Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Agradecemos Membros Broadie laboratório para contribuições para este artigo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01s MH096832 e MH084989 para K.B. e NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 para D.L.K.

1. larval cola dissecação
<ol><li>Misture bem 10 partes de elastómero de silicone base com 1 parte de elastômero de silicone, agente do kit de elastômero (Tabela de materiais) de cura.</li>
	<li>Revestir as lamelas de vidro de 22 x 22 mm com o elastômero e cura em um prato quente em 75 ˚ c durante várias horas (até já não pegajoso ao toque).</li>
	<li>Coloque uma lamela de vidro revestido de elastômero único na câmara de dissecação de vidro plexi sob medida (Figura ...

Estímulo despolarizante salino de alta [K+] é de longe a mais simples das três opções para tintura de FM de atividade-dependente ciclismo, mas provavelmente o menos fisiológicas29. Este método simples depolarizes cada célula acessível em todo animal e assim não permite estudos direcionados. Pode ser possível aplicar localmente alta [K+] soro fisiológico com uma micropipeta, mas isto ainda vai despolarizar células pré/pós-sináptica e provável glia sinapse-asso...

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas1. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas2. Essas vesículas ancorar na membrana pré-sináptica de plasma fusão local ativo zonas (AZs), onde a exocitose Medeia a liberação do neurotransmissor glutamato para trans-comunicação sináptica. Posteriormente, as SVs são recuperadas da membrana plasmática através do beijo e executar reciclagem ou endocitose mediada por Clatrina (CME) por ciclos repetidos de exo/endocitose. A Drosophila Nicotínico é facilmente acessível e adequado para isolar e caracterizar os mutantes de ciclo SV. Usando telas de genéticas para a frente, mutações romance conduziram à identificação de novos genes críticos para o ciclo SV3. Além disso, abordagens de genéticas reversos começando com genes já conhecidos conduziram para a elucidação de novos mecanismos de ciclo SV através a cuidadosa descrição do mutante ciclismo fenótipos4. A Drosophila Nicotínico é quase ideal como uma preparação experimental sináptica para dissecar os mecanismos de endocitose e exocitose SV via métodos de opticamente vesículas de pista de ciclismo durante a neurotransmissão.
Uma gama de marcadores fluorescentes permitem rastreamento visual das vesículas durante a ciclagem dinâmica, mas o mais versátil é análogos de tintura de FM que é sintetizado pela primeira vez Mao, F., et al. 5. estruturalmente, FM corantes contêm uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectado através de um anel aromático, com uma região central, conferindo Propriedades espectrais. Estes styryl corantes particionar reversível em membranas, não 'perder um combate' entre membrana folhetos e nunca são tão livre no citosol e são muito mais fluorescente em membranas de água5. Inserção reversível em uma bicamada lipídica provoca um 40-fold aumento na fluorescência6. Em sinapses neuronais, clássico FM tintura etiquetando as experiências consistem em banhar a preparação sináptica com o corante durante despolarizantes estimulação para carregar corante através de endocitose SV. Tintura externa é então lavada e o ciclo SV é preso em uma solução de ringer livre de cálcio a imagem carregada sinapses7. Uma segunda ronda de estimulação em um banho sem corantes provoca a liberação de FM por exocitose, um processo que pode ser seguido por medição a diminuição de intensidade de fluorescência. Populações de SV de uma única vesícula para piscinas contendo centenas de vesículas podem ser monitorada quantitativamente6,7. Corantes de FM têm sido utilizados para dissecar dependente da atividade de mobilização das piscinas SV funcionalmente distintas e para comparar beijo e executar vs CME ciclismo8,9. O método foi modificado para separadamente do ensaio evocado, espontânea e miniatura sináptica ciclo de atividades (com equipamento altamente sensível para detectar alterações de fluorescência muito pequenas e reduzir fotobranqueamento)10. Ensaios podem ser estendidos ao nível ultraestrutural por photoconverting o sinal de FM fluorescente em um rótulo de elétron-densa para transmissão microscopia eletrônica11,12,13,14 .
Historicamente, banho preparações sináptica em uma alta concentração de potássio (doravante referida como "alta [K+]") tem sido o método de escolha para despolarizar a estimulação para induzir SV ciclismo; que vão desde o sapo colinérgico Nicotínico5, a culta neurônios hippocampal cérebro de roedor15, para a Drosophila glutamatérgico MNJ modelo16,17. Esta abordagem de [K+] alta é simples, exige nenhum equipamento especializado e, portanto, é acessível para a maioria dos laboratórios, mas tem limitações para aplicação e interpretação dos dados. Um método muito mais fisiologicamente apropriado é usar sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo4,5,12. Essa abordagem conduz a propagação do potencial de ação para estimulação direta do nervo pré-sináptica terminal, e os resultados podem ser directamente comparados a ensaios eletrofisiológicos de neurotransmissão função13,14, 15, mas requer equipamento especializado e é tecnicamente muito mais desafiador. Com o advento da optogenetics, o uso da estimulação neuronal channelrhodopsin tem vantagens adicionais, incluindo controle spatiotemporal apertado de expressão de canal usando o binário Gal4/UAS sistema20. Esta abordagem é tecnicamente muito mais fácil do que a estimulação de sucção eletrodo e requer nada mais do que uma fonte de luz LED muito barata. Aqui, nós empregamos imagem de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibrometo de piridínio) tanto a comparar e contrastar esses três métodos diferentes de estimulação para a Drosophila MNJ: alta simples [K+ ], desafiando channelrhodopsin elétricos e novas abordagens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM de corantes são usados para estudar o ciclo da vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfifílicos têm uma cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, tornando-os solúveis em água, com a capacidade reversível, entrar e sair bilayers do lipid da membrana. Estes corantes styryl são relativamente não-fluorescente em meio aquoso, mas causa a inserção no folheto externo da membrana plasmática um > 40 X aumento da fluorescência. Nas sinapses neuronais, FM corantes são internalizados durante a endocitose SV, traficada dentro e entre pools de SV e liberada com exocitose SV, fornecendo uma ferramenta poderosa para visualizar pré-sináptica estágios da neurotransmissão. Um modelo genético primário de glutamatérgico sinapse desenvolvimento e função é a Drosophila junção neuromuscular (JNM), onde FM tingir de imagem tem sido amplamente utilizada para quantificar a dinâmica do SV em uma ampla gama de condições mutantes. O terminal sináptico Nicotínico é facilmente acessível, com uma bela matriz de boutons sinápticas grandes ideais para aplicativos de imagem. Aqui, podemos comparar e contrastar as três maneiras de estimular a drosófila MNJ dirigir atividade dependente FM1-43 tintura absorção/liberação: aplicativo 1) banho de alta [K+] para despolarizar tecidos neuromusculares, 2) nervo motor do eletrodo de sucção estimulação para despolarizar o nervo pré-sináptica terminal e 3) alvo transgénico expressão de variantes de channelrhodopsin para controle de luz-estimulada, espacial de despolarização. Cada um desses métodos tem vantagens e desvantagens para o estudo dos efeitos de mutação genética sobre o ciclo SV na drosófila MNJ. Discutiremos essas vantagens e desvantagens para ajudar a seleção da abordagem de estimulação, juntamente com as metodologias específicas para cada estratégia. Além de imagens fluorescentes, corantes de FM podem ser photoconverted aos sinais de elétron-densa visualizado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para estudar mecanismos de ciclo SV a nível ultraestrutural. Nós fornecemos as comparações de confocal e microscopia eletrônica de imagens de diferentes métodos de estimulação de Drosophila JNM, para ajudar a guiar a seleção dos futuras paradigmas experimentais.

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a tintura de FM de atividade dependente da imagem latente do protocolo. O experimento começa sempre com a mesma dissecação cola larval, independentemente do método de estimulação usado posteriormente. Figura 1a é um diagrama esquemático de uma larva dissecado, mostrando o cordão nervoso ventral (VNC), irradiando nervos e repetidas hemisegmental muscular padrão. O VNC é removid...

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FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

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Estado de dependência-Efeitos sobre a TMS: Um olhar sobre Comportamento fosfeno Motive

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Neurociência

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Avaliação da função neuromuscular Usando percutânea Estimulação Elétrica Nervosa

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Estimulação transcraniana de elétrica cerebral em roedores alertas

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

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Estimulação magnética transcraniana combinada e Eletroencefalografia do córtex pré-frontal Dorsolateral

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

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