Name: identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes at JoVE.com

우리는 크게 돌연변이의 귀중 한 선물에 대 한 홍보 E.J. 루빈 (하버드의과 대학, 보스톤, 미국)를 인정 도서관과 원고의 교정에 대 한 닥터 벤 마샬 (의 학부, 사우스 햄튼 대학, 영국). 우리가 크게 그들의 재정 지원 (RF20150501377)에 대 한 낭 성 섬유 증 "Vaincre 라 Mucoviscidose" 및 "L'Association 그레고리 Lemarchal" 프랑스 환자 협회를 인정합니다. 우리 또한 감사 국립 기관 연구 (ANR 프로그램 DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d'Intérêt Majeur 외관 Infectieuses 동부 표준시 Emergentes) V.L m 박사 후 친목을 자금. L. L.는에서 박사 동료는 "Ministère de L'Enseignement Supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche".

1. 라이브러리 심사
<ol><li>테네시 돌연변이 도서관의 건설
	<ol>
<li>Transposon 라이브러리를 가져옵니다. 참고:이 실험을 위해 transposon 돌연변이 라이브러리 E.J. 루빈, 하버드 대학 공중 보건의, 보스톤, 미국에서 얻은 했다. 도서관은 phagemid M. abscessus 단일 Tn의 임의 삽입 허용에 도입 된는 M. abscessus 복잡 한 (M. abscessus subsp. massiliense)의 부드러운 임상...

<ol>
	<li>Qvist, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+harmful+effects+of+nontuberculous+mycobacteria+and+Gram+negative+bacteria+on+lung+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).</li><li>Roux, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Casta&#241;eda-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensin+Production+by+Human+Limbo-Corneal+Fibroblasts+Infected+with+Mycobacteria.">Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria.</a> Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).</li><li>Bakala N'Goma, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+abscessus+phospholipase+C+expression+is+induced+during+coculture+within+amoebae+and+enhances+M.+abscessus+virulence+in+mice.">Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+intracellular+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+human+dendritic+cells.">Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).</li><li>Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+intracellular+pathogens+by+amoebal+coculture+and+amoebal+enrichment+approaches.">Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches.</a> Journal of Visualized Experiments. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+from+clinical+specimens+via+amoebae,+and+the+interaction+of+those+and+other+isolates+with+amoebae.">Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae.</a> Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).</li><li>Moffat, J. F., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+intracellular+growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii.">A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii.</a> Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Choo, S. 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H., L&#243;pez-Jim&#233;nez, A. T., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+Dicty+Met+Myco,+a+(Not+So)+Romantic+Story+about+One+Amoeba+and+Its+Intracellular+Pathogen.">When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).</li><li>Delafont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+amoebae-mycobacteria+association+in+drinking+water+network.">First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (20), (2014).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Mycobacterium+avium+with+environmental+amoebae+enhances+virulence.">Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence.</a> Infection and Immunity. 65 (9), (1997).</li><li>Stamm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+escapes+from+phagosomes+and+is+propelled+by+actin-based+motility.">Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).</li><li>Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESX+secretion+systems:+mycobacterial+evolution+to+counter+host+immunity.">ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).</li><li>Pym, A. 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A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+Mycobacterium+abscessus+genome+coupled+with+condition+specific+transcriptomics+reveals+conserved+molecular+strategies+for+host+adaptation+and+persistence.">Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence.</a> BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).</li></ol>

M. abscessus 동작은 RGM2에 속하는 다른 mycobacteria 보다 M. 결핵 등 병원 성 SGM의 행동에 훨씬 더 비슷합니다. SGM의 pathogenicity에 핵심 요소 생존 또는 심지어 대 식 세포와 같은 항 원 제시 세포와 수지상 세포 내에서 증식 하는 능력입니다.
M. abscessus 진 핵 phagocytic 세포 내에서 살아남기 위해 그것의 게놈14 의 전체 순서에 의해...

속 진 균 종 무해 마저 유기 체에서 주요 인간 병원 체에 이르기까지 포함 되어 있습니다. 결핵균, 진 균 marinum 진 균 ulcerans 등 잘 알려진 병원 성 종 느린 성장의 하위 그룹에 속하는 mycobacteria (SGM). 반면, 급속 한 성장 비율 mycobacteria (RGM) 한 천 매체에 7 일 이내에 보이는 식민지를 형성 하는 그들의 기능에 의해 특징입니다. RGM 그룹 이상 180 종, 비 병원 성 마저 mycobacteria 주로 구성 되어 있습니다. RGM 그들의 호스트와 상호 작용에 대 한 연구는 주로 진 균 smegmatis 에 초점을 맞춘을 이러한 mycobacteria 대 식 세포의 살 균 작용에 의해 빠르게 제거 됩니다 설명.
진 균 abscessus 병원 성 인 간에 게는 드문 RGM 중 하나 이며 다양 한 피부 및 연 조직 감염에서 폐와 전파 감염에 이르기까지 감염에 대 한 책임입니다. M. abscessus 가 간주, 진 균 avium, 함께 낭 성 섬유 증 환자1주 mycobacterial 병원 체.
M. abscessus 에 수행 하는 다양 한 학문이 진이 균은 세포내 병원 체, 세포와 폐에 RGM에서 일반적으로 관찰 되지 않는 피부 섬유 아 세포의 살 균 응답 살아남을 수 있는 처럼 동작 표시 2 , 3 , 4. M. abscessus 게놈 분석 환경 미생물 토양 접촉에서 일반적으로 발견 하는 대사 경로 확인 했다, 식물 및 수 중 환경, 무료 amoebae는 종종 제시5. 그들은 또한 M. abscessus 수집 수 유전 교환에 유리한 틈새에서 수평 한 유전자 이동에 의하여 아마 인수 마저 및 비 병원 성 RGM에 없는 여러 가지 독성 유전자에 어우러진 시연 했다 다양 한 아메바 내성 박테리아입니다.
실험적으로, 첫 번째 눈에 띄는 결과 중 하나는 M. 결핵6에 관해서는 뿐만 아니라 세포에서 세포내 성장의 M. abscessus 관찰 했다. M. abscessus 또한 phagosome apoptosis, autophagy, 감염2에 세포질 저항의 세 가지 필수적인 메커니즘 산성화 저항. 그것은 심지어 M. abscessus 는 phagosome cytosol, 세균성 곱하기2를 선호 수 있습니다 더 많은 영양분이 풍부한 환경 간의 즉각적인 통신을 설정할 수가 표시 되었습니다. 아주 작은 게놈 장점 M. abscessus 소유 또는 세포내 환경에서 생존을 허용 하는 인수에 대 한 알려져 있다. 아메바 coculture 진 균 massiliense7,8로 많은 새로운 아메바 내성 세균의 분리를 허용 하는 효율적인 방법입니다. Amoebae 내에서 증식 하는 능력의 M. abscessus4증가 독성 부여 수 쥐에 M. abscessus 에의 aerosolization 모델에 관찰 되었다. 1 개의 가설은 이다 M. abscessus phagocytic 세포, 다른 비 병원 성 RGM 다른에서 살아남기 위해이 환경 내에서 발생 하는 유전 특성을 개발 했다. 이러한 인수 능력을 확산과 인간의 호스트의 독성 부탁 수 있습니다.
이 보고서에는 도구와 amoebae 환경에서 살아남으려면 M. abscessus 에 수 여 하는 게놈 장점 강조 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적에 대 한 M. abscessus transposon 돌연변이의 심사는 처음 설명, Acanthamoeba castellanii 유형 변형, 세포 성장에 대 한 돌연변이 결함 식별 수 있는에. 대 식 세포에서 두 번째 심사는이 결함 인간의 호스트에서 지속 되는지 확인 하, 또한 보고 됩니다. 둘째, 이해 하는 메커니즘은 M. abscessus phagocytic 생활 적응에 무력화 세포 및 동물의 호스트, 특별히 M. abscessus 에 대 한 적응 방법에에서 그것의 독성은 증가 개발, 공동 문화 후 amoebae 존재 하는 내부 amoebal 박테리아에서 총 RNA 추출 허용. 결과적으로, 세포내 생명에 필요한 M. abscessus 유전자의 포괄적인 보기 개발 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">24-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">96-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Beadbeater&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Bertin</td>
			<td style="width:135px;">Precellys 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Genepulser Xcell</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Nanodrop spectrophotometer 2000</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">QuBit fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zirconium beads/silica beads</td>
			<td style="width:128px;">Biospec products</td>
			<td style="width:135px;">11079101Z</td>
			<td>Beads</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Name of reagent/cells</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acanthamoeba&#160;castellanii&#160;</td>
			<td style="width:128px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">30010</td>
			<td>strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amikacin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Mylan</td>
			<td style="width:135px;">150927-A</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M6250</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C1016</td>
			<td>&#62;93% granular anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Fluka</td>
			<td style="width:135px;">25666</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClaI enzyme</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">R0197S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:135px;">43041</td>
			<td>90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G8270&#160;</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11500596</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase and RNase free water&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">10977-035</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.&#160;coli electrocompetent&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">18265017</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E4884</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Escherichia coli&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Clinical isolate</td>
			<td style="width:135px;">personal stock</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fe(NH4)2(SO4)-6H20&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:135px;">15505-40</td>
			<td>sulfate solution 4% aqueous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10270</td>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glycerol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium thiocyanate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Euromedex</td>
			<td style="width:135px;">EU0046-D</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">I9516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774.2 macrophages</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">J774.2</td>
			<td>Strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">kanamycin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P0662</td>
			<td>Monobasic, anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB liquid medium&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12795-027</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10837059001</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Labosi</td>
			<td style="width:135px;">M275</td>
			<td>pur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Microbank TM (cryotubes with beads)</td>
			<td style="width:128px;">Pro-Lab Diagnostic</td>
			<td style="width:135px;">PL.170/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H11 medium</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0428</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H9 medium</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11753473</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M&#252;ller-Hinton agar</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td>3563901</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Lauryl-sarcosine</td>
			<td style="width:128px;">Merck</td>
			<td style="width:135px;">S37700 416</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S9390</td>
			<td>98-102%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol/chloroforme&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">77617</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">EO0491</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">211684</td>
			<td>enzymatic digest of animal tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC19 plasmid</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">54357</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS&#160; 20%</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;">1610418</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td style="width:135px;">567446</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">88810</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tris</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">154563</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>12044977</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P1754&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Kit</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMBION DNase kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>10792877</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Agilent Chip</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJET Plasmid Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">K0503</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink PCR Purification kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">K310001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-It&#34; assays kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33140/Q32884</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">Y90001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Stranded RNA LT prep kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td>15032611</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes

인간 대 식 세포에 의해 식 균 작용을 저항 하는 기능 및 이러한 셀 안에 번 식 능력은 다른 마저 mycobacteria에서 진 균 abscessus 차별화. 이러한 독성 특성 기본 구조 폐 질환, 낭 성 섬유 증, 기관지 확장 증, 결핵 등으로 취약 한 호스트에서 특히 병원 성 M. abscessus 를 렌더링합니다. 어떻게 환자 M. abscessus 감염 될 불분명 남아 있습니다. 많은 mycobacteria 달리 M. abscessus 환경에서 찾을 수 없습니다 하지만 amoebae, M. abscessus에 대 한 잠재적인 저수지를 나타내는 환경 식 세포 안에 있는 수 있습니다. 실제로, M. abscessus amoebal 식 균 작용에 저항 이며 내 아메바 인생 감염의 실험 모델에서 M. abscessus 독성을 증가 것으로 보인다. 그러나, 약간 그 자체에 M. abscessus 독성에 대 한 알려져 있다. M. abscessus 세포내 생활 이점이 부여 하는 유전자를 해독, M. abscessus transposon 돌연변이 라이브러리의 심사는 개발 되었다. 병렬로 amoebae 공동 문화 후 세포내 Mycobacteria에서 RNA 추출의 방법 개발 되었다. 이 메서드는 검증 되었고 전체 M. abscessus 의 시퀀싱을 허용 세포; 내부 transcriptomes 처음으로, 세포내 생활에 적응 하는 M. abscessus 에 글로벌 보기를 제공합니다. 두 방법 모두 인간의 기도 식민지로 M. abscessus 있도록 M. abscessus 독성 요인에 대 한 통찰력 주세요.

M. abscessus 저항 하 고 대 식 세포와 같은 amoebae 환경 원생 동물의 살 균 응답을 탈출 하는 기능이 있다. M. abscessus 는 악성에 게 쥐4독성 요인을 amoebae, 접촉 성장 될 때 표현 한다. 이러한 방법의 첫 번째 목적은 M. abscessus 그것의 생존 및 곱셈 amoebae 내에 존재 하는 유전자를 확인 했다.
이 위?...

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

여기, 선물이 식-진 균 abscessus 상호 작용을 공부 하는 두 개의 프로토콜: 세균 세포내 결핍 및 RNA에서 세균 세포내 transcriptome 결정 transposon 돌연변이 라이브러리의 심사 시퀀싱. 두 방법 모두 게놈 장점과 transcriptomic 적응 세포내 박테리아 체력 향상에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

생리성 병원체의 돌연변이 도서관 검열 및 전사 연구는 호스트 내부에서 살아남기 위하여 이용되는 관심있는 병원체의 게놈 그리고 규정 적응에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 대규모 조사 기술이며 세포 내 수명에 대한 적응에 대한 객관적인 통찰력을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 백신 치료를 위한 잠재적인 표적에 통찰력을 줌으로써 이 질병에 연관되는 Mycobacterium 농양의 치료로 확장됩니다.75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에서 펩톤 효모 포도당 배지의 30 밀리리터에서 아메바 아칸타모에바 카스텔라니 또는 Ac를 배양하여 시작합니다. 1시간 후에 25 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 세척당 탄소 또는 질소없이 Ac 버퍼 10 밀리리터로 세포를 세 번 씻습니다. 마지막 세척 후, 플라스크 의 바닥에서 아메바를 하나의 격렬한 흔들림으로 분리하고 팔콘 튜브에서 세포를 5회 10일 원당 5개의 아메배 농도로 조정한다.96웰 플레이트에서 잘 당 4 개의 아메배에 5 번 10 번 시드. 부동 아메바 트로포 -zoites 우물에 부착 할 수 있도록, 흔들리지 않고 1 시간 동안 섭씨 32도에 접시를 배치합니다. 한편, 얼음에 박테리아를 따뜻하게하고, 배양의 끝에 각각 잘 해동 박테리아의 다섯 마이크로 리터를 추가합니다.섭씨 32도에서 1.5시간 후에는 연기를 후지 아래 멸균된 금속 트레이에 멸균 거즈 더미에 접시를 뒤집어 서판을 버리십시오. 잘 세 번 씻어 200 마이크로 리터의 신선한 Ac 중간 개당. 마지막 세척 후, 2 시간 동안 남아있는 세포 외 균진을 제거하기 위해, 잘 당 amikacin으로 보충 신선한 매체의 20 마이크로 리터와 공동 배양.그 다음에는 신선한 Ac 매체에 세 번의 세 가지 세가지 세정이 이어졌습니다. 그런 다음, 매질의 200 마이크로리터를 첨가하고, 신선한 아키카신으로 보충한 다음, 7개의 열 불활성 에슈리치아 대장균 균에 5회 10회 첨가하였다. 48시간 후, 10마이크로리터의 10마이크로리터를 음파10% 나트륨 으로 세포로 리세우하고, 섭씨 32도에서 30분 동안, 5%의 양피를 함유한 컬럼비아 아가 플레이트에 용액5마이크로리터를 퍼뜨리고 있다.또한 각 낙하시에 멸균 수의 25 마이크로 리터를 추가하여 lysates를 희석. 모든 용하가 도금되면 플라스틱 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 37도에서 3 ~ 4 일 동안 문화를 배양하십시오. 식민지가 접시에 나타날 때, 문화를 촬영하고 세균 성 식민지의 가장 낮은 수의 예금에 의해 세포 내 성장을 위해 손상된 돌연변이를 식별합니다.세포 내 진균 RNA 추출을 위해, 먼저 120 RPM에서 50 밀리리터 튜브에서 중간 기하급수적인 단계로 글리세롤과 포도당으로 보충된 7H9 배지에서 M.농양을 성장시다. 배양의 끝에서, 세척당 Ac 버퍼10 밀리리터로 박테리아를 두 번 세척하고 O.D.600을 측정하여 박테리아 농도를 추정한다. 다음으로, 8개의 진균에 8.5배 10번을 추가하여 8.5배 10배, 6개의 아메배에 10밀리리터의 신선한 Ac 배지를 1시간 동안 30도, RPM 80°C로 첨가한다.인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수확하고, 동일한 원심 분리 조건하에서 세척 당 신선한 Ac 버퍼의 10 밀리리터에 펠릿을 세 번 세척. 그런 다음 세포 외 균을 제거하기 위해 amikacin으로 보충 된 신선한 Ac 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 30 섭씨 및 80 RPM에서 4 시간 동안 세포를 배양한 다음 신선한 Ac 버퍼에서 두 개의 세서히를 넣습니다. 마지막 세척 후, 감염된 아메배는 3밀리리터의 4밀리리터로 다시 중단하여 베타 메르카토에탄올 280마이크로리터로 보충하여 10분 동안 얼음에 아메배를 방해합니다.인큐베이션의 끝에서, 세포 용액을 원심분리하여 방출된 세포내 박테리아를 펠릿으로 만들고, 감기 용액 3의 1밀리리터에서 세균성 펠릿을 다시 중단한다. 시료를 만들었을 수도 있는 아메바 RNA 또는 프로테아제로 오염을 피하기 위해 모든 상체를 제거하는 것이 중요합니다. 방출된 박테리아를 두 번째 원심분리로 수확하고 추출 버퍼의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.그런 다음 음의 80도에서 24 시간 동안 배양하십시오. 진균용액을 지르코늄 구슬을 포함하는 2개의 밀리리터 나사 튜브로 500 마이크로리터 그라데이션 마크까지 옮기고, RNA syn 활성화 및 세포 용해를 용이하게 하기 위해 음수 80도에서 24시간 동안 튜브를 저장한다. 분석 당일, 얼음에 샘플을 해동하고, 25초 동안 6000 RPM에서 2라운드 균질화로 세포를 용해시키고, 그 다음에 6000 RPM에서 20초 동안 1라운드 균질화됩니다.각 균일화 라운드 사이에 RNA 분해를 피하기 위해 얼음에 샘플을 1분 동안 식힙니다. 제3차 균질화 후, 얼음에 샘플을 20분 간 식히고, 각 튜브에 이소아밀 알코올로 희석된 클로로폼 200마이크로리터를 첨가한다. 1 분 동안 소용돌이, 다음 원심 분리 샘플을, 음의 20섭씨에서 2 ~ 3 시간 배양에 대한 수성 단계에 감기 이소 프로파놀의 0.8 밀리리터를 추가합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심 분리시 샘플을 다시, 혼합하지 않고 차가운 70 %의 마이크로 리터의 500 마이크로 리터에 펠릿을 세척. 그런 다음 원심 분리로 에탄올을 즉시 제거합니다. 원심 농축기에서 펠릿을 건조시키기 위한 상퍼를 흡인하고, DNA/RNA 가 없는 물의 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.입증된 바와 같이 균균 MRNA 추출은 영양소와 미네랄의 공급원, 또는 저산소 또는 산성 환경에 제한되는 환경에 대응하는 역할에 따라 유전자를 그룹화하여 유도및 억압된 유전자 가족의 평가를 허용합니다. 산화 및 질산 스트레스에 대한 저항성, 또는 환경 아메바에 대한 응답으로 독성 요인의 발현. 그 절차를 시도하는 동안, 배치 효과를 피하기 위해 동시에 제어 및 감염된 샘플의 배양 및 RNA 절연을 수행하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 듀얼 RNA 염기서열 분석 같은 다른 방법은 호스트 병원체 상호 작용에 대 한 추가 질문에 대답 하기 위해 미리 형성 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 아메바 호스트 모형에 있는 진균 독성을 향해 미생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 아메바와 함께 일하는 것은 절차에 설명된 단계를 따르지 않으면 아메배가 낭종으로 변할 수 있으므로 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

연구

면역학 및 감염병학

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...