Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

この記事への貢献のための Broadie の研究室のメンバーに感謝いたします。この作品は NIH の R01s MH096832 と MH084989 へ有限会社ケイビー、によって支持されたと D.L.K. に NIH を経て交わり F31 MH111144

1. 幼虫の接着剤剥離
<ol><li>10 部 1 部硬化エラストマー キット (材料表) から剤シリコーン ・ エラストマーをベース シリコーン ・ エラストマーを徹底的に混ぜます。</li>
	<li>(もはやべたべたする) まで数時間 22 x 22 mm ガラス coverslips エラストマーと 75 ° C のホット プレートに治療をコートします。</li>
	<li>幼虫の解剖のための準備にカスタムメイドのプレキシ ガラス解剖室 (<st...

高 [K+] 生理食塩水脱分極刺激は、サイクリング、活動依存した FM 色素が可能性が高い少なくとも生理的29の 3 つのオプション、はるかに簡単です。この簡単な方法は、全体の動物のすべてのアクセス可能なセルを脱分極し、監督の研究を許可しませんので。ローカル高 [K+] 生食、マイクロ ピペットに適用することがありますが、これはまだ前/後シナプス細?...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動1の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール2。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル3の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型4をサイクリングの注意説明を通じて新しい SV 循環メカニズムの解明につながっています。ショウジョウバエNMJ はほぼ光学トラック小胞神経伝達中にサイクリングするメソッドを介して SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスのメカニズムを解剖するための実験的シナプス準備として最適です。
蛍光マーカーの範囲ことが力学をサイクリング中に小胞の視覚追跡ですが最も汎用性の高い FM 色素類縁体を f.、真央らによって初めて合成されました。5. 構造上、FM 染料を含む水性頭とつながっている芳香環、中部のスペクトル特性を付与と脂溶性尾。これらのスチリル色素膜で可逆的にパーティションはない 'フリップフ ロップ' 膜リーフレットの間、ですから、無料、細胞質で、水5よりもはるかに多く蛍光膜です。脂質二分子膜へのリバーシブルの挿入は、蛍光640 増加を引き起こします。神経シナプスで古典的な FM 色素標識実験 SV エンドサイトーシスを介して色素をロードする刺激を脱分極中に染付シナプス準備を入浴で構成されます。外部の色素は離れて洗浄し、SV サイクルは読み込まれたシナプス7をイメージさせるカルシウム無料リンゲル液で逮捕されました。色素フリー バースの刺激の第 2 ラウンドは、エキソサイトーシス、蛍光強度の減少を測定することによって続くことができるプロセスを介して FM リリースをトリガーします。小胞の数百を含むプールを単一の小胞から SV 集団は、定量的に監視対象6,7をすることができます。FM 染料は、機能的に異なる SV プールの活動依存的動員を解剖して CME サイクリング8,9対キス-実行を比較するために使用されています。メソッドは、アッセイ別の誘発、自発的なミニチュアのシナプス サイクル活動 (非常に小さい蛍光変化を検出し、退色を低減する高感度の機器) を10に変更されています。試金によって拡張できます微細構造のレベルに photoconverting 蛍光 FM 信号伝達電子顕微鏡11,12,13,14 の電子密度の高いラベルに.
歴史的には、高濃度カリウム (以下「高 [K+]」という) の入浴シナプス準備サイクリング; SV を誘発する刺激を脱分極の選択の方法をされているカエル コリン作動性 NMJ5からまでは、げっ歯類脳海馬ニューロン15、ショウジョウバエグルタミン酸 NMJ モデル16,17に培養。この高 [K+] アプローチは簡単です、特殊な装置を必要としないとほとんどのラボにアクセスできます制限がありますアプリケーションのデータの解釈。神経4,5,12吸引電極電気刺激を使用する大いにもっと生理学的に適切な方法です。このアプローチはシナプス前神経直接刺激の活動電位伝搬をターミナル、ドライブおよび伝達関数13,14、電気生理学的アッセイに結果を直接比較すること 15、しかし特殊な装置を必要として技術的にはるかに困難です。チャネルロドプシン神経刺激の使用は、光遺伝学の出現により、バイナリ Gal4/UAS システム20を使用して、チャンネル式のタイトな時空間制御を含むその他の利点することができます。この方法は技術的に吸引電極刺激よりもはるかに簡単です、何も非常に安い LED 光源以上が必要です。ここでは、我々 は FM1 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) ピリジニウム臭化) をして両方比較してショウジョウバエNMJ でこれらの 3 つの異なる刺激の方法の画像を採用して: 単純な高 [K+]、電気と新しいチャネルロドプシンのアプローチに挑戦します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM 染料は、シナプス小胞 (SV) サイクルの研究に使用されます。これらの両親媒性プローブには、親水性の頭部と疎水性尾、水溶性膜脂質二重層を可逆的に出入りする能力を持つことがあります。これらのスチリル色素が比較的非水溶液中で蛍光性が細胞膜の外側のリーフレットに挿入、> 40 X 蛍光の増加します。神経シナプスにおける FM 染料は SV エンドサイトーシス、神経伝達のシナプス前の段階を可視化する強力なツールを提供する、内および SV プール間の人身売買とのリリースの SV エキソサイトーシスの中に内面化します。グルタミン酸作動性シナプスの開発と機能の主な遺伝モデルはショウジョウバエ変異条件の広い範囲で SV のダイナ ミックスを定量化する神経筋接合部 (NMJ) は、FM がイメージングを色素が広く使用されています。NMJ シナプス ターミナルは大きなシナプス ボタン イメージング アプリケーションに最適の美しい配列と、簡単にアクセスできます。ここで、我々 は比較対照ショウジョウバエ活動依存した FM1 43 色素取り込み/リリースを駆動する NMJ を刺激する 3 つの方法: 高 [K+] 神経筋組織を脱分極作用、2) 吸引電極運動神経の 1) お風呂のアプリケーションシナプス前の神経ターミナルと 3 を脱分極刺激) は、チャネルロドプシン亜種脱分極の光刺激、空間の制御のための遺伝子組換え発現を対象しました。これらの各メソッドは、利点と欠点 SV サイクルの遺伝の突然変異の効果に関する研究のショウジョウバエNMJ。これらの長所と短所それぞれの戦略に固有の方法論とともに、刺激アプローチの選択を支援するために説明します。蛍光イメージングに加え FM 染料は超微細構造レベルで SV 循環メカニズムを研究する透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて可視化する電子密度の高い信号に photoconverted をすることができます。我々 は、共焦点の比較を提供および電子顕微鏡イメージングショウジョウバエNMJ 刺激、支援するためのさまざまな方法から将来の実験的パラダイムの選択。

図 1は、活動依存した FM 染料のプロトコルをイメージングのための作業フローを示します。実験は、その後使用される刺激方法に関係なく、同じ幼虫接着剤郭常に始まります。図 1 aは、神経と繰り返し hemisegmental 筋パターンを放射腹側神経索 (VNC) を示す切り裂かれた幼虫の模式図です。VNC は削除され準備を浴びて FM1 43 (<...

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FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) モデルのシナプスでサイクリングを駆動するためのすべての刺激方法を比較します。

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

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