Name: identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes at JoVE.com

Reconhecemos grandemente PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, EUA) para o dom precioso do mutante biblioteca e o Dr. Ben Marshall (Faculdade de medicina, Universidade de Southampton, Reino Unido) para as correções do manuscrito. Muito reconhecemos associação francesa do paciente para fibrose cística "Vaincre la Mucoviscidose" e "L'Association Gregory Lemarchal" pelo apoio financeiro (RF20150501377). Agradecemos também a Agência Nacional para a investigação (programa ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) e a modernização de Région (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) para o financiamento a postdoctoral fellowship para V.I.C.T.I.M.S.W.V.-M. L. L. é um colega de doutorado do "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

1. Biblioteca triagem
<ol><li>Construção da biblioteca mutante Tn
	<ol>
<li>Obter uma biblioteca de transposon. Nota: Para este experimento, uma biblioteca de transposon mutant foi obtida E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, EUA. A biblioteca foi construída de uma suave tensão clínica (43S) da M. abscessus complexo (M. abscessus subsp. massiliense) com um phagemid introduzido por M. abscessus , permitindo a inserção aleatória de um...

<ol>
	<li>Qvist, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+harmful+effects+of+nontuberculous+mycobacteria+and+Gram+negative+bacteria+on+lung+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).</li><li>Roux, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Casta&#241;eda-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensin+Production+by+Human+Limbo-Corneal+Fibroblasts+Infected+with+Mycobacteria.">Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria.</a> Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).</li><li>Bakala N'Goma, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+abscessus+phospholipase+C+expression+is+induced+during+coculture+within+amoebae+and+enhances+M.+abscessus+virulence+in+mice.">Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+intracellular+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+human+dendritic+cells.">Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).</li><li>Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+intracellular+pathogens+by+amoebal+coculture+and+amoebal+enrichment+approaches.">Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).</li><li>Ad&#233;kambi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+coculture+of+"Mycobacterium+massiliense"+sp.+nov.+from+the+sputum+of+a+patient+with+hemoptoic+pneumonia.">Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).</li><li>Rubin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transposition+of+mariner-based+elements+in+enteric+bacteria+and+mycobacteria.">In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).</li><li>Laencina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+Mycobacterium+abscessus+growth+in+vivo+with+a+prominent+role+of+the+ESX-4+locus.">Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+from+clinical+specimens+via+amoebae,+and+the+interaction+of+those+and+other+isolates+with+amoebae.">Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae.</a> Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).</li><li>Moffat, J. F., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+intracellular+growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii.">A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii.</a> Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).</li><li>Ripoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+mycobacterial+virulence+genes+in+the+genome+of+the+emerging+pathogen+Mycobacterium+abscessus.">Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus.</a> Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).</li><li>Choo, S. 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H., L&#243;pez-Jim&#233;nez, A. T., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+Dicty+Met+Myco,+a+(Not+So)+Romantic+Story+about+One+Amoeba+and+Its+Intracellular+Pathogen.">When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).</li><li>Delafont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+of+amoebae-mycobacteria+association+in+drinking+water+network.">First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network.</a> Environmental Science &amp; Technology. 48 (20), (2014).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Mycobacterium+avium+with+environmental+amoebae+enhances+virulence.">Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence.</a> Infection and Immunity. 65 (9), (1997).</li><li>Stamm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+escapes+from+phagosomes+and+is+propelled+by+actin-based+motility.">Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).</li><li>Groschel, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis.">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).</li><li>Hsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+mechanism+of+attenuation+of+bacillus+Calmette-Guerin+is+a+loss+of+secreted+lytic+function+required+for+invasion+of+lung+interstitial+tissue.">The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+pore+formation+in+host+cell+membranes+by+ESX-1-secreted+ESAT-6+and+its+role+in+Mycobacterium+marinum+escape+from+the+vacuole.">Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis.+within+Macrophages.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).</li><li>Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Transcriptional+Profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+THP-1+Human+Macrophage+Infection.">Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection.</a> Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).</li><li>Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+Mycobacterium+abscessus+genome+coupled+with+condition+specific+transcriptomics+reveals+conserved+molecular+strategies+for+host+adaptation+and+persistence.">Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence.</a> BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).</li></ol>

O comportamento de M. abscessus é muito mais semelhante ao comportamento da SGM patogénico, tais como M. tuberculosis do que qualquer outras micobactérias pertencentes a RGM2. O elemento chave na patogenicidade de SGM é sua capacidade de sobreviver ou até mesmo se multiplicam dentro de células apresentadoras de antígeno, tais como macrófagos e células dendríticas.
M. abscessus adquiriu certas vantagens genômicas como mostrado pela s...

O gênero Mycobacterium inclui espécies que variam de organismos saprófitas inofensivos a principais patógenos humanos. Espécies patogénicas well-known tais como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans pertencem ao subgrupo de crescimento lento micobactérias (SGM). Em contraste, o subgrupo de rápido crescimento micobactérias (RGM) caracteriza-se pela sua capacidade de formar colônias visíveis em menos de 7 dias em ágar-ágar. O grupo RGM abrange mais de 180 espécies, principalmente de não-patogênicas micobactérias saprófitas. Estudos sobre RGM as interações com seus hospedeiros principalmente focado na Mycobacterium smegmatis e demonstram que estas micobactérias são rapidamente eliminadas pela ação bactericida dos macrófagos.
Mycobacterium abscessus é um do RGM rara que são patogénicas para os seres humanos e é responsável por uma vasta gama de infecções, que variam de pele e infecções de tecidos moles para as infecções pulmonares e disseminadas. M. abscessus é considerado, juntamente com Mycobacterium avium, o principal patógeno micobacteriana em pacientes de fibrose cística1.
Vários estudos realizados na M. abscessus indicam que este mycobacterium se comporta como um patógeno intracelular, capaz de sobreviver a resposta bactericida de macrófagos e fibroblastos nos pulmões e pele, o que não é normalmente observada em RGM 2 , 3 , 4. análise do genoma de M. abscessus identificou vias metabólicas, tipicamente encontradas em microrganismos ambientais em contacto com o solo, plantas e ambientes aquáticos, onde livre amebas são frequentemente presentes5. Eles também têm demonstrado que M. abscessus é dotado de vários genes de virulência não encontrados no RGM não-patogênicas e Saprófita, provavelmente adquirida pela transferência horizontal de genes em um nicho favorável a troca genética que pode reunir várias bactérias resistentes a ameba.
Experimentalmente, um dos primeiros resultados marcantes foi a observação de crescimento intracelular de M. abscessus em macrófagos, bem como para M. tuberculosis6. M. abscessus também resiste a acidificação do fagossoma, apoptose e autofagia, três mecanismos essenciais da resistência à infecção2celular. Ainda mostrou que a M. abscessus é capaz de estabelecer uma comunicação imediata entre o fagossoma e o citoplasma, um ambiente mais rico em nutrientes que pode favorecer a multiplicação bacteriana2. Muito pouco é conhecido sobre as vantagens de genômicas que M. abscessus possui ou adquiriu para permitir a sobrevivência em um ambiente intracelular. Coculture ameba é um método eficiente que permitiu o isolamento de muitas novas bactérias resistentes a ameba como Mycobacterium massiliense7,8. A capacidade de se multiplicar dentro de amebas observou-se, em um modelo de clorofórmio de M. abscessus em ratos, que pode conferir uma maior virulência de M. abscessus4. Uma hipótese é que a M. abscessus desenvolveram características genéticas encontradas dentro deste ambiente para sobreviver nas células fagocíticas, que são diferentes das outra RGM não patogénicas. Essas aquisições podem favorecer a capacidade de se espalhar e sua virulência no hospedeiro humano.
Este relatório descreve ferramentas e métodos para destacar as vantagens de genômicas conferidas para M. abscessus para sobreviver no ambiente de amebas. Para este efeito, a seleção de mutantes de transposon M. abscessus é descrita pela primeira vez, na estirpe do tipo a Acanthamoeba castellanii , que permite a identificação de defeituoso do mutante para crescimento intracelular. Uma segunda triagem em macrófagos também é relatada, para confirmar se esse defeito persiste no hospedeiro humano. Em segundo lugar, para entender que mecanismos são aproveitados em M. abscessus se adaptar à vida em fagocíticas células e aumentar sua virulência no animal de acolhimento, um método especificamente adaptado para M. abscessus foi desenvolveram, depois da co-cultura na presença de amebas que permitiu a extração de RNA total de bactérias intra-amoebal. Como consequência, uma visão abrangente de M. abscessus genes que são necessários para uma vida intracelular foi desenvolvida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">24-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">96-well plates</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Beadbeater&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Bertin</td>
			<td style="width:135px;">Precellys 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Genepulser Xcell</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Nanodrop spectrophotometer 2000</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">QuBit fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zirconium beads/silica beads</td>
			<td style="width:128px;">Biospec products</td>
			<td style="width:135px;">11079101Z</td>
			<td>Beads</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:341px;">Name of reagent/cells</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acanthamoeba&#160;castellanii&#160;</td>
			<td style="width:128px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">30010</td>
			<td>strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amikacin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Mylan</td>
			<td style="width:135px;">150927-A</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M6250</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C1016</td>
			<td>&#62;93% granular anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Fluka</td>
			<td style="width:135px;">25666</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClaI enzyme</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">R0197S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:135px;">43041</td>
			<td>90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G8270&#160;</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11500596</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase and RNase free water&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">10977-035</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.&#160;coli electrocompetent&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">18265017</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E4884</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Escherichia coli&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Clinical isolate</td>
			<td style="width:135px;">personal stock</td>
			<td>bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fe(NH4)2(SO4)-6H20&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:135px;">15505-40</td>
			<td>sulfate solution 4% aqueous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10270</td>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glycerol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium thiocyanate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Euromedex</td>
			<td style="width:135px;">EU0046-D</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">I9516</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774.2 macrophages</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">J774.2</td>
			<td>Strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">kanamycin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P0662</td>
			<td>Monobasic, anhydrous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB liquid medium&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12795-027</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:128px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10837059001</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Labosi</td>
			<td style="width:135px;">M275</td>
			<td>pur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Microbank TM (cryotubes with beads)</td>
			<td style="width:128px;">Pro-Lab Diagnostic</td>
			<td style="width:135px;">PL.170/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H11 medium</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0428</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Middlebrook 7H9 medium</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">11753473</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M&#252;ller-Hinton agar</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td>3563901</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Lauryl-sarcosine</td>
			<td style="width:128px;">Merck</td>
			<td style="width:135px;">S37700 416</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S9390</td>
			<td>98-102%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol/chloroforme&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">77617</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">EO0491</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">211684</td>
			<td>enzymatic digest of animal tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC19 plasmid</td>
			<td style="width:128px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">54357</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS&#160; 20%</td>
			<td style="width:128px;">Biorad</td>
			<td style="width:135px;">1610418</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td style="width:135px;">567446</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">88810</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Tris</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">154563</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>12044977</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P1754&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:135px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Kit</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMBION DNase kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td>10792877</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Agilent Chip</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJET Plasmid Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">K0503</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink PCR Purification kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">K310001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-It&#34; assays kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:135px;">Q33140/Q32884</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">Y90001</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Stranded RNA LT prep kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td>15032611</td>
			<td>kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of virulence markers of mycobacterium abscessus for intracellular replication in phagocytes

O que diferencia outras micobactérias saprófitas Mycobacterium abscessus é a capacidade de resistir a fagocitose por macrófagos humanos e a capacidade de se multiplicar no interior dessas células. Essas características de virulência processam M. abscessus patogênicos, especialmente em hosts vulneráveis com doença pulmonar estrutural subjacente, como fibrose cística, Bronquiectasia ou tuberculose. Como a doentes infectados com M. abscessus permanece obscuro. Ao contrário de muitos micobactérias, M. abscessus não é encontrado no ambiente, mas pode residir dentro as amebas, fagócitos ambientais que representam um potencial reservatório para M. abscessus. Com efeito, M. abscessus é resistente à fagocitose amoebal e a vida intra-ameba parece aumentar a virulência do M. abscessus em um modelo experimental de infecção. No entanto, pouco é conhecido sobre a virulência do M. abscessus em si. Para decifrar os genes que conferem uma vantagem para M. abscessus vida intracelular, uma triagem de uma biblioteca de mutante de transposon M. abscessus foi desenvolvida. Em paralelo, foi desenvolvido um método de extração de RNA de micobactérias intracelulares após co-cultura com amebas. Este método foi validado e permitiu o sequenciamento de todo M. abscessus transcriptomes no interior das células; fornecimento, pela primeira vez, uma visão global para M. abscessus adaptação à vida intracelular. Ambas as abordagens dão-em uma visão M. abscessus fatores de virulência que permitem a M. abscessus colonizar as vias aéreas em seres humanos.

M. abscessus tem a capacidade de resistir e fugir das respostas bactericidas de macrófagos e ambientais protozoários como as amebas. M. abscessus expressa fatores de virulência quando cultivada em contacto com as amebas, que o torna mais virulento em ratos4. O primeiro objetivo desses métodos era identificar os genes presentes no M. abscessus , permitindo sua sobrevivência e multiplicação dentro de amebas.
<p class="jove_conten...

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Aqui, apresentamos dois protocolos para estudar interações do fagócito -Mycobacterium abscessus : a triagem de uma biblioteca de transposon mutant para deficiência intracellular bacteriana e a determinação de bactérias intracelular transcriptoma do RNA sequenciamento. Ambas as abordagens fornecem insights sobre as vantagens genômicas e adaptações de transcriptomic melhorar a aptidão de bactérias intracelulares.

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A triagem de bibliotecas mutantes e estudos transcriômicos de patógenos intracelulares podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre adaptações genômicas e regulatórias de patógenos de interesse que são usados para sobreviver dentro do hospedeiro. As principais vantagens dessas técnicas são que são técnicas de investigação em larga escala, e que fornecem uma visão objetiva da adaptação à vida intracelular. As implicações dessas técnicas se estendem para a terapia do abscesso mycobacterium que se associa a esta doença, dando uma visão sobre potenciais alvos para a terapia vacinal.Comece por cultivar ameba Acanthamoeba castellani, ou Ac, em 30 mililitros de levedura peptone meio de glicose em 75 centímetros quadrados cultura tecidual frascos à temperatura ambiente. Após uma hora use uma pipeta de 25 mililitros para remover o supernascedor, e lave as células três vezes com 10 mililitros de tampão Ac sem carbono ou nitrogênio por lavagem. Após a última lavagem, retire a ameba do fundo do frasco com um único aperto vigoroso, e ajuste as células em um tubo Falcão, para cinco vezes 10 a cinco amebas por mil de concentração em tampão Ac fresco.Semente cinco vezes 10 para as quatro amebas por poço em uma placa de 96 poços. Coloque a placa a 32 graus celsius por uma hora sem tremer, para permitir que as amebas flutuantes tropho-zoites aderam aos poços. Enquanto isso, aqueça as bactérias no gelo, e adicione cinco microliters das bactérias descongeladas a cada poço no final da incubação.Depois de 1,5 horas a 32 graus celsius, descarte o supernante invertendo a placa em uma pilha de gaze estéril em uma bandeja de metal esterilizada sob um capô de fumaça. Lave cada poço três vezes com 200 microliters de médio Ac fresco por poço. Após a última lavagem, incubar a co-cultura com 20 microliters de meio fresco suplementado com amikacina por poço, para eliminar qualquer micobactéria extracelular restante por duas horas.Seguido por três lavagens em médio ac fresco, como apenas demonstrado. Em seguida, adicione 200 microliters de médio, complementados com amikacina fresca a cada poço, seguido pela adição de cinco vezes 10 às sete bactérias Escherichia coli inativadas. Após 48 horas, lise as células com 10 microlitres de 10% de sulfato de dodecyl de sódio por poço, por 30 minutos a 32 graus celsius, e espalhe cinco microlitadores do lysate em placas de Columbia Agar contendo 5% de sangue de ovelha.Diluir ainda mais os lises adicionando 25 microliters de água estéril em cada gota. Quando todos os lises tiverem sido banhados, sele as placas com filme plástico de parafina, e incuba as culturas por três a quatro dias a 37 graus celsius. Quando as colônias aparecem nas placas, fotografam as culturas e identificam os mutantes prejudicados pelo crescimento intracelular pelos depósitos com o menor número de colônias bacterianas.Para extração de RNA de micobactérias intracelulares, primeiro cresça M.abscesso em 7H9 médio suplementado com glicerol e glicose até a fase exponencial média em tubos de 50 mililitros a 120 RPM. No final da cultura, lave as bactérias duas vezes com 10 mililitros de tampão ac por lavagem, e meça o O.D.600 para estimar a concentração de bactérias. Em seguida, adicione 8,5 vezes 10 às oito micobabas a 8,5 vezes 10 às seis amebas em 10 mililitros de médio ac fresco para uma incubação de uma hora a 30 graus celsius e 80 RPM.No final da incubação, colhe as células por centrifugação, e lava a pelota três vezes em 10 mililitros de tampão Ac fresco por lavagem sob as mesmas condições de centrífuga. Em seguida, suspenda novamente as células em 10 mililitros de tampão ac fresco suplementado com amikacina para eliminar qualquer bactéria extracelular, e incubar as células por quatro horas a 30 graus celsius e 80 RPM, seguido por duas lavagens em tampão Ac fresco. Após a última lavagem, suspenda a ameba infectada em quatro mililitros de solução fria três, complementadas com 280 microliters de beta mercaptoetanol para interromper a ameba no gelo por 10 minutos.No final da incubação, centrifugar o lisecelular para pelotar as bactérias intracelulares liberadas, e suspender a pelota bacteriana em um mililitro de solução fria três. É importante remover todo o supernatante para evitar contaminação com ameba RNA ou proteases que possam ter feito as amostras. Colher as bactérias liberadas com uma segunda centrifugação, e suspender a pelota em um mililitro de tampão de extração.Em seguida, incubar por 24 horas a 80 graus celsius negativos. Transfira a solução micobacteriana em dois tubos de parafuso mililitro contendo contas de zircônio até a marca de gradação de 500 microliter, e armazene os tubos por mais 24 horas a 80 graus celsius negativos para facilitar a ativação do RNA syn e a dissolução celular. No dia da análise, descongele as amostras no gelo elise as células com duas rodadas de homogeneização a 6000 RPM por 25 segundos, seguida de uma homogeneização redonda a 6000 RPM por 20 segundos.Entre cada rodada de homogeneização, esfrie as amostras no gelo por um minuto para evitar a degradação do RNA. Após a terceira rodada de homogeneização, esfrie as amostras no gelo por 20 minutos e adicione 200 microliters de clorofórmio diluídos em álcool isoamílico a cada tubo. Vórtice por um minuto, depois centrifugar as amostras, e adicionar 0,8 mililitros de isopropanol frio à fase aquosa para uma incubação de duas a três horas a 20 graus celsius negativos.Ao final da incubação, centrifugar as amostras novamente, e lavar as pelotas em 500 microliters de frio 70% de etanol sem misturar. Em seguida, remova imediatamente o etanol por centrifugação. Aspire o supernatante para secar as pelotas em um concentrador centrífugo, e suspenda as pelotas em 100 microliters de água livre de DNA/RNA.A extração de MRNA micobacteriana, como demonstrado, permite a avaliação de famílias genéticas induzidas e reprimidas, agrupando os genes de acordo com seus papéis na resposta a um ambiente limitado em sua fonte de nutrientes e minerais, ou a um ambiente hipóxico ou ácido. Na resistência ao estresse oxidativo e nitrosativo, ou na expressão de fatores de virulência em resposta à ameba ambiental. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de realizar a cultura e o isolamento do RNA das amostras controladas e infectadas ao mesmo tempo para evitar efeitos em lote.Após este procedimento, outros métodos como sequenciamento duplo de RNA podem ser pré-formados para responder a perguntas adicionais sobre interações de patógenos host. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia em direção à virulência da micoba no modelo hospedeiro da ameba. Não se esqueça que trabalhar com ameba pode ser extremamente perigoso, pois a ameba pode se transformar em cistos se você não seguir os passos descritos no procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Imunologia e Infecção

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Desenvolvimento e Identificação de uma subpopulação Novel dos fagócitos Human Giant neutrófilos derivado<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...