Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellesskap F31 MH111144 til D.L.K.

1. larver lim disseksjon
<ol><li>Grundig blande 10 deler av silikon-elastomer base med 1 del av silikon-elastomer herding agent fra elastomer kit (Tabell for materiale).</li>
	<li>Coat 22 x 22 mm glass coverslips med elastomer og kur på en varm plate på 75 grader i flere timer (inntil lenger klissete å ta).</li>
	<li>Plassere en enkelt elastomer-belagt glass dekkglassvæske i skreddersydde plexi glass disseksjon kammeret (figur 1, nederst) i forberedelse til larver diss...

Høy [K+] saltvann depolarizing stimulering er den enkleste av de tre alternativene for aktivitet-avhengige FM fargestoff sykling, men sannsynligvis den minste fysiologiske29. Denne enkle metoden depolarizes hver tilgjengelig celle i hele dyret, og så tillater ikke rettet studier. Det kan være mulig å bruke lokalt høy [K+] saline brønnene med, men dette vil fortsatt depolarize pre/postsynaptic celler og sannsynlig synapse-assosiert glia1. Et annet...

Vakkert preget Drosophila larver nevromuskulær krysset (NMJ) glutamatergic synapse modellen er brukt til å studere synapse dannelse og fungere med et stort spekter av genetisk forstyrrelser1. Motor neuron terminalen består av flere axon avdelinger, hver med mange forstørret synaptic boutons. Disse capacious varicosities (opptil 5 µm i diameter) inneholder alle neurotransmission maskiner, inkludert uniform glutamatergic synaptic blemmer (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosolic reserve og lett releasable bassenger2. Disse vesikler dock på de presynaptic plasma membranen fusion aktive områdene (AZs), der exocytosis formidler glutamat nevrotransmitter utgivelsen for trans-synaptic kommunikasjon. Senere, hentes SVs fra plasma membranen via kyss-and-run resirkulering eller clathrin-mediert endocytose (CME) for gjentatte exo/endocytose sykluser. Drosophila NMJ er lett tilgjengelig og godt egnet for både isolere og karakterisere SV syklus mutanter. Bruke frem genetisk skjermer, har romanen mutasjoner ført til identifisering av nye gener kritisk for SV syklus3. Videre har omvendt genetisk tilnærminger starter med allerede kjent gener ført til utviklingen av nye SV syklus mekanismer gjennom forsiktig beskrivelse av mutant sykling fenotyper4. Drosophila NMJ er nesten perfekt som en eksperimentell synaptic forberedelse for dissekere SV endocytose og exocytosis mekanismer via metoder å optisk spor vesicle Sykling under neurotransmission.
En rekke fluorescerende markører tillate visuell sporing av blemmer under sykling dynamics, men den mest allsidige er FM fargestoff analogs som er først syntetisert av Mao, F., et al. 5. strukturelt, FM fargestoffer inneholder en hydrofile hode og en lipofile hale knyttet gjennom en aromatiske ringen, et sentralt område overdragelse spektrale egenskapene. Disse styryl fargestoffer partisjonere reversibel i membraner, ikke 'flip-flop' mellom membran brosjyrer og så er aldri gratis i stoffer, og er langt mer fluorescerende i membraner vann5. Reversibel innsetting en lipid bilayer forårsaker en 40-fold økning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassisk FM fargestoff merking eksperimenter av bading synaptic utarbeidelse med fargestoff under depolarizing stimulering laste fargestoff via SV endocytose. Eksterne fargestoff deretter vasket bort og SV syklusen er arrestert i en kalsium-gratis ringe løsning å image lastet synapser7. En ny runde med stimulering i en dye-fri bad utløser FM utgivelse gjennom exocytosis, en prosess som kan følges ved å måle fluorescens intensitet reduksjon. SV bestander fra en enkelt vesicle å bassenger som inneholder hundrevis av blemmer kan være kvantitativt overvåkede6,7. FM fargestoffer har blitt brukt til å dissekere aktivitet-avhengige mobilisering av funksjonelt forskjellige SV bassenger og sammenligne kyss-and-run vs CME sykling8,9. Metoden er endret til separat analysen fremkalt, spontane og miniatyr synaptic syklus aktiviteter (med svært følsom utstyr å oppdage svært liten fluorescens endringer og redusere photobleaching)10. Analyser kan utvides til ultrastructural nivå ved photoconverting fluorescerende FM signalet til et elektron-tette etikett for overføring elektronmikroskop11,12,13,14 .
Historisk bading synaptic forberedelser i en høy konsentrasjon av kalium (heretter referert til som "high [K+]") har vært metoden for valg for depolarizing stimulering å indusere SV syklingen. mellom frosk cholinergic NMJ5, kultivert gnager hjernen hippocampus neurons15 Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denne høy [K+] tilnærmingen er enkel, krever ingen spesialisert utstyr, og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier, men har begrensninger for både programmer og data tolkning. En mye mer fysiologisk metoden er å bruke sugekraft elektrode elektrisk stimulering av nerve4,5,12. Denne tilnærmingen kjører handlingen potensial overføring for direkte stimulering av presynaptic nerve terminal, og resultatene kan være direkte forhold til elektrofysiologiske analyser av neurotransmission funksjonen13,14, 15, men krever spesialisert utstyr og er teknisk mye mer utfordrende. Bruk av optogenetics har bruk av channelrhodopsin nevrale stimulering flere fordeler, inkludert tett spatiotemporal kontroll over kanalen uttrykk med de binære Gal4/UAS system20. Denne tilnærmingen er teknisk mye lettere enn sugekraft elektrode stimulering og krever ikke annet enn en veldig billig LED-lyskilde. Her, brukes avbilding av FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) å både sammenligne metodene for tre ulike stimulering i Drosophila NMJ: enkel høy [K+ ], utfordrende elektriske og nye channelrhodopsin tilnærminger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM fargestoffer brukes til å studere synaptic vesicle (SV) syklusen. Disse amphipathic sonder har et hydrofile hode og hydrofobe hale, noe som gjør dem vannløselige med reversibel angi og avslutte membran lipid bilayers. Disse styryl fargestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandig medium, men innsetting ytre heftet av plasma membranen forårsaker en > 40 X økning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM fargestoffer internalisert under SV endocytose, trafikkert både innenfor og mellom SV bassenger, og befridd med SV exocytosis, gir et kraftig verktøy for å visualisere presynaptic stadier av neurotransmission. En primær genetisk modell av glutamatergic synapse utvikling og funksjon er Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ), der FM fargestoff bildebehandling har vært brukt mye å kvantifisere SV dynamikken i en rekke mutant forhold. NMJ synaptic terminalen er lett tilgjengelig, med en vakker rekke store synaptic boutons ideelt for bildebehandlingsprogrammer. Her vi sammenligne og kontrast på tre måter å stimulere Drosophila NMJ å kjøre aktivitet-avhengige FM1-43 fargestoff opptak/release: 1) bad anvendelse av høy [K+] depolarize nevromuskulær vev, 2) enkel sugeevnen elektrode motor nerve stimulans til depolarize presynaptic nerve terminal, og 3) målrettet transgene uttrykk for channelrhodopsin varianter for lys-stimulert, romlig kontroll av depolarization. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper for studier av genetisk mutasjon effekter på SV syklusen på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordeler og ulemper å hjelpe valg av stimulering tilnærming, sammen med metodikkene som er spesifikke for hver strategi. I tillegg til fluorescerende bildebehandling kan FM fargestoffer photoconverted til elektron-tette signaler visualisert bruker overføring elektronmikroskop (TEM) for å studere SV syklus mekanismer på et ultrastructural nivå. Vi tilbyr sammenligninger av AC confocal og elektronmikroskop imaging fra ulike metoder for Drosophila NMJ stimulering, å hjelpe valg av fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Figur 1 viser arbeidsflyten for aktivitet-avhengige FM fargestoff imaging protokollen. Eksperimentet begynner alltid med samme larver lim dissection, uansett stimulering senere. Figur 1a er en skjematisk av en dissekert larve, viser ventrale nervesystemet (VNC), utstråler nerver og gjentatte hemisegmental muskel mønster. VNC fjernes og utarbeidelse badet i en 4 µM løsning av FM1-43 (figur 1b, ros...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM fargestoff sykling Synapse: sammenligne høyt kalium Depolarization, elektrisk og Channelrhodopsin stimulering

Synaptiske vesicle (SV) sykling er kjernen mekanisme intercellulære kommunikasjon på neuronal synapser. FM fargestoff opptak og utgivelsen er hovedmåten å kvantitativt assaying SV endo- og exocytosis. Her sammenligne vi alle stimulering metoder for å drive FM1-43 sykling Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) modell synapse.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Overvåking kløyvde caspase-3 Aktivitet og Apoptose av udødeliggjort Oligodendroglial Cells bruker Live-cell Imaging og Cleaveable Fluorogenic-dye Underlag Etter Kalium-indusert Membrane depolarisering

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Vurdering av nevromuskulær funksjon Bruke Percutaneous elektrisk nervestimulering

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transkraniell elektrisk hjernen stimulering i Alert gnagere

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk Transkraniell elektrisk stimulering og Intracortical opptak i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Kombinert Transkraniell magnetisk stimulering og Elektroencefalogram på Dorsolateral Prefrontal cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Bilde av celle-spesifikke kalsium signalisering på tre Synapse av musen membranen

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...