Name: identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes at JoVE.com

Wir erkennen deutlich PR. e.j. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) für das kostbare Geschenk des mutierten Bibliothek und Dr. Ben Marshall (Faculty of Medicine, University of Southampton, UK) für die Korrekturen des Manuskripts. Für ihre finanzielle Unterstützung (RF20150501377) wird stark der französischen Patientenverband für Mukoviszidose "Vaincre la Mucoviscidose" und "L'Association Gregory Lemarchal" anerkennen. Wir danken auch der nationalen Agentur für Forschung (ANR-Programm DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) und der Region Ile de France (Domaine d'Intérêt Gewalt Maladies Infectieuses et Emergentes) für die Finanzierung des postdoctoral Fellowship V.L-m. L. L. ist ein Doktorand aus der "Ministère de L'Enseignement Supérieur et De La Recherche".

(1) Bibliothek Screening
<ol><li>Aufbau der Tn mutierten Bibliothek
	<ol>
<li>Erhalten Sie eine Transposon-Bibliothek. Hinweis: Für dieses Experiment wurde eine Transposon mutierten Bibliothek von e.j. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA erhalten. Die Bibliothek wurde aus einem glatten klinischen Stamm (43) aus der M. Abscessus Komplex (M. Abscessus subspecies Massiliense) mit einem Phagemid in M. Abscessus erlaubt die zufällige Einfügu...

<ol>
	<li>Qvist, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+harmful+effects+of+nontuberculous+mycobacteria+and+Gram+negative+bacteria+on+lung+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).</li><li>Roux, A. -. 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H., L&#243;pez-Jim&#233;nez, A. T., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+Dicty+Met+Myco,+a+(Not+So)+Romantic+Story+about+One+Amoeba+and+Its+Intracellular+Pathogen.">When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).</li><li>Delafont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+amoebae-mycobacteria+association+in+drinking+water+network.">First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (20), (2014).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. 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Das Verhalten von M. Abscessus ist das Verhalten der pathogenen SGM wie M. Tuberkulose viel ähnlicher als jede andere Mykobakterien, RGM2angehören. Das zentrale Element in der Pathogenität der SGM ist ihre Fähigkeit zu überleben oder sich sogar in Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen vermehren.
M. Abscessus hat gewisse genomische Vorteile erworben, dargestellt durch die gesamtsequenz der Genom-<sup clas...

Die Gattung umfasst Mycobacterium Arten von harmlosen saprophytischen Organismen bis hin zu großen menschlichen Krankheitserreger. Bekannte pathogene Arten wie Mycobacterium Tuberculosis, Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Ulcerans gehören zur Untergruppe der langsam wachsende Mykobakterien (SGM). Im Gegensatz dazu die Untergruppe der schnellsten wachsenden Mykobakterien (RGM) zeichnet sich durch ihre Fähigkeit, in weniger als 7 Tagen auf Agar Medium sichtbare Kolonien bilden. Die RGM Gruppe umfasst mehr als 180 Arten, vor allem nicht-pathogenen Mykobakterien saprophytischen. Studien zur RGM Interaktionen mit ihren Gastgebern konzentrierten sich hauptsächlich auf Mycobacterium Smegmatis und zeigen, dass diese Mykobakterien schnell durch die bakterizide Wirkung von Makrophagen beseitigt werden.
Mycobacterium Abscessus ist eines der seltenen RGM, die für den Menschen pathogen sind und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Infektionen von Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu Lungen- und disseminierten Infektionen. M. Abscessus , zusammen mit Mycobacterium Avium, gilt die wichtigsten mykobakteriellen Erreger von Mukoviszidose-Patienten1.
Verschiedene Studien durchgeführt auf M. Abscessus zeigen, dass diese Mycobacterium verhält sich wie eine intrazelluläre Erreger, die in der Lage, zu überleben die bakterizide Antwort von Makrophagen und Fibroblasten in den Lungen und Haut, die in der Regel keine in RGM beobachtet wird 2 , 3 , 4. M. Abscessus Genomanalyse identifizierte Stoffwechselwege, die typischerweise in ökologischen Mikroorganismen in Kontakt mit dem Boden, Pflanzen und aquatischen Umgebungen, wo freie Amöben oft sind5. Sie haben auch gezeigt, dass M. Abscessus , mit mehreren Virulenz-Gene in die saprophytischen und nicht-pathogenen RGM ausgestattet ist, wahrscheinlich erworben durch horizontalen Gentransfer in einer Nische günstig zu genetischen Austausch, der sammeln könnte nicht gefunden verschiedene Amöben resistenter Bakterien.
Experimentell, war eines der ersten markanten Ergebnisse der Beobachtung des intrazellulären Zunahme von M. Abscessus Makrophagen sowie für M. Tuberculosis6. M. Abscessus widersteht auch die Versauerung von Phagosom, Apoptose und Autophagie, drei wesentliche Mechanismen der zellulären Widerstand zur Infektion2. Es hat auch gezeigt, dass M. Abscessus ist in der Lage, eine unmittelbare Kommunikation zwischen den Phagosom und Zytosol, einer mehr nährstoffreiche Umgebung, die bakterielle Vermehrung2begünstigen könnte. Sehr wenig bekannt über die genomische Vorteile, die M. Abscessus besitzt oder erwirbt Überleben in einer intrazellulären Umgebung zu ermöglichen. Amöbe-Coculture ist eine effiziente Methode, die die Isolation von vielen neuen Amöbe resistenten Bakterien wie Mycobacterium Massiliense7,8erlaubt. Die Fähigkeit, innerhalb Amöben vermehren wurde beobachtet, in einem Modell der Aerosolization von M. Abscessus bei Mäusen, die eine höhere Virulenz, M. Abscessus4verleihen können. Eine Hypothese ist, dass M. Abscessus genetische Merkmalen begegnet in dieser Umgebung überleben in phagocytic Zellen, die sich von anderen nicht-pathogenen RGM entwickelt hatte. Diese Akquisitionen könnten die Fähigkeit, zu verbreiten und seine Virulenz im menschlichen Wirt begünstigen.
Dieser Bericht beschreibt Werkzeuge und Methoden, um die genomische Vorteile, M. Abscessus in Amöben Umgebung überleben übertragen wurden. Zu diesem Zweck ist das Screening von M. Abscessus Transposon Mutanten, auf dem Acanthamoeba Castellanii Typ Stamm erstbeschrieben ermöglicht die Identifizierung von Mutant defekt für intrazelluläre Wachstum. Eine zweite Überprüfung in Makrophagen wird auch berichtet, zu bestätigen, wenn dieser Mangel in der menschlichen Wirt fortbesteht. Zweitens entwickelt um zu verstehen, welche Mechanismen in M. Abscessus zur Anpassung an das Leben in phagocytic genutzt werden Zellen und erhöhen Sie seine Virulenz im tierischen Wirt, eine Methode, die speziell für M. Abscessus war, nach kokultur in Anwesenheit von Amöben, die die Gewinnung von Gesamt-RNS aus Intra-amöbenzelle Bakterien erlaubt. Infolgedessen entwickelte sich ein umfassender Überblick über M. Abscessus Gene, die für eine intrazelluläre Leben erforderlich sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">24-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">96-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Beadbeater&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Bertin</td>
			<td style="width:135px;">Precellys 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Genepulser Xcell</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Nanodrop spectrophotometer 2000</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">QuBit fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zirconium beads/silica beads</td>
			<td style="width:128px;">Biospec products</td>
			<td style="width:135px;">11079101Z</td>
			<td>Beads</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Name of reagent/cells</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acanthamoeba&#160;castellanii&#160;</td>
			<td style="width:128px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">30010</td>
			<td>strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amikacin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Mylan</td>
			<td style="width:135px;">150927-A</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M6250</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C1016</td>
			<td>&#62;93% granular anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Fluka</td>
			<td style="width:135px;">25666</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClaI enzyme</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">R0197S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:135px;">43041</td>
			<td>90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G8270&#160;</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11500596</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase and RNase free water&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">10977-035</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.&#160;coli electrocompetent&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">18265017</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E4884</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Escherichia coli&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Clinical isolate</td>
			<td style="width:135px;">personal stock</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fe(NH4)2(SO4)-6H20&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:135px;">15505-40</td>
			<td>sulfate solution 4% aqueous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10270</td>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glycerol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium thiocyanate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Euromedex</td>
			<td style="width:135px;">EU0046-D</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">I9516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774.2 macrophages</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">J774.2</td>
			<td>Strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">kanamycin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P0662</td>
			<td>Monobasic, anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB liquid medium&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12795-027</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10837059001</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Labosi</td>
			<td style="width:135px;">M275</td>
			<td>pur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Microbank TM (cryotubes with beads)</td>
			<td style="width:128px;">Pro-Lab Diagnostic</td>
			<td style="width:135px;">PL.170/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H11 medium</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0428</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H9 medium</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11753473</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M&#252;ller-Hinton agar</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td>3563901</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Lauryl-sarcosine</td>
			<td style="width:128px;">Merck</td>
			<td style="width:135px;">S37700 416</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S9390</td>
			<td>98-102%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol/chloroforme&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">77617</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">EO0491</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">211684</td>
			<td>enzymatic digest of animal tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC19 plasmid</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">54357</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS&#160; 20%</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;">1610418</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td style="width:135px;">567446</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">88810</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tris</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">154563</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>12044977</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P1754&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Kit</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMBION DNase kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>10792877</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Agilent Chip</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJET Plasmid Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">K0503</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink PCR Purification kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">K310001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-It&#34; assays kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33140/Q32884</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">Y90001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Stranded RNA LT prep kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td>15032611</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes

Was aus anderen saprophytischen Mykobakterien Mycobacterium Abscessus unterscheidet, ist die Fähigkeit, durch menschliche Makrophagen Phagozytose widerstehen und die Fähigkeit, innerhalb solcher Zellen vermehren. Diese Virulenz Eigenschaften Rendern M. Abscessus pathogenen, vor allem in gefährdeten Hosts mit zugrunde liegenden strukturellen Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose, Bronchiektasen oder Tuberkulose. Es bleibt unklar, wie Patienten mit M. Abscessus infiziert werden. Im Gegensatz zu vielen Mykobakterien M. Abscessus findet sich nicht in die Umwelt aber befinden sich vielleicht innen Amöben, ökologische Phagozyten, die eine potenzielle Reservoir für M. Abscessusdarstellen. In der Tat M. Abscessus ist resistent gegen amöbenzelle Phagozytose und der Intra-Amöben Leben scheint M. Abscessus Virulenz in einem experimentellen Modell der Infektion erhöhen. Über M. Abscessus Virulenz an sich ist jedoch wenig bekannt. Um die Gene ein Vorteil zum M. Abscessus intrazellulären Leben zu entschlüsseln, war eine Vorführung einer M. Abscessus Transposon mutierten Bibliothek entwickelt. Parallel entwickelte eine Methode der RNA-Extraktion aus intrazellulären Mykobakterien nach kokultur mit Amöben. Diese Methode wurde validiert und erlaubt die Sequenzierung des gesamten M. Abscessus Transkriptom innerhalb der Zellen; zum ersten Mal eine globale Sicht auf M. Abscessus Anpassung an intrazelluläre Leben vorsieht. Beide Ansätze geben uns einen Einblick in M. Abscessus Virulenzfaktoren, mit denen M. Abscessus , die Atemwege des Menschen besiedeln.

M. Abscessus hat die Fähigkeit zu widerstehen und die bakteriziden Antworten von Makrophagen und Umwelt Einzeller wie Amöben zu entkommen. M. Abscessus drückt Virulenzfaktoren bei Kontakt mit Amöben, gewachsen, wodurch es mehr virulent in Mäusen4. Das erste Ziel dieser Methoden war, die im M. Abscessus , so dass seine überleben und die Vermehrung in Amöben Gene zu identifizieren.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Hier stellen wir zwei Protokolle, um die Phagozyten -Mycobacterium Abscessus Interaktionen zu untersuchen: das Screening ein Transposon mutierten Bibliothek für bakterielle intrazellulären Mangel und die Bestimmung der bakteriellen intrazellulären Transkriptom von RNA Sequenzierung. Beide Ansätze geben Einblick in die genomische vor- und transkriptomischen Anpassungen intrazelluläre Bakterien Fitness verbessern.

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Mutantes Bibliotheksscreening und transkriptomische Studien an intrazellulären Krankheitserregern können dabei helfen, wichtige Fragen zu genomischen und regulatorischen Anpassungen von Krankheitserregern zu beantworten, die verwendet werden, um im Inneren des Wirts zu überleben. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass sie groß angelegte Untersuchungstechniken sind und einen objektiven Einblick in die Anpassung an das intrazelluläre Leben bieten. Die Implikationen dieser Techniken reichen auf die Therapie von Mycobacterium abscessus, die mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht werden, indem sie Einblicke in mögliche Ziele für die Impfstofftherapie geben.Beginnen Sie mit der Kultivierung von Amöben Acanthamoeba castellani, oder Ac, in 30 Milliliter Peptone Hefe Glukose Medium in 75 Quadratzentimeter Gewebekultur Kolben bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde verwenden Sie eine 25 Milliliter Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Milliliter Ac Puffer ohne Kohlenstoff oder Stickstoff pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Amöbe mit einem einzigen kräftigen Shake vom Boden des Kolbens lösen und die Zellen in einem Falcon-Rohr auf fünf Mal 10 auf die fünf Amöben pro mil Konzentration in frischem Ac-Puffer einstellen.Säen Sie fünfmal 10 bis zu den vier Amöben pro Brunnen in einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Platte bei 32 Grad Celsius für eine Stunde ohne schütteln, damit die schwimmenden Amöben-Tropho-Zoiten an den Brunnen haften. In der Zwischenzeit erwärmen Sie die Bakterien auf Eis, und fügen Sie fünf Mikroliter der aufgetauten Bakterien zu jedem Brunnen am Ende der Inkubation.Nach 1,5 Stunden bei 32 Grad Celsius den Überstand entsorgen, indem Sie die Platte auf einen Stapel steriler Gaze in einer sterilisierten Metallschale unter einer Dunstabzugshaube umkehren. Waschen Sie jeden Gut dreimal mit 200 Mikroliter frischeac Medium pro Brunnen. Nach der letzten Wäsche, inkubieren Sie die Co-Kultur mit 20 Mikroliter frisches Medium mit Amikacin pro Brunnen ergänzt, um alle verbleibenden extrazellulären Mykobakterien für zwei Stunden zu beseitigen.Gefolgt von drei Wärschonungen in frischem Ac-Medium, wie gerade gezeigt wurde. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Medium, ergänzt mit frischem Amikacin zu jedem Brunnen, gefolgt von der Zugabe von fünf mal 10 zu den sieben Hitze inaktivierte Escherichia coli Bakterien. Nach 48 Stunden lysieren Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern 10% Natriumdodecylsulfat pro Brunnen, für 30 Minuten bei 32 Grad Celsius, und verteilen Sie fünf Mikroliter des Lysats auf Columbia Agar Platten mit 5% Schafblut.Verdünnen Sie die Lysate weiter, indem Sie 25 Mikroliter steriles Wasser auf jeden Tropfen hinzufügen. Wenn alle Lysate plattiert sind, versiegeln Sie die Platten mit Kunststoffparaffinfolie und bebrüten die Kulturen drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius. Wenn Kolonien auf den Platten erscheinen, fotografieren Sie die Kulturen und identifizieren Sie die Mutanten, die durch die Ablagerungen mit der niedrigsten Anzahl von Bakterienkolonien für das intrazelluläre Wachstum beeinträchtigt sind.Für intrazelluläre Mykobakterien RNA-Extraktion, zuerst wachsen M.abscessus in 7H9 Medium ergänzt mit Glycerin und Glukose zur mittelexponentiellen Phase in 50 Milliliter-Röhren bei 120 RPM. Am Ende der Kultur, waschen Sie die Bakterien zweimal mit 10 Milliliter Ac Puffer pro Wäsche, und messen Sie die O.D.600, um die Bakterienkonzentration zu schätzen. Als nächstes fügen Sie 8,5 mal 10 zu den acht Mykobakterien zu 8,5 mal 10 zu den sechs Amöben in 10 Milliliter frischem Ac Medium für eine Stunde Inkubation bei 30 Grad Celsius und 80 RPM hinzu.Am Ende der Inkubation ernten die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie das Pellet dreimal in 10 Milliliter n. Frischer Ac-Puffer pro Wäsche unter den gleichen Zentrifugenbedingungen. Dann suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter frischen Ac Puffer mit Amikacin ergänzt, um alle extrazellulären Bakterien zu beseitigen, und inkubieren die Zellen für vier Stunden bei 30 Grad Celsius und 80 RPM, gefolgt von zwei Waschungen in frischem Ac-Puffer. Nach der letzten Wäsche die infizierte Amöbe in vier Milliliter kalter Lösung drei wieder aussetzen, ergänzt mit 280 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol, um die Amöbe auf Eis für 10 Minuten zu stören.Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zelle, um die freigesetzten intrazellulären Bakterien zu pellet, und setzen Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter kalter Lösung drei wieder auf. Es ist wichtig, alle Überstand zu entfernen, um eine Kontamination mit Amöben-RNA oder Proteasen zu vermeiden, die die Proben gemacht haben könnten. Ernten Sie die freigesetzten Bakterien mit einer zweiten Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Extraktionspuffer wieder auf.Dann 24 Stunden bei negativen 80 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie die mykobakterielle Lösung in zwei Milliliter-Schraubrohre mit Zirkoniumperlen bis zur 500-Mikroliter-Gradationsmarke und lagern Sie die Röhren weitere 24 Stunden bei negativen 80 Grad Celsius, um die RNA-Synaktivierung und Zellauflösung zu erleichtern. Tauen Sie am Tag der Analyse die Proben auf Eis auf und lysen Sie die Zellen mit zwei Homogenisierungsrunden bei 6000 RPM für 25 Sekunden, gefolgt von einer Rundenhomogenisierung bei 6000 RPM für 20 Sekunden.Zwischen jeder Homogenisierungsrunde die Proben auf Eis für eine Minute abkühlen, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach der dritten Homogenisierungsrunde die Proben 20 Minuten auf Eis abkühlen und 200 Mikroliter Chloroform in Isoamylalkohol verdünnt in jedes Rohr geben. Wirbel für eine Minute, dann Zentrifugieren Sie die Proben, und fügen Sie 0,8 Milliliter kalteisopropanol in die wässrige Phase für eine zwei bis drei Stunden Inkubation bei negativen 20 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Proben wieder zentrifugieren und die Pellets in 500 Mikroliter kaltem 70%Ethanol ohne Mischen waschen. Dann sofort das Ethanol durch Zentrifugation entfernen. Aspirieren Sie den Überstand zum Trocknen der Pellets in einem Zentrifugalkonzentrator und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter DNA/RNA-freiem Wasser wieder auf.Die mykobakterielle MRNA-Extraktion, wie gezeigt, ermöglicht die Bewertung induzierter und unterdrückter Genfamilien, indem die Gene nach ihrer Rolle bei der Reaktion auf eine Umgebung gruppiert werden, die in ihrer Nährstoff- und Mineralquelle oder in einer hypoxischen oder sauren Umgebung begrenzt ist. In der Resistenz gegen oxidativen und nitrosativen Stress, oder in der Expression von Virulenzfaktoren als Reaktion auf UmweltAmöben. Beim Versuch dieser Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Kultur- und RNA-Isolierung der kontrollierten und infizierten Proben gleichzeitig durchzuführen, um Batch-Effekte zu vermeiden.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die duale RNA-Sequenzierung vorgeformt werden, um zusätzliche Fragen zu Wirtspathogen-Wechselwirkungen zu beantworten. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie in Richtung Mykobakterien-Virulenz im Amöben-Wirtsmodell. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Amöben extrem gefährlich sein kann, da sich die Amöbe in Zysten verwandeln könnte, wenn Sie die im Verfahren beschriebenen Schritte nicht befolgen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...