetische stimulatie en elektro-encefalografie van de Dorsolateral van de prefrontale Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...