Name: identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes at JoVE.com

हम बहुत पीआर E.J. रुबिना (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, संयुक्त राज्य अमेरिका) उत्परिवर्ती पुस्तकालय के कीमती उपहार के लिए स्वीकार करते हैं, और डॉ बेन मार्शल (चिकित्सा, साउथेंप्टन, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय के संकाय) पांडुलिपि के सुधार के लिए । हम बहुत सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए फ्रेंच रोगी एसोसिएशन स्वीकार "Vaincre ला Mucoviscidose" और "L'Association ग्रेगरी Lemarchal" उनके वित्तीय सहायता (RF20150501377) के लिए । हम नेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च (ANR प्रोग्राम DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), और वी. एल-एम को Région फेलोशिप की फंडिंग के लिए d'Intérêt इले-डे-फ्रांस (domaine Majeur विकृतियों Infectieuses postdoctoral एट आपाती) का भी शुक्रिया अदा करते हैं । एल. एल. "Ministère डे L'Enseignement Supérieur एट डे ला सभ्य" से डॉक्टरेट की फेलो हैं ।

1. पुस्तकालय स्क्रीनिंग
<ol><li>तमिलनाडु उत्परिवर्ती पुस्तकालय का निर्माण
	<ol>
<li>कोई transposon लायब्रेरी प्राप्त करें । नोट: इस प्रयोग के लिए, एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय E.J. रुबिना, सार्वजनिक स्वास्थ?...

<ol>
	<li>Qvist, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+harmful+effects+of+nontuberculous+mycobacteria+and+Gram+negative+bacteria+on+lung+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).</li><li>Roux, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Casta&#241;eda-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensin+Production+by+Human+Limbo-Corneal+Fibroblasts+Infected+with+Mycobacteria.">Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria.</a> Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).</li><li>Bakala N'Goma, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+abscessus+phospholipase+C+expression+is+induced+during+coculture+within+amoebae+and+enhances+M.+abscessus+virulence+in+mice.">Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+intracellular+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+human+dendritic+cells.">Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).</li><li>Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+intracellular+pathogens+by+amoebal+coculture+and+amoebal+enrichment+approaches.">Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).</li><li>Ad&#233;kambi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+coculture+of+"Mycobacterium+massiliense"+sp.+nov.+from+the+sputum+of+a+patient+with+hemoptoic+pneumonia.">Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).</li><li>Rubin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transposition+of+mariner-based+elements+in+enteric+bacteria+and+mycobacteria.">In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).</li><li>Laencina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+Mycobacterium+abscessus+growth+in+vivo+with+a+prominent+role+of+the+ESX-4+locus.">Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+from+clinical+specimens+via+amoebae,+and+the+interaction+of+those+and+other+isolates+with+amoebae.">Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae.</a> Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).</li><li>Moffat, J. F., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+intracellular+growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii.">A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii.</a> Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Choo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+reconnaissance+of+clinical+isolates+of+emerging+human+pathogen+Mycobacterium+abscessus+reveals+high+evolutionary+potential.">Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential.</a> Science Reports. 4, (2015).</li><li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+Resistant+to+Free-Living+Amoebae.">Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).</li><li>Kicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Validation+of+Whole-Cell+Based+Fluorescence+Assays+to+Identify+Anti-Mycobacterial+Compounds+Using+the+Acanthamoeba+castellanii+-+Mycobacterium+marinum+Host-Pathogen+System.">Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System.</a> Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).</li><li>Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant.">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).</li><li>Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+polyphaga-enhanced+growth+of+mycobacterium+smegmatis.">Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis.</a> Public Library of Science One. 7 (1), (2012).</li><li>Cosson, P., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eat,+kill+or+die:+when+amoeba+meets+bacteria.">Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).</li><li>Lelong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+magnesium+and+a+phagosomal+P-type+ATPase+in+intracellular+bacterial+killing.">Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing.</a> Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).</li><li>Ouertatani-Sakouhi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Mycobacterium+marinum+virulence+identified+in+a+Dictyostelium+discoideum+host+model.">Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model.</a> Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).</li><li>Trofimov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimycobacterial+drug+discovery+using+Mycobacteria-infected+amoebae+identifies+anti-infectives+and+new+molecular+targets.">Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets.</a> Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).</li><li>Cardenal-Mu&#241;oz, E., Barisch, C., Lefran&#231;ois, L. H., L&#243;pez-Jim&#233;nez, A. T., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+Dicty+Met+Myco,+a+(Not+So)+Romantic+Story+about+One+Amoeba+and+Its+Intracellular+Pathogen.">When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).</li><li>Delafont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+amoebae-mycobacteria+association+in+drinking+water+network.">First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (20), (2014).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Mycobacterium+avium+with+environmental+amoebae+enhances+virulence.">Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence.</a> Infection and Immunity. 65 (9), (1997).</li><li>Stamm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+escapes+from+phagosomes+and+is+propelled+by+actin-based+motility.">Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).</li><li>Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESX+secretion+systems:+mycobacterial+evolution+to+counter+host+immunity.">ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).</li><li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis.">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).</li><li>Hsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+mechanism+of+attenuation+of+bacillus+Calmette-Guerin+is+a+loss+of+secreted+lytic+function+required+for+invasion+of+lung+interstitial+tissue.">The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+pore+formation+in+host+cell+membranes+by+ESX-1-secreted+ESAT-6+and+its+role+in+Mycobacterium+marinum+escape+from+the+vacuole.">Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis.+within+Macrophages.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).</li><li>Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Transcriptional+Profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+THP-1+Human+Macrophage+Infection.">Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection.</a> Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).</li><li>Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+Mycobacterium+abscessus+genome+coupled+with+condition+specific+transcriptomics+reveals+conserved+molecular+strategies+for+host+adaptation+and+persistence.">Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence.</a> BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).</li></ol>

एम. abscessus के व्यवहार अधिक है जैसे कि किसी भी अन्य आइसोलेटों से संबंधित RGM2के अलावा रोगजनक SGM के व्यवहार के समान है । SGM के pathogenicity में प्रमुख तत्व उनके जीवित रहने या भी प्रतिजन के भीतर गुणा-कोशिका...

जीनस माइकोबैक्टीरियम प्रमुख मानव रोगजनकों के लिए हानिरहित saprophytic जीवों से लेकर प्रजातियों में शामिल हैं । माइकोबैक्टीरियम तपेदिक, माइकोबैक्टीरियम marinum और माइकोबैक्टीरियम ulcerans के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात रोगजनक प्रजातियों धीमी गति से बढ़ते आइसोलेटों (SGM) के उपसमूह के हैं । इसके विपरीत, तेजी से बढ़ते आइसोलेटों (RGM) के उपसमूह में आगर माध्यम पर 7 दिनों से भी कम समय में दिखाई देने वाली कॉलोनियों के रूप में उनकी क्षमता की विशेषता है । RGM समूह में १८० से अधिक प्रजातियों, मुख्यतः गैर रोगजनक saprophytic आइसोलेटों शामिल हैं । उनके मेजबानों के साथ RGM बातचीत पर अध्ययन मुख्य रूप से माइकोबैक्टीरियम smegmatis पर केंद्रित है और यह प्रदर्शित करता है कि इन आइसोलेटों तेजी से जीवाणुनाशक की मैक्रोफेज कार्रवाई से सफाया कर रहे हैं ।
माइकोबैक्टीरियम abscessus दुर्लभ RGM है कि मनुष्यों के लिए रोगजनक है और त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण से फेफड़े और प्रसार संक्रमण से लेकर संक्रमण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जिंमेदार है में से एक है । M. abscessus माना जाता है, माइकोबैक्टीरियम एवियमके साथ, सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों1में मुख्य माइक्रोबैक्टीरियल रोगज़नक़ हो ।
एम abscessus पर प्रदर्शन किया विभिंन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि इस माइकोबैक्टीरियम एक intracellular रोगज़नक़ की तरह व्यवहार करता है, मैक्रोफेज और फेफड़ों और त्वचा में fibroblasts, जो आम तौर पर RGM में नहीं मनाया जाता है की जीवाणुनाशक प्रतिक्रिया जीवित करने में सक्षम 2 , 3 , 4. M. abscessus जीनोम विश्लेषण आम तौर पर मिट्टी, पौधों और जलीय वातावरण, जहां मुक्त amoebae अक्सर5उपस्थित है के साथ संपर्क में पर्यावरण सूक्ष्मजीवों में पाया चयापचय रास्ते की पहचान की है । उंहोंने यह भी दिखा दिया है कि एम abscessus कई डाह saprophytic और गैर में पाया जीन नहीं रोगजनक RGM, शायद एक आनुवंशिक मुद्रा है कि इकट्ठा हो सकता है के लिए अनुकूल आला में क्षैतिज जीन हस्तांतरण द्वारा अधिग्रहीत के साथ संपंन है विभिन्न अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया ।
प्रायोगिक तौर पर, पहले हड़ताली परिणामों में से एक मैक्रोफेज में एम. abscessus के intracellular वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एम तपेदिक6के लिए निरीक्षण किया गया । एम abscessus भी phagosome, apoptosis और autophagy,2संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिरोध के तीन आवश्यक तंत्र के अंलीकरण का विरोध करती है । यह भी दिखाया गया है कि एम abscessus phagosome और cytosol के बीच एक तत्काल संचार स्थापित करने में सक्षम है, एक अधिक पोषक तत्वों युक्त वातावरण है कि जीवाणु गुणन2एहसान हो सकता है । बहुत कम जीनोमिक फायदे के बारे में जाना जाता है कि एम abscessus के पास या एक intracellular वातावरण में अस्तित्व की अनुमति हासिल कर ली है । अमीबा coculture एक कुशल तरीका है कि माइकोबैक्टीरियम massiliense7,8के रूप में कई नए अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव की अनुमति दी है । एक क्षमता amoebae भीतर गुणा करने के लिए देखा गया था, चूहों में एम abscessus के aerosolization के एक मॉडल में, जो एम abscessus4के लिए एक वृद्धि की डाह प्रदान कर सकते हैं. एक परिकल्पना है कि एम abscessus आनुवंशिक इस वातावरण के भीतर का सामना करना पड़ा phagocytic कोशिकाओं है, जो अंय गैर रोगजनक RGM से अलग है में जीवित लक्षण विकसित किया था । इन अधिग्रहणों और मानव की मेजबानी में अपनी डाह प्रसार करने की क्षमता एहसान हो सकता है ।
इस रिपोर्ट में amoebae वातावरण में जीवित रहने के लिए M. abscessus को प्रदत्त जीनोमिक लाभों को हाइलाइट करने के लिए उपकरण और विधियों का वर्णन किया गया है । इस प्रयोजन के लिए, एम abscessus transposon म्यूटेंट की स्क्रीनिंग पहले, Acanthamoeba castellanii प्रकार तनाव है, जो intracellular विकास के लिए है उत्परिवर्ती दोषपूर्ण की पहचान की अनुमति देता है पर वर्णित है । मैक्रोफेज में एक दूसरी स्क्रीनिंग भी बताया जाता है, की पुष्टि करने के लिए यदि यह दोष मानव की मेजबानी में बनी हुई है । दूसरे, समझने के लिए जो तंत्र abscessus में दोहन करने के लिए phagocytic कोशिकाओं में जीवन के लिए अनुकूल है और पशु मेजबान में अपनी डाह वृद्धि, एक विधि विशेष रूप से एम abscessus के लिए अनुकूल विकसित किया गया था, सह के बाद संस्कृति amoebae की उपस्थिति है कि इंट्रा amoebal बैक्टीरिया से कुल आरएनए के निष्कर्षण की अनुमति दी । एक परिणाम के रूप में, एम abscessus जीन है कि एक intracellular जीवन के लिए आवश्यक है की एक व्यापक दृष्टिकोण विकसित किया गया था ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">24-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">96-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Beadbeater&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Bertin</td>
			<td style="width:135px;">Precellys 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Genepulser Xcell</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Nanodrop spectrophotometer 2000</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">QuBit fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zirconium beads/silica beads</td>
			<td style="width:128px;">Biospec products</td>
			<td style="width:135px;">11079101Z</td>
			<td>Beads</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Name of reagent/cells</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acanthamoeba&#160;castellanii&#160;</td>
			<td style="width:128px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">30010</td>
			<td>strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amikacin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Mylan</td>
			<td style="width:135px;">150927-A</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M6250</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C1016</td>
			<td>&#62;93% granular anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Fluka</td>
			<td style="width:135px;">25666</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClaI enzyme</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">R0197S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:135px;">43041</td>
			<td>90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G8270&#160;</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11500596</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase and RNase free water&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">10977-035</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.&#160;coli electrocompetent&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">18265017</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E4884</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Escherichia coli&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Clinical isolate</td>
			<td style="width:135px;">personal stock</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fe(NH4)2(SO4)-6H20&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:135px;">15505-40</td>
			<td>sulfate solution 4% aqueous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10270</td>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glycerol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium thiocyanate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Euromedex</td>
			<td style="width:135px;">EU0046-D</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">I9516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774.2 macrophages</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">J774.2</td>
			<td>Strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">kanamycin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P0662</td>
			<td>Monobasic, anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB liquid medium&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12795-027</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10837059001</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Labosi</td>
			<td style="width:135px;">M275</td>
			<td>pur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Microbank TM (cryotubes with beads)</td>
			<td style="width:128px;">Pro-Lab Diagnostic</td>
			<td style="width:135px;">PL.170/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H11 medium</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0428</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H9 medium</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11753473</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M&#252;ller-Hinton agar</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td>3563901</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Lauryl-sarcosine</td>
			<td style="width:128px;">Merck</td>
			<td style="width:135px;">S37700 416</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S9390</td>
			<td>98-102%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol/chloroforme&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">77617</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">EO0491</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">211684</td>
			<td>enzymatic digest of animal tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC19 plasmid</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">54357</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS&#160; 20%</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;">1610418</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td style="width:135px;">567446</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">88810</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tris</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">154563</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>12044977</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P1754&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Kit</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMBION DNase kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>10792877</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Agilent Chip</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJET Plasmid Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">K0503</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink PCR Purification kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">K310001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-It&#34; assays kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33140/Q32884</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">Y90001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Stranded RNA LT prep kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td>15032611</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes

क्या दूसरे saprophytic आइसोलेटों से माइकोबैक्टीरियम abscessus अंतर मानव phagocytosis द्वारा मैक्रोफेज और ऐसी कोशिकाओं के अंदर गुणा करने की क्षमता का विरोध करने की क्षमता है । ये डाह लक्षण विशेष रूप से अंतर्निहित संरचनात्मक फेफड़ों की बीमारी, जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस, bronchiectasis या तपेदिक के साथ कमजोर मेजबान में, एम abscessus रोगजनक प्रदान करते हैं । कैसे रोगियों एम. abscessus के साथ संक्रमित हो जाता है अस्पष्ट बनी हुई है । कई आइसोलेटों के विपरीत, m. abscessus वातावरण में नहीं मिला है, लेकिन amoebae के अंदर रहते हैं, पर्यावरण फ़ैगोसाइट कि एम abscessusके लिए एक संभावित जलाशय का प्रतिनिधित्व हो सकता है । दरअसल, m. abscessus amoebal phagocytosis के लिए प्रतिरोधी है और इंट्रा अमीबा जीवन संक्रमण के एक प्रयोगात्मक मॉडल में एम abscessus डाह को बढ़ाने के लिए लगता है । हालांकि, लिटिल अपने आप में एम abscessus डाह के बारे में जाना जाता है । एम. abscessus intracellular जीवन, एक एम. abscessus transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग के लिए एक लाभ प्रदान जीन समझने के लिए विकसित किया गया था । समानांतर में, amoebae के साथ सह संस्कृति के बाद intracellular आइसोलेटों से आरएनए निष्कर्षण का एक तरीका विकसित किया गया था । इस विधि को मांय किया गया था और कक्षों के अंदर पूरे M. abscessus transcriptomes के sequencing की अनुमति है; प्रदान, पहली बार के लिए, intracellular जीवन के लिए एम abscessus अनुकूलन पर एक वैश्विक दृष्टिकोण । दोनों दृष्टिकोण हमें एम. abscessus डाह कारकों में एक अंतर्दृष्टि दे कि एम. abscessus सक्षम करने के लिए मानव में एयरवेज उपनिवेश ।

M. abscessus प्रतिरोध करने के लिए और मैक्रोफेज और amoebae जैसे पर्यावरणीय प्रोटोजोआ के जीवाणुनाशक प्रतिक्रियाओं से बचने की क्षमता है । M. abscessus डाह कारकों को व्यक्त करता है जब amoebae के साथ संपर्क में ?...

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

यहां, हम Phagocyte-माइकोबैक्टीरियम abscessus बातचीत का अध्ययन करने के लिए दो प्रोटोकॉल पेश: बैक्टीरियल intracellular की कमी और आरएनए से बैक्टीरियल intracellular transcriptome के निर्धारण के लिए एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग Sequencing. दोनों दृष्टिकोण जीनोमिक लाभ और transcriptomic रूपांतरों intracellular बैक्टीरिया फिटनेस बढ़ाने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

फ़ैगोसाइट में Intracellular प्रतिकृतिकरण के लिए माइकोबैक्टीरियम abscessus के डाह मार्करों की पहचान

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

उत्परिवर्ती पुस्तकालय स्क्रीनिंग और इंट्रासेलुलर रोगजनकों के ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन मेजबान के अंदर जीवित रहने के लिए उपयोग किए जाने वाले ब्याज के रोगजनकों के जीनोमिक और नियामक अनुकूलन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकते हैं। इन तकनीकों के मुख्य फायदे यह हैं कि वे बड़े पैमाने पर जांच तकनीक हैं, और वे इंट्रासेलर जीवन के अनुकूलन में एक उद्देश्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन तकनीकों के निहितार्थ माइकोबैक्टीरियम फोड़े की चिकित्सा की ओर विस्तार करते हैं जो वैक्सीन थेरेपी के लिए संभावित लक्ष्यों में अंतर्दृष्टि देकर इस बीमारी से संबद्ध होते हैं।कमरे के तापमान पर 75 वर्ग सेंटीमीटर ऊतक संस्कृति फ्लैक्स में पेप्टोन यीस्ट ग्लूकोज माध्यम के 30 मिलीलीटर में अमीबा अकाथमोबा कास्टेलानी, या एसी को बनाकर शुरू करें। एक घंटे के बाद सुपरनेट को हटाने के लिए 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें, और कोशिकाओं को प्रति वॉश कार्बन या नाइट्रोजन के बिना 10 मिलीलीटर एसी बफर के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, अमीबा को एक जोरदार शेक के साथ फ्लास्क के नीचे से अलग करें, और कोशिकाओं को फाल्कन ट्यूब में समायोजित करें, ताजा एसी बफर में पांच बार 10 से पांच अमीबा प्रति मिलियन एकाग्रता तक।बीज पांच बार 10 एक ९६-अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से चार अमीबाई । प्लेट को बिना किसी झटकों के एक घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर रखें, ताकि फ्लोटिंग अमीबा ट्रोफो-ज़ोइट्स को कुओं का पालन करने की अनुमति दी जा सके। इस बीच, बर्फ पर बैक्टीरिया गर्म, और इनक्यूबेशन के अंत में प्रत्येक अच्छी तरह से गल बैक्टीरिया के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें ।32 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के बाद, एक धुएं हुड के तहत एक निष्फल धातु ट्रे में बाँझ धुंध के ढेर पर थाली उलटा द्वारा सुपरनैंट को त्यागें। प्रत्येक को अच्छी तरह से ताजा एसी माध्यम के 200 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, दो घंटे के लिए किसी भी शेष बाह्य बाह्य माइकोबैक्टीरिया को खत्म करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से अमिकासिन के साथ पूरक ताजा माध्यम के 20 माइक्रोलीटर के साथ सह-संस्कृति को इनक्यूबेट करें।ताजा एसी माध्यम में तीन वॉश के बाद, जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया। फिर, मध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, प्रत्येक कुएं में ताजा अमिकासिन के साथ पूरक, इसके बाद सात गर्मी निष्क्रिय एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया में पांच गुना 10 का जोड़ दिया गया। 48 घंटे के बाद, 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट के 10 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को 32 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, और कोलंबिया एगर प्लेटों पर lysate के पांच माइक्रोलीटर फैल 5% भेड़ रक्त युक्त।इसके अलावा प्रत्येक बूंद पर बाँझ पानी के 25 माइक्रोलीटर जोड़कर lysates पतला । जब सभी lysates चढ़ाया गया है, प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों सील, और तीन से चार दिनों के लिए संस्कृतियों को इनक्यूबेट ३७ डिग्री सेल्सियस पर । जब उपनिवेश प्लेटों पर दिखाई देते हैं, तो संस्कृतियों की तस्वीर लें और बैक्टीरियल कॉलोनियों की सबसे कम संख्या के साथ जमा द्वारा इंट्रासेलर विकास के लिए बिगड़ा म्यूटेंट की पहचान करें।इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया आरएनए निष्कर्षण के लिए, सबसे पहले 120 आरपीएम पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में ग्लिसरॉल और ग्लूकोज के साथ ग्लिसरोल और ग्लूकोज के साथ पूरक 7H9 माध्यम में एम फोड़ा बढ़ता है। संस्कृति के अंत में, बैक्टीरिया को प्रति वॉश एसी बफर के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं, और बैक्टीरिया एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए O.D.600 को मापें। इसके बाद, 8.5 गुना 10 से आठ माइकोबैक्टीरिया में 8.5 गुना 10 से छह मिलीलीटर फ्रेश एसी मीडियम में 30 डिग्री सेल्सियस और 80 आरपीएम पर एक घंटे इनक्यूबेशन के लिए ताजा एसी मीडियम में 8.5 गुना जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फसल, और एक ही अपकेंद्रित्र शर्तों के तहत प्रति धोने ताजा एसी बफर के 10 मिलीलीटर में तीन बार गोली धोने । फिर किसी भी बाहुलर बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए अमीकासिन के साथ पूरक ताजा एसी बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस और 80 आरपीएम पर चार घंटे तक इनक्यूबेट करें, इसके बाद ताजा एसी बफर में दो वॉश करें। अंतिम धोने के बाद, संक्रमित अमीबा को ठंडे समाधान तीन के चार मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें, बीटा मर्केप्टोथेनॉल के 280 माइक्रोलीटर के साथ पूरक 10 मिनट के लिए बर्फ पर अमीबा को बाधित करने के लिए।इनक्यूबेशन के अंत में, जारी इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को गोली मारने के लिए सेल को अपक्त करें, और कोल्ड सॉल्यूशन थ्री के एक मिलीलीटर में बैक्टीरियल पेलेट को फिर से निलंबित करें। अमीबा आरएनए या प्रोटीज़ के साथ संदूषण से बचने के लिए सभी सुपरनेट को हटाना महत्वपूर्ण है जो नमूने बना सकते हैं। एक दूसरे अपकेंद्रित्र के साथ जारी बैक्टीरिया फसल, और फिर से निष्कर्षण बफर के एक मिलीलीटर में गोली निलंबित ।फिर नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट। माइकोबैक्टीरियल समाधान को 500 माइक्रोलीटर ग्रेडेशन मार्क तक जिरकोनियम मोतियों वाले दो मिलीलीटर स्क्रू ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और आरएनए सिन सक्रियण और सेल विघटन की सुविधा के लिए नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर एक और 24 घंटे के लिए ट्यूबों को स्टोर करें। विश्लेषण के दिन, बर्फ पर नमूनों को गल, और 25 सेकंड के लिए ६० आरपीएम पर समरूपता के दो दौर के साथ कोशिकाओं को lyse, 20 सेकंड के लिए ६००० आरपीएम पर एक दौर समरूपता के बाद ।समरूपता के प्रत्येक दौर के बीच में, आरएनए क्षरण से बचने के लिए एक मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को ठंडा करें। समरूपता के तीसरे दौर के बाद, 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को ठंडा करें, और प्रत्येक ट्यूब में आइसोअमिल अल्कोहल में पतला क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर एक मिनट के लिए, तो नमूनों अपकेंद्रित्र, और एक दो से तीन घंटे के लिए जलीय चरण में ०.८ मिलीलीटर ठंडा आइसोप्रोपैनॉल जोड़ें इनक्यूबेशन नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर ।इनक्यूबेशन के अंत में, नमूनों को फिर से अपकेंद्रित्र करें, और बिना मिश्रण के ठंडे 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर में छर्रों को धोएं। इसके बाद तुरंत सेंट्रलाइज करके इथेनॉल निकालें। एक अपकेंद्रित्र सांद्रता में छर्रों को सुखाने के लिए सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और डीएनए/आरएनए-मुक्त पानी के १०० माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें ।Mycobacterial MRNA निष्कर्षण के रूप में प्रदर्शन किया, प्रेरित और दमित जीन परिवारों के मूल्यांकन की अनुमति देता है एक पर्यावरण में सीमित यह पोषक तत्वों और खनिजों के स्रोत है, या एक हाइपोक्सिक या एक अम्लीय वातावरण के लिए जवाब में अपनी भूमिकाओं के अनुसार जीन समूहित करके । ऑक्सीडेटिव और नाइट्रोसेटिव तनाव के प्रतिरोध में, या पर्यावरण अमीबा के जवाब में उग्रता कारकों की अभिव्यक्ति में। जबकि उन प्रक्रियाओं का प्रयास, यह एक ही समय में नियंत्रित और संक्रमित नमूनों की संस्कृति और आरएनए अलगाव प्रदर्शन करने के लिए बैच प्रभाव से बचने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है ।इस प्रक्रिया के बाद, मेजबान रोगजनक बातचीत के बारे में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए दोहरी आरएनए अनुक्रमण जैसे अन्य तरीकों को पूर्व सूचित किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने अमीबा मेजबान मॉडल में माइकोबैक्टीरिया उग्रता की ओर माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त किया। यह न भूलें कि अमीबा के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, क्योंकि यदि आप प्रक्रिया में वर्णित चरणों का पालन नहीं करते हैं तो अमीबा अल्सर में बदल सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

विदारक एक मॉडल Herpesvirus की lytic प्रतिकृति में सहभागिता होस्ट वायरस

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

नमूने की तैयारी<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; परमाणु चुंबकीय अनुनाद metabolomic अध्ययन के लिए अर्क

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

के विकास माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

पैथोजन vacuoles की शुद्धि से<em&gt; लीजोनेला</em&gt; संक्रमित phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली लागू करने Intracellular संकेतन के साथ बैक्टीरियल विषैलापन कारक के हस्तक्षेप के अध्ययन करने के लिए

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

इमेजिंग रोगजनन और के मुताबिक गूढ़ रहस्य और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम abscessus</em&gt; Zebrafish भ्रूण में

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

इंट्रासेलुलर लक्ष्य निर्धारण इनहिबिटर्स की प्रभावकारिता और cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए सिस्टम<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

मैक्रोफेज के अंदर Intracellular विकास के ठहराव के डाह के आकलन के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि है Leishmania परजीवी

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...