Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

אנו מודים Broadie מעבדה חברים לתרומות למאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01s MH096832 ו- MH084989 כדי. תן לי לראות, ואחווה NIH predoctoral F31 MH111144 כדי D.L.K.

1. זחל דבק לנתיחה
<ol><li>ביסודיות מערבבים 10 חלקים elastomer סיליקון הבסיס עם חלק 1 של סיליקון elastomer אשפרה הסוכן הערכה אלסטומר (טבלה של חומרים).</li>
	<li>מעיל coverslips זכוכית דקה 22 x 22 מ מ עם elastomer, התרופה על פלטה חמה ב- 75 הלעפה תרוטרפמט למשך מספר שעות (עד כבר לא דביק למגע).</li>
	<li>הצב coverslip זכוכית מצופי?...

גירוי גבוה [K+] מלוחים depolarizing הוא והכי מתוך שלושת האפשרויות עבור צבע FM תלויי-פעילות רכיבה על אופניים, אבל סביר להניח פיזיולוגיים לפחות29. שיטה פשוטה זו depolarizes כל תא נגיש החיה כולו, אז אינו מאפשר לימודים מכוונת. ייתכן ניתן להחיל באופן מקומי גבוה תמיסת מלח [K+] עם micropipette, א...

מאופיין להפליא דרוזופילה צומת עצב-שריר זחל (NMJ) glutamatergic סינפסה הדגם שימש ללמוד סינפסה היווצרות ותפקוד עם מגוון עצום של לפליטת גנטי1. הטרמינל מוטור נוירון מורכב רב ענפים האקסון, כל אחד עם העיתון ons מוגדלת סינפטיים רבים. אלה varicosities מרווח (עד 5 מיקרומטר בקוטר) לכלול את כל המנגנון עצבית, כולל הסינפטיות glutamatergic אחיד (SVs; ~ 40 ננומטר בקוטר) שמורת cytosolic ובריכות בקלות releasable2. שלפוחית אלה עוגנות קרום פלזמה presynaptic פיוז'ן אתר פעיל אזורי (AZs), שבו אקסוציטוזה שמתווכת שחרור נוירוטרנסמיטר גלוטמט עבור טרנס-סינפטית תקשורת. לאחר מכן, SVs מאוחזרות של קרום פלזמה דרך נשיקה-וברח מיחזור או בתיווך clathrin אנדוציטוזה (CME) מחזורים חוזרים ונשנים exo/אנדוציטוזה. דרוזופילה NMJ ונגיש בקלות מתאים היטב הן בידוד ואפיון מוטנטים מחזור SV. באמצעות מסכי גנטי קדימה, מוטציות הרומן הובילו זיהוי גנים חדשים קריטיים עבור מחזור SV3. יתר על כן, הפוך גישות גנטיות מתחיל עם הגנים ידוע כבר הובילו הבהרה של מנגנוני מחזור SV חדשים דרך התיאור זהיר של מוטציה רכיבה על אופניים פנוטיפים4. דרוזופילה NMJ אידיאלי כמעט כהכנה סינפטית ניסיוני ניקוד אנדוציטוזה SV מנגנונים אקסוציטוזה באמצעות שיטות שטיחות שלפוחית מסלול רכיבה על אופניים במהלך עצבית.
מגוון של סמנים פלורסנט לאפשר מעקב ויזואלי של שלפוחית במהלך רכיבה על אופניים dynamics, אבל הרב-גוניים ביותר הם תחליפי לצבוע FM אשר הוא קודם מסונתז על ידי מאו,. פ, ואח. 5. מבחינה מבנית, FM צבעים מכילים הידרופילית ראש וזנב lipophilic מחובר באמצעות טבעת ארומטית, עם אזור מרכזי היוועצות ספקטראליות. אלה styryl צבעי למחיצות הפיכה של ממברנות, לא 'משתנים' בין קרום פליירים, וכך גם אף פעם לא להכניס ציטוזול, ויש הרבה יותר פלורסנט בתוך ממברנות יותר מים5. הכניסה הפיך לתוך ליפידית גורמת עלייה 40-fold קרינה פלואורסצנטית6. ב הסינפסות עצביים, ניסויים תיוג לצבוע FM קלאסי מורכב רחצה ההכנה סינפטית עם לצבוע במהלך depolarizing גירוי לטעון לצבוע באמצעות SV אנדוציטוזה. צבע חיצוני ואז נשטף הרחק, מחזור SV נעצר בפתרון צלצול נטולת סידן לשיקוף הסינפסות טעון7. סיבוב שני של גירוי באמבט ללא צבע מעורר שחרור FM דרך אקסוציטוזה, תהליך זה יכול להיות מלווה מדידה הירידה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. אוכלוסיות SV מן שלפוחית יחיד אל בריכות המכיל מאות שלפוחית יכול להיות מנוטרים באופן כמותי6,7. צבעי FM שימשו לנתח תלויי-פעילות גיוס של בריכות SV נפרדים פונקציונלית, והשווה נשיקה-וברח לעומת CME רכיבה8,9. השיטה שונתה כדי בנפרד assay עורר, ספונטנית, זעיר סינפטית מחזור פעילות (עם ציוד רגישה מאוד לזהות שינויים קטנים מאוד פלורסצנטיות ולהפחית את photobleaching)10. מבחני ניתן להרחיב את רמת ultrastructural על ידי photoconverting האות FM פלורסנט לתוך תווית צפיפות אלקטרונים עבור שידור מיקרוסקופ אלקטרונים11,12,13,14 .
מבחינה היסטורית, רחצה ההכנות סינפטית בריכוז גבוה של אשלגן (ןלהל "גבוהה [K+]") הייתה השיטה של בחירה עבור depolarizing גירוי לזירוז SV רכיבה על אופניים; החל הצפרדע שימוש NMJ5, מחונן המוח מכרסמים נוירונים בהיפוקמפוס15, דרוזופילה glutamatergic NMJ דגם16,17 הגישה [K+] גבוהה זו היא פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד, ולא נגיש ולכן רוב מעבדות, אבל יש מגבלות עבור היישום והן פרשנות הנתונים. שיטה המתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית היא להשתמש אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי של עצב4,5,12. גישה זו נוהג פוטנציאל הפעולה הפצת לגירוי ישיר של העצב presynaptic מסוף, ואת התוצאות ניתן להשוות ישירות אל מבחני אלקטרופיזיולוגיות עצבית פונקציה13,14, 15, אבל דורש ציוד מיוחד, היא טכנית הרבה יותר מאתגר. עם כניסתו של optogenetics, השימוש של גירויים עצביים channelrhodopsin יש יתרונות נוספים, כולל שליטה הדוקה ייתכן ערוץ ביטוי באמצעות מערכת Gal4/UAS בינארי20. גישה זו טכנית הרבה יותר קל מאשר שאיבה אלקטרודה לגירוי ואינו דורש לא יותר מאשר מקור אור LED זול מאוד. כאן, אנו מעסיקים הדמיה של FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) לעשות הן השוואות אלה שלוש שיטות שונות גירוי- דרוזופילה NMJ: high פשוטים [K+ ], מאתגר גישות channelrhodopsin חשמל וחדשים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM צבעים משמשים כדי ללמוד את מחזור שלפוחית סינפטית (SV). הגששים amphipathic אלה יש הידרופילית בראש וזנב הידרופובי, הפיכתם מסיסים במים עם היכולת להיכנס ולצאת ממברנה השומנים bilayers הפיכה. צבעי styryl אלה הם יחסית ללא-פלורסנט במדיום מימית, אבל הכניסה לתוך העלעל החיצוני של קרום פלזמה גורם > 40 X לודיג זריחה. ב הסינפסות עצביים, צבעי FM הם הפנימו במהלך SV אנדוציטוזה, אקסוציטוזה SV הנסחרות הן בתוך והן בין בריכות SV, ואשר פורסמו עם, מתן כלי רב עוצמה כדי להמחיש presynaptic שלבי עצבית. מודל גנטי העיקרי של glutamatergic סינפסה התפתחות ותפקוד היא דרוזופילה צומת עצב-שריר (NMJ), איפה FM לצבוע הדמיה שימש בהרחבה לכמת SV dynamics במגוון רחב של תנאים מוטציה. הטרמינל סינפטית NMJ הינו נגיש בקלות, עם מגוון יפה של גדול סינפטית עם העיתון ons אידיאלי עבור הדמיה יישומים. כאן, אנו משווים חדות משלוש דרכים לעורר את דרוזופילה NMJ לנהוג תלויי-פעילות FM1-43 צבע ספיגת/שחרור...: אמבט 1) יישום של גבוהה [K+] depolarize רקמות עצב-שריר, 2) יניקה עצבים מוטוריים אלקטרודה גירוי depolarize העצב presynaptic מסוף, ו 3) לפלח הטרנסגניים ביטוי של משתנים channelrhodopsin עבור שליטה גירוי האור, המרחבי של דפולריזציה. כל השיטות האלה יש יתרונות וחסרונות לחקר השפעות מוטציה גנטית על מחזור SV- דרוזופילה NMJ. נדון אלה יתרונות וחסרונות לסייע הבחירה של הגישה גירוי, יחד עם מתודולוגיות ספציפיות לכל אסטרטגיה. בנוסף הדמיה פלורסנט, FM צבע יכול להיות photoconverted לאותות צפיפות אלקטרונים visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM) ללמוד SV מנגנונים מחזור ברמה ultrastructural. אנו מספקים את ההשוואות של קונאפוקלית ואלקטרון הדמיה של השיטות השונות של גירוי דרוזופילה NMJ, כמדריך הבחירה של פרדיגמות ניסיוני בעתיד.

איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור פעילות תלוית FM לצבוע הדמיה פרוטוקול. הניסוי מתחיל תמיד עם הקרע דבק זחל זהה, ללא קשר גירוי לשיטת לאחר מכן. איור 1a הוא תיאור סכמטי של זחל גזור, מציג את חוט עצבי הגחון (VNC), מקרין העצבים ותבנית שריר hemisegmental חוזרות ו...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

המדינה תלות השפעות על TMS: מבט על התנהגות Phosphene מניע

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

הערכה של תפקוד העצבי באמצעות גירוי עצבי חשמלי Percutaneous

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

טראנס גירוי חשמלי מוחי בחולדות התראה

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

גירוי מגנטי טראנס המשולבת ואת אלקטרואנצפלוגרם של קליפת המוח הקדם חזיתית דורסולטרלי

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...