Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Agradecemos a los miembros de Broadie Lab contribuciones a este artículo. Este trabajo fue financiado por los NIH R01s MH096832 y MH084989 a K.B. y beca predoctoral NIH MH111144 F31 a D.L.K.

1. larvas pegamento disección
<ol><li>Mezclar bien 10 partes de elastómero de silicona base con 1 parte de elastómero de silicona curado a agente del kit del elastómero (Tabla de materiales).</li>
	<li>Capa de cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y el cura sobre una placa caliente a 75 ° c durante varias horas (hasta que ya no es pegajoso al tacto).</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de vidrio solo revestimiento de elastómero en la sala de disección de cristal plexi a medida (<...

Alta estimulación despolarización salina [K+] es por lejos el más fácil de las tres opciones para teñir de FM dependientes de actividad ciclismo, pero probablemente la menos fisiológica29. Este sencillo método despolarizan cada célula accesible en el animal entero y por lo tanto no permite estudios dirigidos. Es posible aplicar localmente alta [K+] solución salina con una micropipeta, pero esto todavía despolarizar pre/postsynaptic células y probable glia sinapsis ...

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas1. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas2. Estas vesículas atracan en las membrana plasmática presináptica fusión sitio zonas activas (AZs), donde exocitosis interviene en la liberación de neurotransmisores de glutamato para trans-comunicación sináptica. Posteriormente, la Superintendencia se recupera de la membrana del plasma vía reciclaje beso-y-funcione o endocitosis mediada por clatrina (CME) para los ciclos repetidos de exo/endocitosis. La Drosophila NMJ es fácilmente accesible y adecuado para aislar y caracterizar a mutantes de ciclo SV. Utilizando pantallas genéticas adelantados, mutaciones han conducido a la identificación de nuevos genes críticos para la SV ciclo3. Por otra parte, enfoques genéticos inversos a partir de genes ya conocidos han llevado al esclarecimiento de nuevos mecanismos de ciclo SV por la cuidada Descripción de mutante ciclismo fenotipos4. La Drosophila NMJ es casi ideal como una preparación experimental sináptica para diseccionar los mecanismos de endocitosis y exocitosis SV mediante métodos que ópticamente vesícula de pista de ciclismo durante la neurotransmisión.
Una gama de marcadores fluorescentes permiten seguimiento visual de las vesículas durante el ciclo de la dinámica, pero el más versátil es análogos de tinte de la FM que primero es sintetizado por Mao, f el., et al. 5. estructuralmente, FM tintes contienen una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático, con una región central que confieren propiedades espectrales. Estos styryl tintes reversible de la partición en las membranas, no 'flip-flop' entre los folíolos de la membrana y así nunca son libres en el citosol y son mucho más fluorescentes en las membranas de agua5. Inserción reversible en una bicapa de lípidos provoca un 40-fold aumento en fluorescencia6. En las sinapsis neuronales, clásica FM tinte etiquetado los experimentos consisten en bañar la preparación sináptica con el tinte durante la despolarización estimulación cargar tinte mediante endocitosis SV. Tinte externo luego es lavado y el ciclo SV es detenido en una solución de ringer sin calcio a la imagen cargada sinapsis7. Una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte provoca liberación de FM a través de exocitosis, un proceso que puede seguirse midiendo la disminución de la intensidad de fluorescencia. Poblaciones de SV de una sola vesícula a piletas que contienen cientos de vesículas pueden ser monitoreada cuantitativamente6,7. Tintes de FM se han utilizado para disecar movilización dependiente de actividad de piscinas SV funcionalmente distintas y comparar kiss y gestión vs CME ciclismo8,9. El método ha sido modificado por separado ensayo evocado, ciclo sináptica espontánea y miniatura actividades (con equipo altamente sensible para detectar cambios de fluorescencia muy pequeña y reducir el fotoblanqueo)10. Análisis pueden ampliarse a nivel ultraestructural por photoconverting la señal de FM fluorescente en una etiqueta de electrón-densos para transmisión microscopia electrónica11,12,13,14 .
Históricamente, preparaciones sináptica bañarse en una alta concentración de potasio (en lo sucesivo denominado "alto [K+]") ha sido el método de elección para despolarización estimulación para inducir SV ciclismo; desde la rana colinérgicos NMJ5, cultivadas roedores cerebro neuronas hippocampal15, a la Drosophila glutamatérgica NMJ modelo16,17. Este enfoque [K+] alta es simple, no requiere ningún equipo especializado y por lo tanto es accesible a la mayoría de los laboratorios, pero tiene limitaciones de aplicación y la interpretación de los datos. Un método mucho más fisiológico apropiado es utilizar electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio4,5,12. Este enfoque conduce a potencial de acción propagación para la estimulación directa del nervio presináptico terminal y resultados pueden ser directamente comparados con los ensayos electrofisiológicos de neurotransmisión función13,14, 15, pero requiere equipo especializado y es técnicamente mucho más difícil. Con el advenimiento de optogenetics, el uso de la estimulación neuronal channelrhodopsin tiene ventajas adicionales, incluyendo el estricto control spatiotemporal de la expresión del canal utilizando el binario de sistema de Gal4/UAS20. Este enfoque es técnicamente mucho más fácil que el estímulo de succión del electrodo y requiere nada más que una fuente de luz LED muy barata. Aquí, utilizamos proyección de imagen de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibromuro de piridinio) a comparar y contrastar estos tres métodos diferentes de estimulación en la Drosophila NMJ: alta simple [K+ ], desafiando channelrhodopsin eléctricos y nuevos enfoques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM colorantes se utilizan para estudiar el ciclo de la vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfipáticos tienen una cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica, haciéndolos hidrosolubles con la capacidad reversible entrar y salir de bicapas de lípidos de membrana. Estos tintes styryl son relativamente no-fluorescentes en medio acuoso, pero causa la inserción en el prospecto externo de la membrana plasmática una > 40 X aumento en fluorescencia. En las sinapsis neuronales, tintes de FM son internalizados durante la endocitosis SV, víctimas de la trata dentro y entre piscinas SV y lanzado con exocitosis SV, proporcionando una potente herramienta para visualizar etapas presinápticas de la neurotransmisión. Un modelo genético primario de desarrollo de sinapsis glutamatérgica y de la función es la Drosophila Unión neuromuscular (NMJ), donde FM teñir la proyección de imagen se ha utilizado extensivamente para cuantificar la dinámica de la SV en una amplia gama de condiciones mutantes. La terminal sináptica NMJ es fácilmente accesible, con una hermosa gama de grandes botones sinápticos ideales para aplicaciones de imagen. Aquí, comparar y contrastar las tres formas de estimular la Drosophila NMJ conducir dependiente de actividad FM1-43 tinte absorción/release: aplicación 1) baño de alto [K+] despolarizar los tejidos neuromusculares, 2) nervio motor electrodo de succión estímulo para despolarizar el nervio presynaptic terminal y 3) objetivo expresión transgénica de channelrhodopsin variantes para el control espacial, estimulado por la luz de despolarización. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas para el estudio de los efectos de la mutación genética en el ciclo SV en la Drosophila NMJ. Vamos a discutir las ventajas y desventajas para ayudar a la selección del enfoque de estimulación, junto con las metodologías específicas para cada estrategia. Además de la proyección de imagen fluorescente, tintes de FM pueden ser photoconverted a las señales de electrón-densos visualizados mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para estudiar mecanismos de ciclo SV a nivel ultraestructural. Proporcionamos las comparaciones de confocal y microscopia electrónica de la proyección de imagen de los diferentes métodos de estimulación de la NMJ de Drosophila , para ayudar a guiar la selección de futuros paradigmas experimentales.

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para el tinte de FM dependientes de la actividad de protocolo. El experimento comienza siempre con la misma disección cola larvaria, independientemente del método de estimulación utilizado posteriormente. Figura 1a es un diagrama esquemático de una larva disecada, el cordón nervioso ventral (VNC), irradiando los nervios y hemisegmental repetido patrón de músculo. La VNC se retira y l...

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FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo - y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

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