Name: identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00
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我々 は大きく変異の貴重な贈り物の広報 E.J. ルービン (ハーバード大学医学部、ボストン、米国) を認めるライブラリ、および原稿の修正のための博士ベン マーシャル (医学部、英国・ サウザンプトン大学)。我々 は大きく金融支援 (RF20150501377) 嚢胞性線維症」Vaincre ラ Mucoviscidose「と"でグレゴリー ・ Lemarchal」のフランス語の患者会を認めます。また地方イルド フランス (ANR プログラム DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) 総合庁感謝 (ドメーヌ水利 Majeur 病気 Infectieuses et 新興階級) V.L m 員を資金調達のため。L ・ L ですから博士研究員、「ミニステール期高等エ デ ラ凝った」。

1. ライブラリのスクリーニング
<ol><li>Tn変異ライブラリーの構築
	<ol>
<li>トランスポゾンのライブラリを取得します。 注: この実験トランスポゾン変異ライブラリーは E.J. rubin 氏は、公衆衛生のハーバード学校、ボストン、米国から得られました。ライブラリは、 M. abscessus複雑な (M. abscessus病菌massiliense) のM. abscessusシングルテネシー州のラ...

<ol>
	<li>Qvist, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+harmful+effects+of+nontuberculous+mycobacteria+and+Gram+negative+bacteria+on+lung+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).</li><li>Roux, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Casta&#241;eda-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensin+Production+by+Human+Limbo-Corneal+Fibroblasts+Infected+with+Mycobacteria.">Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria.</a> Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).</li><li>Bakala N'Goma, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+abscessus+phospholipase+C+expression+is+induced+during+coculture+within+amoebae+and+enhances+M.+abscessus+virulence+in+mice.">Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+intracellular+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+human+dendritic+cells.">Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).</li><li>Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+intracellular+pathogens+by+amoebal+coculture+and+amoebal+enrichment+approaches.">Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches.</a> Journal of Visualized Experiments. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+from+clinical+specimens+via+amoebae,+and+the+interaction+of+those+and+other+isolates+with+amoebae.">Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae.</a> Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).</li><li>Moffat, J. F., Tompkins, L. 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H., L&#243;pez-Jim&#233;nez, A. T., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+Dicty+Met+Myco,+a+(Not+So)+Romantic+Story+about+One+Amoeba+and+Its+Intracellular+Pathogen.">When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).</li><li>Delafont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+amoebae-mycobacteria+association+in+drinking+water+network.">First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (20), (2014).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Mycobacterium+avium+with+environmental+amoebae+enhances+virulence.">Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence.</a> Infection and Immunity. 65 (9), (1997).</li><li>Stamm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+escapes+from+phagosomes+and+is+propelled+by+actin-based+motility.">Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).</li><li>Groschel, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis.">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).</li><li>Hsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+mechanism+of+attenuation+of+bacillus+Calmette-Guerin+is+a+loss+of+secreted+lytic+function+required+for+invasion+of+lung+interstitial+tissue.">The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+pore+formation+in+host+cell+membranes+by+ESX-1-secreted+ESAT-6+and+its+role+in+Mycobacterium+marinum+escape+from+the+vacuole.">Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis.+within+Macrophages.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).</li><li>Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Transcriptional+Profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+THP-1+Human+Macrophage+Infection.">Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection.</a> Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).</li><li>Miranda-CasoLuengo, A. 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M. abscessusの動作は、はるか RGM2に属する他のマイコ バクテリアよりも結核などの病原性の SGM の動作に似ています。SGM の病原性に重要な要素は、マクロファージなどの抗原提示細胞と樹状細胞内であっても乗算または存続する能力です。
M. abscessusは、真核生物の食細胞内で生き残るためにそのゲノム14の合計の順序...

属には菌には種無害な腐生生物から人間の主要な病原体に至るまでにはが含まれます。結核菌、抗酸菌 marinum マイコバクテリウムの ulceransなどよく知られている病原性の種は、成長の遅いのサブグループに属する抗酸菌 (SGM)。対照的に、急速な成長のサブグループ抗酸菌 (ガンダム) は寒天培地で 7 日以内に目に見えるコロニーを形成する能力によって特徴付けられます。RGM グループは以上 180 種、主に非病原性の腐生抗酸菌で構成します。彼らのホストと RGM の相互作用に関する研究アラビノースイソメラーゼに主に焦点を当てているし、マクロファージの殺菌作用によって、これらの抗酸菌が急速に除去されることを示します。
結核菌 abscessusは人間に病原性のある珍しい RGM の一つです、感染症皮膚および軟部組織感染症から肺や播種性感染症に至るまでの広い範囲を担当。M. abscessusと見なされます、マイコバクテリウム ・ アビウム、とともに嚢胞性線維症患者1のメインの抗酸菌病原体。
M. abscessusに対して様々 な研究を示すこの結核菌が細胞内の病原体、肺および RGM で通常見られない皮膚線維芽細胞とマクロファージの殺菌の応答で生存可能なように動作します。2,3,4. M. abscessusゲノム解析が環境微生物土壌との接触で一般的に見られる代謝経路を発見、植物と水生環境、無料のアメーバが多い5を提示します。M. abscessusは腐生と非病原性の RGM は、おそらく集めるかもしれない遺伝的交流に有利なニッチ市場での遺伝子の水平伝達によって買収に見つかりませんいくつかの病原性遺伝子に恵まれていることをも示しています。様々 なアメーバ耐性菌。
実験的に、最初の顕著な結果の 1 つだったM. abscessusの結核6としてもマクロファージの細胞内増殖の観察です。M. abscessusは、ファゴソーム、アポトーシス、オートファジー、感染2細胞の抵抗の 3 つの重要なメカニズムの酸性化も抵抗します。でも、 M. abscessusはファゴソームと細胞質、細菌の増殖2を好むかもしれないより栄養豊富な環境の間の直接通信を確立することが示されています。M. abscessusが所有するか、または細胞内の環境で生存できるように取得してゲノムの利点についてほとんど知られています。アメーバ共は、結核菌 massiliense7,8として多くの新しいアメーバ耐性菌の分離を許可する効率的な方法です。アメーバ内で増殖する能力は、 M. abscessusのm. abscessus4に増加病原性を授けることができるマウスでエアロゾル化のモデルで観察されました。1 つの仮説は、 M. abscessusが他の非病原性 RGM とは異なる貪食細胞で生き残るためにこの環境内で発生した遺伝形質を開発していたことです。これらの買収は、感染する能力と人間のホストに対する病原性を好むかもしれない。
このレポートでは、ツールとアメーバの環境で生き残るためにm ・ abscessusに与えられるゲノムの利点を強調する方法について説明します。この目的のためM. abscessusトランスポゾン変異体のスクリーニングは、アカント アメーバ castellanii型株の細胞内増殖の突然変異体の欠陥の識別を可能にするに、まず説明します。マクロファージの二次検診も人間のホストでこの問題が解決しないかどうかを確認する報告されました。第二に、 M. abscessus貪食での生活に適応するために利用されているどのメカニズムを理解する細胞と動物のホスト、 M. abscessus用メソッドに対する病原性は増加開発,共培養後アメーバの存在下で amoebal 内の細菌からの総 RNA の抽出を許可しています。結果として、細胞内の生活に必要なM. abscessus遺伝子の包括的なビューが開発されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">24-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">96-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Beadbeater&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Bertin</td>
			<td style="width:135px;">Precellys 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Genepulser Xcell</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Nanodrop spectrophotometer 2000</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">QuBit fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zirconium beads/silica beads</td>
			<td style="width:128px;">Biospec products</td>
			<td style="width:135px;">11079101Z</td>
			<td>Beads</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Name of reagent/cells</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acanthamoeba&#160;castellanii&#160;</td>
			<td style="width:128px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">30010</td>
			<td>strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amikacin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Mylan</td>
			<td style="width:135px;">150927-A</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M6250</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C1016</td>
			<td>&#62;93% granular anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Fluka</td>
			<td style="width:135px;">25666</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClaI enzyme</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">R0197S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:135px;">43041</td>
			<td>90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G8270&#160;</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11500596</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase and RNase free water&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">10977-035</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.&#160;coli electrocompetent&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">18265017</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E4884</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Escherichia coli&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Clinical isolate</td>
			<td style="width:135px;">personal stock</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fe(NH4)2(SO4)-6H20&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:135px;">15505-40</td>
			<td>sulfate solution 4% aqueous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10270</td>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glycerol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium thiocyanate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Euromedex</td>
			<td style="width:135px;">EU0046-D</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">I9516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774.2 macrophages</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">J774.2</td>
			<td>Strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">kanamycin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P0662</td>
			<td>Monobasic, anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB liquid medium&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12795-027</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10837059001</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Labosi</td>
			<td style="width:135px;">M275</td>
			<td>pur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Microbank TM (cryotubes with beads)</td>
			<td style="width:128px;">Pro-Lab Diagnostic</td>
			<td style="width:135px;">PL.170/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H11 medium</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0428</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H9 medium</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11753473</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M&#252;ller-Hinton agar</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td>3563901</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Lauryl-sarcosine</td>
			<td style="width:128px;">Merck</td>
			<td style="width:135px;">S37700 416</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S9390</td>
			<td>98-102%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol/chloroforme&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">77617</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">EO0491</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">211684</td>
			<td>enzymatic digest of animal tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC19 plasmid</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">54357</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS&#160; 20%</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;">1610418</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td style="width:135px;">567446</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">88810</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tris</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">154563</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>12044977</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P1754&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Kit</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMBION DNase kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>10792877</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Agilent Chip</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJET Plasmid Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">K0503</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink PCR Purification kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">K310001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-It&#34; assays kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33140/Q32884</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">Y90001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Stranded RNA LT prep kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td>15032611</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes

ヒトのマクロファージによって貪食に抵抗する能力とそのような細胞内増殖する能力は他の腐生抗酸菌から結核菌 abscessusを区別するもの。これらの病原性の特徴は、特に嚢胞性線維症、気管支拡張症、結核などの基になる構造の肺疾患脆弱なホストで、病原性M. abscessusをレンダリングします。M. abscessusと感染になる患者は不明のまま。多くの抗酸菌とは異なりM. abscessus環境で発見されていないが、アメーバ、 M. abscessusの潜在的な貯留層を表す環境食細胞の内部に存在可能性があります。確かに、 M. abscessus amoebal 貪食に耐性があるし、内アメーバ生活の感染実験モデルにおけるM. abscessus病原性を高めるようです。しかし、少しM. abscessus病原性自体について知られています。M. abscessus細胞内生活に利点を付与する遺伝子を解読するには、 M. abscessusトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングが開発されました。並行して、アメーバとの共培養後抗酸菌の細胞からの RNA 抽出法が開発されました。このメソッドは検証され全体M. abscessusの順序を許可したセル内トランスクリプトーム初めて、 M. abscessus細胞内生活適応上のグローバル ビューを提供します。両方のアプローチは私たちヒトの気道を植民地化するM. abscessusを有効にするとm. abscessus病原因子に洞察力を与えます。

M. abscessusに抵抗し、殺菌反応マクロファージやアメーバなど環境原生動物の脱出機能があります。M. abscessusはなる劇毒性のマウス4病原因子、アメーバと接触して育てられたときを表しています。これらのメソッドの最初の目標は、 M. abscessusの生存とアメーバ内で増殖可能で現在の遺伝子を識別するためにだった。
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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA から細菌細胞トランスクリプトームの決意をトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングシーケンス。両方のアプローチは、ゲノムの利点と細胞内細菌フィットネスを高めるトランスクリプトーム適応への洞察力を提供します。

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

細胞内病原体の変異ライブラリースクリーニングおよび転写学研究は、宿主の中で生き残るために使用される目的の病原体のゲノムおよび調節適応に関する重要な質問に答える助けとなる。これらの技術の主な利点は、大規模な調査技術であり、細胞内生命への適応に客観的な洞察を提供することです。これらの技術の意味は、ワクチン療法の潜在的な標的に関する洞察を与えることによって、この疾患に関連するマイコバクテリウム膿瘍の治療に及ぶ。室温で75平方センチメートルの組織培養フラスコ中のペプトン酵母グルコース培地の30ミリリットルでアメーバアカントアメーバカステラーニ、またはAcを培養することから始めます。1時間後に上清を取り除くために25ミリリットルのピペットを使用し、1回の洗浄ごとに炭素または窒素なしで10ミリリットルのAcバッファーで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、フラスコの底部からアメーバを1回の激しい揺れで外し、ファルコンチューブの細胞を、新鮮なAcバッファでミル濃度あたり5回10に5時間10回に調整します。96ウェルプレートで4つのアメーバに5回10をシードします。プレートを32°Cに32度に入れ、揺れることなく1時間置き、浮遊するアメーバの栄養画虫が井戸に付着できるようにします。一方、氷上の細菌を温め、解凍した細菌の5マイクロリットルをインキュベーションの終わりに各ウェルに加えます。摂氏32度で1.5時間後、フュームフードの下の滅菌された金属トレイの滅菌ガーゼの積み重ねにプレートを反転させて上清を捨てます。1ウェルあたり200マイクロリットルの新鮮なAc培地でそれぞれ3回洗います。最後の洗浄後、アミカシンを1ウェルあたり20マイクロリットルの新鮮培地で共培養し、残りの細胞外マイコバクテリアを2時間排除する。ちょうど実証したように、新鮮なAc培地で3回のスッシュが続きます。次いで、200マイクロリットルの培地を加え、各ウェルに新鮮なアミカシンを加え、続いて7回の熱不活化大腸菌に10回5倍を加えた。48時間後、1ウェルあたり10%のドデシル硫酸ナトリウム10マイクロリットルで細胞を融解し、摂氏32度で30分間、5%の羊の血液を含むコロンビア寒天プレートに5マイクロリットルのライセートを広げる。さらに、各滴に25マイクロリットルの無菌水を加えてライセートを希釈する。すべてのライセートがメッキされたら、プラスチックパラフィンフィルムでプレートを密封し、37°Cで3〜4日間培養をインキュベートします。プレートにコロニーが現れたときには、培養物を撮影し、細菌コロニーの数が最も少ない堆積物によって細胞内増殖のために損なわれる変異体を特定する。細胞内抗酸菌RNA抽出のために、最初にグリセロールとグルコースを添加した7H9培地でM.膿瘍を120RPMで50ミリリットルチューブ中の中指数相に成長させます。培養終了時に、1回1回10ミリリットルのAcバッファーで細菌を2回洗浄し、O.D.600を測定して細菌濃度を推定する。次に、8つのマイコバクテリアに8.5倍の10を加え、新鮮なAc培地の10ミリリットルで6つのアメーバに30°Cと80 RPMで1時間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収穫し、同じ遠心分離条件下で洗浄ごとに新鮮なAcバッファーの10ミリリットルで3回ペレットを洗浄する。その後、アミカシンを補充した新鮮なAcバッファーの10ミリリットルで細胞を再中断して細胞外細菌を排除し、摂氏30度と80RPMで4時間培養し、続いて新鮮なAcバッファーで2回のスケを行います。最後の洗浄後、感染したアメーバを4ミリリットルの冷たい溶液3に再び中断し、280マイクロリットルのベータメルカプトエタノールを補い、氷上のアメーバを10分間破壊する。インキュベーションの終わりに、細胞溶解物を遠心分離して細胞内細菌をペレット化し、細菌ペレットを1ミリリットルの冷水溶液3で再懸濁する。サンプルを作った可能性のあるアメーバRNAまたはプロテアーゼによる汚染を避けるために、すべての上清を除去することが重要です。第2遠心分離で放出された細菌を収穫し、抽出バッファーの1ミリリットルにペレットを再中断します。その後、マイナス80度で24時間インキュベートします。500マイクロリットルのグラデーションマークまでジルコニウムビーズを含む2つのミリリットルねじ管にマイコバクテリア溶液を移し、RNAシン活性化と細胞溶解を容易にするために、さらに24時間マイナス80°Cでチューブを貯蔵します。分析の日に、氷上のサンプルを解凍し、25秒間6000 RPMで2ラウンドの均質化で細胞をライセ化し、続いて6000 RPMで20秒間均質化した。均質化の各ラウンドの間に、RNAの分解を避けるために氷上のサンプルを1分間冷却します。第3ラウンドの均質化後、氷上でサンプルを20分間冷却し、各チューブにイソアミルアルコールで希釈したクロロホルム200マイクロリットルを加えます。ボルテックスを1分間ボルテックスし、サンプルを遠心分離し、0.8ミリリットルの冷たいイソプロパノールを水相に加え、2〜3時間の摂氏マイナス20度でインキュベーションします。インキュベーションの終わりに、再度サンプルを遠心分離し、混合することなく500マイクロリットルの冷たい70%エタノールでペレットを洗浄する。その後、直ちに遠心分離によりエタノールを除去する。遠心濃縮器でペレットを乾燥させる上清を吸引し、100マイクロリットルのDNA/RNAフリー水でペレットを再懸濁します。実証されているように、筋の入ったMRNA抽出は、栄養源やミネラルの供給源に限られた環境、または低酸素または酸性環境に対応する役割に従って遺伝子をグループ化することにより、誘導および抑圧された遺伝子ファミリーの評価を可能にする。酸化およびニトロス的ストレスに対する耐性において、または環境アメーバに応答する毒性因子の発現において。これらの手順を試みる間、バッチ効果を避けるために、制御された感染したサンプルの培養とRNAの分離を同時に行うことを覚えておくことが重要です。この手順に従って、二重RNAシーケンシングのような他の方法は、宿主病原体相互作用に関する追加の質問に答えるために前形化することができる。開発後、この技術は、アメーバホストモデルにおけるマイコバクテリア病原性に向けて微生物学の分野の研究者のための道を開いた。手順に記載されている手順に従わない場合、アメーバは嚢胞に変身する可能性があるため、Amoebaeを使用することは非常に危険である可能性があることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...