Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Vi tackar Broadie Lab medlemmar för bidrag till denna artikel. Detta arbete fick stöd av NIH R01s MH096832 och MH084989 till K.B., och NIH pre gemenskap F31 MH111144 till D.L.K.

1. larval lim dissektion
<ol><li>Grundligt blanda 10 delar av silikonelastomer bas med 1 del av silikonelastomer härdare från elastomer kit (Tabell för material).</li>
	<li>Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer och botemedel på en värmeplatta på 75 ° c i flera timmar (tills det inte längre klibbig vid beröring).</li>
	<li>Placera en enda elastomer-belagd täckglas i skräddarsydda plexi glas dissektion kammaren (figur 1, botten) förberedelse för larval d...

Hög [K+] saltlösning depolariserande stimulering är den absolut enklaste av de tre alternativen för aktivitet-beroende FM dye Cykling, men sannolikt den minst fysiologiska29. Den här enkla metoden depolarizes varje tillgänglig cell i hela djuret, och så tillåter inte riktade studier. Det kan vara möjligt att tillämpa lokalt hög [K+] saltlösning med en mikropipett, men detta kommer fortfarande depolariseras pre/postsynaptiska celler och sannolikt synaps-associerade...

Vackert-kännetecknas Drosophila larval neuromuskulära förbindelsen (NMJ) glutamatergic synaps modellen har använts att studera synaps bildning och funktion med ett brett spektrum av genetiska störningar1. Motorneuronen terminalen består av flera axon grenar, alla med många utvidgade synaptic knappar. Dessa rymlig varicosities (upp till 5 µm i diameter) innehåller alla neurotransmission maskiner, inklusive enhetliga glutamatergic synaptiska vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosoliskt reserven och lätt-releasable pool2. Dessa blåsor docka på presynaptiska plasmamembranet fusion webbplats aktiva zoner (AZs), där exocytos förmedlar glutamat neurotransmitterfrigöraren för trans-synaptiska kommunikation. Därefter hämtas SVs från plasmamembranet via kiss-och-kör återvinning eller clathrin-medierad endocytos (CME) för upprepad exo/endocytos cykler. Den Drosophila NMJ är lättillgängligt och väl lämpad för både isolera och karakterisera SV cykel mutanter. Nya mutationer använder framåt genetiska skärmar, och har lett till identifiering av nya gener kritiska för SV cykel3. Omvänd genetiska metoder börjar med redan kända gener har dessutom lett till förtydligandet av nya SV cykel mekanismer genom en noggrann beskrivning av mutant cykling fenotyper4. Den Drosophila NMJ är nästan perfekt som en experimentell synaptic förberedelse för dissekera SV endocytos och exocytos mekanismer via metoder för att optiskt spår vesikler cykling under neurotransmission.
En rad fluorescerande markörer tillåta visuell spårning av blåsor under cykling dynamics, men den mest mångsidiga är FM dye analoger som syntetiseras först av Mao, F., et al. 5. strukturellt, FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofila svans ansluten via en aromatisk ring, med en central region ger spektrala egenskaper. Dessa styryl färgämnen partitionera reversibelt i membran, inte 'flip-flop' mellan membran broschyrer och så är aldrig gratis i cytosolen, och är långt mer fluorescerande i membran än vatten5. Reversibel införande i en lipid lipidens orsakar en 40-fold ökning av fluorescens6. På nervcellernas synapser bestå klassiska FM dye märkning experiment av badningen synaptic preparatet med färgämnet under depolariserande stimulering att ladda dye via SV endocytos. Yttre färgämne sedan tvättas bort och cykelns SV grips i en kalciumfri ringer-lösning till bild laddade synapserna7. En andra omgång stimulering i ett färgämne-fria bad utlöser FM utsläpp via exocytos, en process som kan följas genom mätning av fluorescens intensitet minskningen. SV populationer från en enda vesikler till pooler som innehåller hundratals blåsor kan vara kvantitativt övervakade6,7. FM färgämnen har använts att dissekera aktivitet-beroende mobilisering av funktionellt distinkta SV pooler och jämföra kiss-och-kör vs. CME cykling8,9. Metoden har ändrats till separat analys framkallat, spontan och miniatyr synaptic cykel aktiviteter (med mycket känslig utrustning för att upptäcka mycket små fluorescens förändringar och minska fotoblekning)10. Analyser kan förlängas till ultrastrukturella nivå genom photoconverting den fluorescerande FM-signalen till en elektron-tät etikett för överföring elektronmikroskopi11,12,13,14 .
Historiskt, bad synaptic preparat i en hög koncentration av kalium (hädanefter benämnd ”hög [K+]”) har varit metoden för val av depolariserande stimulering för att inducera SV Cykling; allt från grodan kolinerga NMJ5, till odlade gnagare hjärnan Hippocampus nervceller15, till Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denna hög [K+] metod är enkel, kräver ingen specialutrustning, och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier, men har begränsningar för både tillämpning och tolkning av data. En mycket mer fysiologiskt lämplig metod är att använda sug elektrod elektrisk stimulering av nerven4,5,12. Detta synsätt driver aktionspotentialens spridning för direkt stimulering av presynaptiska nerven terminal, och resultatet kan direkt jämföras med elektrofysiologiska analyser neurotransmission funktion13,14, 15, men kräver specialutrustning och är tekniskt mycket mer utmanande. Med tillkomsten av optogenetik har användandet av channelrhodopsin neuronala stimulering ytterligare fördelar, inklusive snäva spatiotemporal kontroll av kanal uttryck med binära Gal4/UAS system20. Detta tillvägagångssätt är tekniskt mycket lättare än sug elektrod stimulering och kräver inget annat än en mycket billig LED-ljuskälla. Här, vi anställer imaging FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) specificiteten etylenedibromid) att både jämföra och kontrastera dessa tre olika stimulering metoder på den Drosophila NMJ: enkel hög [K+ ], utmanande elektriska och nya channelrhodopsin metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM färgämnen används att studera cykelns synaptiskt vesikelprotein (SV). Dessa amfipatiska sonder har en hydrofil huvud och hydrofoba svans, vilket gör dem vattenlösliga med förmågan att reversibelt ange och avsluta membran lipider lipidmonolager. Dessa styryl färgämnen är relativt icke-fluorescerande i vattenhaltigt medium, men införande i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet orsakar en > 40 X ökning av fluorescens. I nervcellernas synapser, är FM färgämnen internaliserad under SV endocytos, trafikerade både inom och mellan SV pooler och utsläppt med SV exocytos, som tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att visualisera presynaptiska stadier av neurotransmission. En primär genetisk modell av glutamatergic synaps utveckling och funktion är den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ), där FM färga imaging har använts i stor utsträckning att kvantifiera SV dynamik i ett brett utbud av muterade villkor. NMJ synaptic terminalen är lättillgänglig, med en vacker samling av stora synaptic knappar som är perfekt för imaging applikationer. Här, vi jämför och kontrast på tre sätt att stimulera den Drosophila NMJ att driva aktivitet-beroende FM1-43 dye upptag/release: 1) bad tillämpningen av hög [K+] att depolariseras neuromuskulära vävnader, 2) sug elektrod motor nerv stimulering till depolariseras presynaptiska nerven terminal, och 3) riktade transgena uttrycket för channelrhodopsin varianter för ljus-stimulerad, spatial kontroll av depolarisation. Dessa metoder har fördelar och nackdelar för att studera genetisk mutation effekter på SV cykeln på den Drosophila NMJ. Vi kommer att diskutera dessa fördelar och nackdelar att bistå vid valet av metoden stimulering, tillsammans med metoderna som är specifika för varje strategi. Utöver fluorescerande imaging, kan FM färgämnen vara photoconverted electron-tät signaler visualiseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att studera SV cykel mekanismer på en ultrastrukturella nivå. Vi erbjuder jämförelser av confocal och elektronmikroskopi imaging från de olika metoderna för Drosophila NMJ stimulering, att vägleda urvalet av framtida experimentella paradigm.

Figur 1 visar arbete-flödet för aktivitet-beroende FM färgämnet protokoll. Experimentet börjar alltid med samma larval lim dissektion, oavsett stimulering metod som därefter används. Figur 1a är en schematisk bild av en dissekerade larv, visar den ventrala nerv sladden (VNC), utstrålande nerver och upprepade hemisegmental muskelmönster. VNC tas bort och preparatet badade i en 4 µM lösning av FM1-43 (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM-Dye cykling på synapsen: jämföra höga kalium depolarisation, elektriska och Channelrhodopsin stimulering

Synaptiskt vesikelprotein (SV) cykling är core mekanismen för kommunikationen i nervcellernas synapser. FM dye upptag och utsläpp är det primära sättet att kvantitativt testmetoder SV endo- och exocytos. Här, jämför vi alla stimulering metoder för att driva FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) modell synapsen.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Statligt Beroende Effekter på TMS: En titt på Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptiska Inspelningar på Afferent Dendrites Kontakta Cochlear inre hårcellerna: Övervakning Multivesicular Släpp på ett band Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Undersöka Yttre Motility Hår Cell med en kombination av yttre Alternerande elektriska fältet stimulering och hög hastighet bildanalys

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Övervakning kluvna caspase-3 aktivitet och apoptos av evigt ihågkommen Oligodendroglial celler med Live-cell imaging och Cleaveable Fluorogenic-dye Substrat Efter Kalium-inducerad Membran depolarisation

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Bedömning av neuromuskulära funktionen Använda perkutan elektrisk nervstimulering

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transkraniell elektrisk hjärnstimulering i Alert gnagare

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkraniell elektrisk stimulering och Intracortical inspelning hos råttor

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Kombinerade transkraniell magnetisk stimulering och elektroencefalografi av dorsolaterala prefrontala Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Avbildning av Cell-specifika Calcium signalering vid trepartsavtal synapsen av mus membranet

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...