Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

Broadie laboratuvar Üyeler bu makalede katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser NIH R01s MH096832 ve MH084989 b. için tarafından desteklenen ve NIH HGUGM dostluk F31 MH111144 D.L.K. için

1. larva tutkal diseksiyon
<ol><li>Silikon elastomer temel silikon elastomer Ajan elastomer kiti (Tablo reçetesi) kür, 1 kısım ile 10 parçaları iyice karıştırın.</li>
	<li>22 x 22 mm cam coverslips elastomer ve tedavi 75 ˚C de sıcak bir tabak üzerinde birkaç saat (artık yapışkan kadar dokunmak) kat.</li>
	<li>Bir tek elastomer kaplı cam coverslip larva diseksiyon için hazırlık özel yapım pleksi cam diseksiyon odanın içine (Şekil 1, alt) yerleştir...

Yüksek [K+] serum fizyolojik uyarılma depolarize tarafından çok aktivite bağımlı FM boya Bisiklete binme ama büyük olasılıkla az fizyolojik29için üç seçenek en kolay yoldur. Bu basit yöntem tüm hayvan erişilebilir her hücrede depolarizes ve bu yüzden yönlendirilmiş çalışmalar izin vermez. Yerel olarak bir micropipette yüksek [K+] serum uygulamak mümkün olabilir, ama bu hala pre/postsinaptik hücre ve büyük olasılıkla synapse ilişkili glia<sup ...

Synapse oluşumu ve genetik tedirginlikler1geniş bir yelpazede işleviyle çalışmaya Drosophila larva nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic güzel karakterize synapse modeli kullanılmıştır. Motor nöron terminal birden çok axon dalları, her biri pek çok genişlemiş sinaptik boutons oluşur. Bu geniş varicosities (ilâ 5 mikron çapında) tek tip glutamatergic sinaptik veziküller dahil olmak üzere neurotransmission makine içeren (SVs; ~ 40 nm çapında) sitozolik rezerv ve kolayca derledi havuzları2. Bu veziküller nerede ekzositozu aracılık eder glutamat nörotransmitter serbest bırakılması için transpresynaptic plazma zarı fusion site aktif bölgelerde (AZs), dock-sinaptik iletişim. Daha sonra SVs tekrarlanan exo/endositoz devredir plazma zarı öpücük tarafından işletilen geri dönüşüm veya clathrin-aracılı endositoz (CME) üzerinden alınır. Drosophila NMJ kolayca erişilebilir ve yalıtma ve SV döngüsü mutantlar karakterize için oldukça uygundur. İleri genetik ekranları kullanarak, yeni genlerin SV döngüsü3için kritik kimliği roman mutasyonlar açmıştır. Ayrıca, zaten bilinen genler ile başlayarak geriye doğru genetik yaklaşımlar yeni SV döngüsü mekanizmalar aracılığıyla fenotipleri4Bisiklete binme mutant dikkatli açıklaması aydınlatma yol açmıştır. Drosophila NMJ neredeyse SV endositoz ve ekzositozu mekanizmaları yöntemleri için optik neurotransmission sırasında Bisiklete binme parça vezikül ile dissekan için deneysel bir sinaptik hazırlık olarak idealdir.
Flüoresan işaretler bir dizi dynamics Bisiklete binme sırasında veziküller görsel izlenmesine izin, ancak ilk Mao, F., ve arktarafından sentezlenir FM boya analogları en çok yönlü vardır. 5. yapısal olarak, FM boyalar hidrofilik bir baş ve bir aromatik halka aracılığıyla spektral özellikleri veriyor bir merkez bölge ile bağlı bir lipofilik kuyruğu içerir. Bu styryl boyalar ters bölme içinde membranlar, 'membran broşürler arasında flip-flop değil' de hiç öyle sitozol ücretsiz ve su5' ten membranlar içinde çok daha floresan. Lipid bilayer içine ters çevrilebilir ekleme floresans6' 40-fold bir artış neden olur. Nöronal sinapslarda Klasik FM boya etiketleme deneyler sinaptik hazırlık stimülasyon depolarize sırasında boya boya SV endositoz ile yüklemek için banyo oluşur. Dış boya sonra yıkanıp ve SV döngüsü yüklü sinapslarda7görüntüye bir kalsiyum ücretsiz zil çözümünde tutuklandı. Stimülasyon boya ücretsiz banyo içindeki ikinci turunda FM yayın ekzositozu, floresan yoğunluğu azalma ölçerek takip edilebilir bir süreç aracılığıyla tetikler. Tek bir vezikül SV gruplarından veziküller yüzlerce içeren havuzlarına kantitatif izlenen6,7olabilir. İşlevsel olarak farklı SV havuzları etkinlik bağımlı seferberlik teşrih ve öpücük ve çalıştırma8,9Bisiklete binme CME vs karşılaştırmak için FM boyalar kullanılmaktadır. Yöntem uyarılmış, ayrı ayrı tahlil için spontan ve minyatür sinaptik döngüsü faaliyetleri (ile çok küçük floresan değişiklikleri algılamak ve photobleaching azaltmak için son derece hassas ekipman)10değiştirildi. Transmisyon Elektron mikroskobu11,12,13,14 elektron yoğun bir etiket içine photoconverting floresan FM sinyal tarafından ultrastructural seviyeye uzatılabilir deneyleri .
Tarihsel olarak, banyo sinaptik hazırlıkları (bundan sonra "yüksek [K+]" anılacaktır) potasyum yüksek bir konsantrasyon içinde Bisiklete binme SV ikna etmek için stimülasyon depolarize için seçtiğiniz yöntemi olmuştur; kurbağa kolinerjik NMJ5, değişen kemirgen beyin hipokampal nöronlar15, Drosophila glutamatergic NMJ modeli16,17kültürlü. Bu yüksek [K+] yaklaşımı basittir, hiçbir özel ekipman gerektirir ve bu nedenle çoğu Labs'e erişilemez ama uygulama ve veri yorumu için sınırlamalar vardır. Sinir4,5,12emme elektrot elektriksel stimülasyon kullanın fizyolojik açıdan çok daha uygun bir yöntemdir. Bu yaklaşım doğrudan presynaptic sinir uyarılması için Aksiyon potansiyeli yayılma terminal sürücüler ve sonuçları doğrudan neurotransmission işlevi13,14elektrofizyolojik deneyleri için karşılaştırılabilir, 15, ama özel ekipman gerektirir ve teknik olarak çok daha zordur. Optogenetics gelişiyle channelrhodopsin nöronal stimülasyon kullanımı kanal ifade kullanarak ikili Gal4/UAS sistem20sıkı kronolojik zamanmekansal kontrolü de dahil olmak üzere ek avantajlar vardır. Bu yaklaşım teknik olarak emme elektrot stimülasyon çok daha kolay ve çok ucuz bir LED ışık kaynağı başka bir şey gerektirir. Burada, çalışan sayımız görüntüleme FM1-hem karşılaştırmak ve bu üç farklı stimülasyon yöntemi Drosophila NMJ, kontrast için 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide): basit yüksek [K+ ], elektrik ve yeni channelrhodopsin yaklaşımlar zorlu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM boyalar sinaptik vezikül (SV) döngüsü incelemek için kullanılır. Bu amfipatik probları hidrofilik baş ve hidrofobik kuyruk, onları geri dönülebilir olarak girin ve membran lipid bilayers çıkmak için yeteneği ile suda çözünebilir hale var. Bu styryl boya nispeten olmayan sulu ortamda floresan, ancak plazma zarı dış broşür içine ekleme neden bir > 40 X artırmak floresans içinde. Nöronal sinapslarda içinde FM boyalar sırasında SV endositoz, neurotransmission presynaptic aşamaları görselleştirmek için güçlü bir araç sağlayarak hem içinde hem de SV havuzları arasında ticareti ve ile yayımlanan SV ekzositozu içselleştirilmiş. Bir birincil genetik glutamatergic sinaps geliştirme ve işlev nöromüsküler kavşak (NMJ), nerede FM boya görüntüleme yoğun SV dynamics mutant koşulları geniş bir alanda ölçmek için kullanılan Drosophila modeldir. Büyük sinaptik boutons için görüntüleme uygulamalarında ideal güzel bir dizi NMJ sinaptik terminal kolayca ulaşılabilir. Burada, biz karşılaştırın ve kontrast Drosophila NMJ etkinlik bağımlı FM1-43 boya alımı/release sürücü teşvik için üç yol: 1) banyo uygulama yüksek [K+nöromüsküler doku depolarize, 2) elektrot motor sinir emme için] presynaptic sinir terminal ve 3 depolarize stimülasyon) depolarizasyon ışık uyarılmış, mekansal kontrolü için channelrhodopsin versiyonlarının transgenik ifade hedef. Bu yöntemlerin her birinin yararlarını ve sakıncalarını SV döngüsü üzerinde genetik mutasyon etkileri incelenmesi için Drosophila NMJ var. Biz bu avantajları ve dezavantajları her strateji için belirli metodolojisi ile birlikte stimülasyon yaklaşım yelpazesi yardımcı olmak için görüşecek. Floresan görüntüleme ek olarak FM boyalar-ebilmek var olmak photoconverted elektron yoğun sinyalleri SV döngüsü mekanizmaları ultrastructural bir düzeyde çalışmaya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntülenir. Biz confocal karşılaştırmalar sağlamak ve elektron mikroskobu Drosophila NMJ stimülasyon, rehber yardımcı olmak için farklı yöntemler gelecekteki deneysel paradigmalar yelpazesi görüntüleme.

Şekil 1 Protokolü Imaging etkinlik bağımlı FM boya için iş akışı gösterilmektedir. Deney her zaman daha sonra kullanılan stimülasyon yöntemi ne olursa olsun aynı larva tutkal diseksiyon ile başlıyor. Şekil 1a bir disseke larva, şematik ventral sinir kablosu (VNC), sinirler ve tekrarlanan hemisegmental kas desen yayılan bir şey. VNC kaldırılır ve hazırlık FM1-43 (Şekil 1b, p...

Watch this Scientific Journal Video about FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation at JoVE.com

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

TMS Devlet Bağımlılık Etkileri: Motive Phosphene Davranış Bir Bakış

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Perkütan Elektriksel Sinir Stimülasyonu kullanma Nöromüsküler Fonksiyonu Değerlendirilmesi

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transkraniyal elektrik beyin stimülasyonu uyarı Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Kombine Transkraniyal Manyetik stimülasyon ve elektroansefalografi Dorsolateral Prefrontal korteksin

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...