Name: protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes
Uploaded: 2019-02-13T12:30:00
Duration: 9 min 32 s
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Die Autoren danken H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine für Unterstützung bei der Assay-Entwicklung und Bereitstellung von LITE-Protokoll und M. Scharf, Purdue Universität für Beratung in Bezug auf Assay entwerfen.

Hinweis: Alle Stämme und Reagenzien für die Arbeit erforderlichen beschrieben in den folgenden Protokollen und Lieferanten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
(1) Kultur der Moskito Larven und Erwachsene
Hinweis: Insektizid anfällig Stämme von Mücken sind von der Malaria-Forschung und Reagenz Referenz Repository zur Verfügung. Empfohlene Sorten sind wie folgt: Liverpool (LVP) Stamm Aedes Aegypti , Anopheles Gambiae Kisumu (KISUMU1) Dehnung und Culex Quinquefasciatus Johannesburg (JHB) Belastung.
<ol><li>Kultur Moskitolarven aus Eiern in einer 12 h Tag/12 h Nacht Zyklus bei 28 ° C und 75-85 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) in Kunststoffschalen 25 x 40 cm (~ 400 Larven pro Fach) wie Nuss-29beschrieben. Füttern Sie die Larven Boden Wüstenrennmaus (A. Aegypti und Jg. Gambiae) oder Fisch Flockenfutter (C. Quinquefasciatus). Für Larven Assays sammeln Sie Larven im dritten Larvenstadium (L3) Instar Stadium.</li>
	<li>Hinten erwachsene Mücken aus Puppen, die übertragen wurden, Plastikbecher und innerhalb 20 L Kunststoff Käfige in einem Insectary unter den oben beschriebenen Bedingungen. Pflegen Sie Mücken auf 20 % Zuckerlösung wie29an anderer Stelle beschrieben. Erwachsene über 3-5 Tage Post aufkommen zu sammeln.</li>
</ol>2. Larven Kontakt Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)
Hinweis: Der Test kann durchgeführt werden mit Chemikalien, die löslich in Wasser oder Dimethyl Sulfoxid (DMSO), sind unter der Voraussetzung, dass die Endkonzentration von DMSO in Testgefäße 1 % nicht überschreitet. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist ätherische zuerst bestätigen, dass die Endkonzentration keine verursacht mehr als 10 % Mortalität bei 72 h Post Exposition. Der Test kann als Einzel-Dosis oder Dosis-Antwort-Assay durchgeführt werden. Wenn Sie Letzteres durchführen, es empfiehlt sich, eine Reihe von Konzentrationen (mindestens fünf), testen über den erwarteten LC50.
<ol><li>Beschriften Sie die Vertiefungen einer Gewebe klar 24-Well-Platte, wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung der Test Chemie in einem 1,5 mL-Tube.<ol>
<li>Jede Chemie mit Hilfe einer Analysenwaage wiegen, und je nach Löslichkeit Eigenschaften erneut aussetzen in sterilen DdH2O, DMSO oder andere organische Lösungsmittel der Wahl (siehe Abbildung 2). Hinweis: Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt. Zum Beispiel für eine Chemie, die 99 % rein, lösen Sie 10,1 mg in 1.000 µL Aceton, eine 1 % ige Lösung zu erhalten auf. Seal mit Paraffin Film und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Endkonzentration von den Test-Chemie, die evaluiert werden und bereiten Verdünnungsreihen aus der Stammlösung entsprechend, mit den geeigneten Lösungsmittel zu bestimmen. Hinweis: Die Konzentration und das Volumen der Chemie und Lösungsmittel können berechnet werden mit der Formel C-1* V1= C2* V2 wo C1= Konzentration der Probe 1, C2= Konzentration der Probe 2, V1= Volumen des Probe 1 und V2= Volumen der Probe 2. Sehen Sie in Abbildung 2 und Tabelle 1dargestellten Beispielberechnungen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 mM-Stammlösung und Verdünnungsreihen, wie erforderlich, um die gewünschte Testkonzentrationen (Tabelle 1 b) zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einer weite Bohrung Kunststoff Transferpipette übertragen Sie fünf L3-Larven zu dem Brunnen einer Gewebekultur-Test-Platte; L3-Larven sind erkennbar durch Länge (~ 2,5-3,5 mm) und Kopf Kapsel Breite ~ 0,025 mm24. Sanft entfernen Sie das Wasser mit einer 1-mL-Pipette und ersetzen Sie durch die gewünschte Lautstärke des DdH2O (siehe unten). Wiederholung zu n = 4 Technische Wiederholungen pro Behandlung (d. h. 20 Larven pro Behandlung).</li>
	<li>Fügen Sie das entsprechende Volumen der Test Chemie zu jedem der vier replizieren Brunnen in der 24-Well-Testplatte und schwenken Sie sanft die Platte, um sicherzustellen, gleichmäßige Durchmischung der Chemie. Legen Sie die Platte in einer Test- oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen (z.B. 25 ° C und ~ 75-85 % RH wird empfohlen und ein 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus wenn möglich). Hinweis: Für die Reproduzierbarkeit zwischen Experimente, sicherzustellen Sie, dass nachfolgende Tests unter gleichen Umweltbedingungen durchgeführt werden.</li>
	<li>Notieren Sie die Anzahl der Toten/non-responsive Larven in jede Vertiefung bei 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 und 72 h nach Exposition (oder alternativer Zeitpunkte) auf dem Spielberichtsbogen (Tabelle 2). Tippen Sie sanft auf die Seite der Platte. Wenn keine Bewegung festgestellt wird, berühren Sie sanft die Larve mit einem sterilen Zahnstocher. Partitur-Larven, die nicht reagieren, um klopfen/Touch als "tot". Hinweis: Andere morphologische und Verhaltensstörungen Phänotypen können beobachtet werden und aufgezeichnet werden können.</li>
	<li>Richtige Kontrolle Mortalität mit modifizierten Abbott Formel, falls gewünscht, wie folgt: Sterblichkeit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y), wobei X = Prozent Sterblichkeit in den behandelten Probe und Y = Prozent Sterblichkeit im Steuerelement.</li>
	<li>Ergebnisse als Histogramm oder logarithmischen Kurve mit Software Wahl z. B. Grafik-Pad Prisma 6 oder ähnliche Grafik, und letale Konzentration (LC) Werte relativ zum Steuerelement zu berechnen.</li>
	<li>Wiederholen den Test über einen separaten Stapel von Mücken zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.</li>
</ol>3. Erwachsene topische Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)
Hinweis: Die Erwachsenen topische Assay wird mit Aceton als Lösungsmittel durchgeführt. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist ätherische zuerst bestätigen, dass die Endkonzentration keine verursacht mehr als 10 % Mortalität bei 48 h Post Exposition. Der Test kann durchgeführt werden, als eine einzelne Dosis oder Dosis-Antwort-Assay und wird verwendet, um die letalen Dosis (LD) zu bestimmen. Wenn Sie Letzteres durchführen, es empfiehlt sich, eine Reihe von Konzentrationen (mindestens fünf), testen über den erwarteten LD-50.
<ol><li>Bestimmen Sie die Anzahl der Erwachsenen weiblichen Mücken erforderlich, um den Test auszuführen. Hinweis: Ein Punkt-Dosis-Assay mit einem einzigen Chemie erfordert ein Minimum von 90 Mücken (30 für die positive Kontrolle, 30 für die Aceton-nur negativ-Kontrolle und 30 für die Test-Chemie).</li>
	<li>Kultur 3 bis 5 Tage alte Erwachsene weibliche Stechmücken und verschieben in eine separate 20 mL-Kunststoff-Eimer mit einer Absauganlage (Abbildung 3).</li>
	<li>Beschriften Sie 9 oz Pappbecher mit den Namen und die Konzentration der Chemie Test. 10 x 10 cm Mesh Plätzen und Gummibänder für jede Tasse beiseite (siehe Abbildung 4).</li>
	<li>Wählen Sie eine vorhandene Insektizid als Positivkontrolle (z. B. das synthetische Pyrethroid, Bifenthrin) und bereiten Sie eine Stammlösung 1 % (10 µg/µL) in Aceton. Hinweis: Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt. Zum Beispiel für eine Chemie, die 99 % rein, lösen Sie 10,1 mg in 1.000 µL Aceton, eine 1 % ige Lösung zu erhalten auf. Seal mit Paraffin Film und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	<li>Nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben, bereiten Sie eine Stammlösung der Chemie Test. Hinweis: Viele Test-Chemikalien sind sehr labil, und Lösungen erfolgen vorzugsweise frisch jedes Mal die Bioassay durchgeführt wird.</li>
	<li>Bereiten Sie Verdünnungsreihen der Positivkontrolle vor und testen Sie Chemikalien aus Stammlösungen wie in Abbildung 5 mit 20 mL Glasfläschchen mit Aceton vorher gespült.</li>
	<li>Eine Spritze, 1 mL Glas mit Aceton reinigen, füllen Sie mit Aceton und sichern in der Mikro-Applikator so angepasst, dass ein Volumen von 0,25 µL liefern.</li>
	<li>Arbeiten in Batches von zehn, 3 - 5 - Tage alten Erwachsene weibliche Stechmücken aus Käfigen mit einem Sauger zu entfernen und für bis zu 5 min bei 4 ° C im Kühlschrank oder auf Eis zu betäuben. Als nächstes übertragen Sie Mücken in eine Petrischale und Ort für bis zu 10 min auf Eis.</li>
	<li>Arbeiten schnell, ein einzelnes Weibchen mit einer feinen Pinzette entfernen und 0,25 µL der Testlösung auf der dorsalen Thorax mit der Spritze Mikro-Applikator anwenden. Bestätigen Sie, dass der Chemie durch Beobachtung mit einem sezierenden Mikroskop jede Mücke sicherzustellen erhält das entsprechende Volumen der Test Chemie.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mücke auf einen beschrifteten Pappbecher ruht auf Eis, und wiederholen Sie neun Mal zu n = 10 behandelten Mücken. Versiegeln Sie die Mücken in die Tasse mit einem quadratischen Gitter gesichert mit einem Gummiband und Transfer zu einer Kunststoff-Wanne oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen von 28 ° C und 75-85 % RH (auf einem 12 h Tag/12 h Nachtzyklus vorzuziehen ist).</li>
	<li>Wiederholen Sie den obigen Versuch zweimal zu n = 3 Technische Wiederholungen (d. h. 30 Mücken gesamt) pro Behandlung oder Kontrolle-Gruppe.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3.10 zuerst mit der Test-Chemie und dann die positive Kontrolle. Hinweis: Ein anderes nützliches Steuerelement einschließen, wenn ausreichende Mücken zur Verfügung stehen ist eine "leere" 30 narkotisierten Mücken, die nicht entweder Test Chemie oder Lösungsmittel erhalten.</li>
	<li>Notieren Sie die Anzahl der "Toten/non-responsive" Mücken in 30 min, 60 min, 2, 24 und 48 h nach Exposition (oder alternativer Zeitpunkte) mit Notenblatt (Tabelle 3). Mücken der Gäste, wie "Toten/non-responsive" Wenn sie Mangel an Bewegung zeigen, definiert als die Verlegung auf einer Seite oder auf dem Rücken und mit der Unfähigkeit, zu fliegen.</li>
	<li>Falls gewünscht, für Kontrolle Sterblichkeit mit modifizierten Abbott Formel wie folgt zu korrigieren: Sterblichkeit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y), wobei X = Prozent Sterblichkeit in den behandelten Probe und Y = Prozent Sterblichkeit im Steuerelement.</li>
	<li>Ergebnisse als ein Histogramm oder eine exponentielle Kurve anzeigen. Berechnen Sie für eine Dosis-Antwort-Assay die LD50, LD75 oder LD90 Wert für die Test-Chemie relativ zum Steuerelement.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Test mindestens zweimal mit separaten Chargen von Moskitos zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.</li>
</ol>(4) Erwachsene Blut-Fütterung Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)
<ol><li>Sammeln rund 150 4-5-Tage alte Erwachsene weibliche Stechmücken und Transfer zu einem separaten Käfig. Wiederholen Sie, um 6 Käfige zu erhalten, wenn eine Dosis-Antwort-Test durchführen. Entfernen Sie die Quelle von Zucker 1-24 h vor der Fütterung Assay.</li>
	<li>Vorbereiten einer Stammlösung der Chemie wie oben beschrieben, die Reinheit der Chemie (eine typische Stammlösung ist 80 mM in Wasser oder Salz Puffer) entfallen, und anschließend bereiten Verdünnungsreihen im Wasserspeicher je nach Bedarf.</li>
	<li>Fügen Sie 40 µL der einzelnen Verdünnungen bis 960 µL Defibrinated Kaninchen Blut auf die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. Zuweisen Sie einer Aufgabeeinheit Barrierefolie und mit einem Gummiring verschließen. Übertragen Sie 1 mL Blut zu, per Pipette und befestigen Sie die Aufgabeeinheit ein Heizelement.</li>
	<li>Sanft gemacht Tupfer die Membran Oberfläche mit frisch 10 % Milchsäurelösung und Ort der Vorschubeinheit in den Käfig des erwachsenen Mücken. Decken Sie den Käfig mit einem dunklen Tuch oder schwarzen Müllsack und lassen Sie Mücken, eine Stunde lang zu ernähren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 für den Rest der Testlösungen und die Negativkontrolle (nur für Blut).</li>
	<li>Platzieren Sie nach Abschluss der Fütterung Eimer bei 4 ° C im Kühlschrank für 5 min um Mücken zu betäuben. Entfernen Sie männliche Mücken und weibliche Mücken nicht gefüttert, und zählen Sie und die Gesamtzahl der gefüttert und teilweise gefüttert Mücken durch Untersuchung des Abdomens.</li>
	<li>Behalten Sie teilweise und voll gefüttert weibliche Stechmücken, mit dem Ziel, für ein Minimum von 50 Blut gefüttert Mücken pro Dosis.</li>
	<li>Übertragen Sie Eimer auf einer Kunststoff-Wanne oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen von 28 ° C und 75-85 % RH (auf einem 12 h Tag/12 h Nachtzyklus vorzuziehen ist).</li>
	<li>Zeichnen Sie die Gesamtzahl der Toten/non-responsive Mücken auf 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 und 72 h (oder alternativen Zeitpunkten wie gewünscht) über die Punktzahl Blatt (Tabelle 4).</li>
	<li>Stellen Sie auf den dritten Tag Post Blut füttern einen Eierbecher in den Käfig und sammeln Sie Eier über einen Zeitraum von 72 h. Die insgesamt Anzahl der Eier pro Behandlung unter dem sezierenden Mikroskop hergestellt.</li>
	<li>Berechnen Sie die prozentuale Mortalität und Fruchtbarkeit in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der fed Mücken für jede Behandlungsgruppe und der Kontrolle. Für Kontrolle Sterblichkeit mit modifizierten Abbott Formel, bei Bedarf zu korrigieren.</li>
	<li>Anzeigedaten Toxizität und Fruchtbarkeit als Histogramm Plot oder exponentielle Kurve (wenn eine Dosis-Antwort-Assay) mit Software der Wahl. Wenn Sie eine Dosis-Antwort-Test durchführen, berechnen Sie die LD50, LD75 oder LD90 Wert für die Test-Chemie relativ zum Steuerelement.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Test mindestens zweimal mit separaten Chargen von Moskitos zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Insektizide sind mächtige Werkzeuge zur Bekämpfung von Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria25, Dengue-Fieber und Zika26. Umfangreiche Insektizideinsatz produzierte Moskito-Populationen sind resistent gegen chemische Bekämpfung, führend zu die Entwicklung von Insektizid Widerstand, der gilt als die größte Bedrohung für Seuchenbekämpfung fortgesetzt. Im letzte Jahrzehnt hat einen dramatischen Anstieg der Populationen von Anopheles spp. beständig gegen synthetische Pyrethroide (SPs) verwendet in Moskitonetze in Afrika7gesehen. Populationen von Aedes Albopictus, Überträger von Dengue-Fieber und Zika, worden in Florida und New Jersey, die Organophosphate6resistent sind berichtet. In ähnlicher Weise wurde Widerstand gegen DDT und Pyrethroide in Populationen von Anopheles und Aedes spp. in Kolumbien27,28dokumentiert. Besteht dringender Bedarf, entwickeln neue Larviziden und Adulticides, die an verschiedenen Orthosteric binden oder allosterische Websites von bekannten molekulare Targets oder stören die neue Ziele (z. B. neuartige MoA Chemikalien)29,30 und haben Sie minimale Auswirkungen auf die Umwelt. Es steigt auch Anerkennung für das Potenzial um Endectocides für Moskito Kontrolle31,32,33.
Um der rasanten Entwicklung solcher Produkte zu erleichtern, beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die entworfen, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien Moskitolarven und Erwachsene über zwei Lieferrouten - Kontakt und Einnahme zu bewerten. Protokolle wie das WHO-Empfindlichkeitstest und CDC Flasche Assays sind im allgemeinen Gebrauch für die Bewertung der Toxizität und Ölabweisung vorhandene Insektizide Formulierungen1,2. Aber diese Assays haben Beschränkungen für Analysen der unformulated neuartige chemische Einheiten (NCEs) und sind nicht geeignet, um große Anzahl von Chemikalien in gemäßigten oder hohen Durchsatz zu testen.
Hier beschreiben wir einen standard Larven Assay um schnell NCEs Einzelpunkt-Dosis zu bewerten, die für Hochdurchsatz Analysen skaliert werden können. Wir beschreiben auch eine Adaption von einem Assay entwickelt von der LITE21 , die Kontakt Toxizität von niedermolekularer Chemikalien erwachsene Mücken zu bewerten. Wir beschreiben einen Einnahme-Test zur Bewertung der Toxizität von NCEs geliefert über die Blutmahlzeit, Erwachsene weiblichen Stechmücken und erforschen potenzielle Endectocide. Diese Larven und Erwachsenen Assays können bei einer Reihe von Dosen durchgeführt werden, um LC und LD-Werte zu bestimmen, und Larven und Erwachsenen Kontakt Assays im Vergleich zu einem oder mehreren vorhandenen chemischen Formulierungen durchgeführt werden können. Die Erwachsenen topische Assay ermöglicht auch die Berechnung von LD Werte pro einzelnen Moskito. Die Protokolle können mit Arten der Aedes, Anopheles und Culex16,29 durchgeführt werden und könnte geändert werden, um Platz für die biologischen Besonderheiten einer Spezies, falls gewünscht. Nach unserer Erfahrung Mosquitocidal Chemikalien weisen in der Regel breite Wirkung auf diese drei Gattungen16,29, aber Wert zur Beurteilung der Spezies Selektivität vorhanden ist.
Die Assays sind ein Ausgangspunkt mehrere Chemikalien für Insektizide Aktivität schnell auf den Bildschirm. Diese Chemikalien, die Toxizität in einem oder mehreren Tests aufweisen konnte für weitere Analysen über sekundäre und tertiäre Assays ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind die LITE tarsal-Assay und Zucker füttern Assays34,35. Die Auswahl der zusätzlichen Assays richtet sich in der Regel nach Überlegungen rund um erwarteten Markt- und Anwendung, mit Ergebnissen, die Einblicke zu Produkt Lieferarten. In die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigten erforschen wir die Toxizität von Amitriptylin, ein Antagonist von Säugetieren und Wirbellosen Dopamin-Rezeptoren, die für potenzielle als Roman MoA Insektizid10,12, bewertet wurden 13 , 16. Amitriptylin ausgestellt Toxizität für Larven und Erwachsene von Ae. Aegytpi μg Bereich vorschlagen larvicidal und Adulticidal Tätigkeit sowie eine Begründung für eine Auseinandersetzung mit einem Amitriptylin-basierte chemische Serie zu identifizieren Analoga mit hoher Potenz. Keine signifikante Auswirkung auf Sterblichkeit oder Fruchtbarkeit verzeichneten Ae. Aegypti Amitriptylin in der Blutmahlzeit ausgesetzt. Während die Stabilität der Chemie in Defibrinated Blut und wirksame Dosis erhalten pro Mücke nicht bekannt ist, nennenswerte Einschränkungen des Assays, legen die Daten nahe, dass Amitriptylin und andere GPCR-aktive Verbindungen wenig Potenzial als Endectocides, bei zumindest in unformulated Zustand.
Vorkehrungen treffen, um biologische Unterschiede zwischen den Proben zu begrenzen sind unerlässlich. Alle Tests sollten unter normalen Bedingungen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit, vorzugsweise in einer Kammer Insekt Wachstum durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Es ist zwingend notwendig, um die Standardisierung von Verfahren für das scoring phänotypischen Endpunkte, da diese sehr subjektiv, führt zu deutlichen Unterschieden in Daten von verschiedenen Laborpersonal aufgezeichnet werden können. Die Larven Assay eignet sich am besten zur Bewertung von Chemikalien, die in Wasser löslich sind, obwohl der Assay erfolgen kann, wenn die Endkonzentration ist weniger als 1 % pro Bohrloch mit organischen Lösungsmitteln wie DMSO. Wir erkennen mehrere Einschränkungen für die Erwachsenen topische Assay. Erstens ist es notwendig, schnell zu arbeiten, bei der Vorbereitung von Verdünnungsreihen und Dosen zu liefern, da der Träger (Aceton) sehr volatil ist und Verdampfung Variation in Höhe von Chemie produzieren kann geliefert. Zweitens sollte darauf geachtet werden, die Geltungsdauer der Narkose zu beschränken, da dies zur Sterblichkeit beitragen kann. Anzumerken ist, dass Lösungsmittel wie Aceton einen schnellen "Knock-down"-Effekt in der ersten mehrstündigen des aktuellen Tests produzieren können, die nicht mit Effekten aufgrund der Chemie Test verwechselt werden sollte. Wir stellen fest, dass das Volumen der Moskito-Blut-Mahlzeit zwischen Individuen, erschwert eine Bewertung der Dosis erhalten pro Erwachsener in der Erwachsenen Einnahme Test variiert. Zu guter Letzt sollte Assay-Daten nicht in Fällen gilt, wenn die Mortalität in der negativen Kontrolle 10 % übersteigt.
Produkte, die synergistisch wirken werden zunehmend anerkannt, ihr Potenzial zu erweitern das Dienstprogramm von bestehenden Produkten und ermöglichen eine Kontrolle der Insektizide resistente Schädlinge Bevölkerung15,16,36. Larven-Assays wurden zur Synergismus zwischen dem Formamidine-Pestizid, Amitraz und eine Vielzahl von Chemikalien, die Wirbellosen Octopamin Rezeptoren14,15stören zu untersuchen. Die Larven Assay und Erwachsenen topische Assay beschrieben eignen sich für additive oder synergistische Effekte zwischen Kombinationen von Chemikalien Test auswerten. Wir stellen fest, dass jeder der hier beschriebenen drei Assays Synergisten wie Piperonyl Butoxide (PBO) integriert werden können.
Die oben beschriebenen Tests bieten eine standardisierte Versuchsreihen zur Auswertung von unformulated, kleinen Molekül Medikamente gegen aquatische und terrestrische Mücke Lebensstadien. Diese Tests sind speziell für Toxizität zu bewerten und bieten mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Tests gemeinsam nutzen. Wichtig ist, die Assays sind Automatisierung zugänglich und können im industriellen Maßstab zur Bewertung von Tausenden von Testverbindungen ermöglichen durchgeführt werden. Schließlich Bereich hält die Entwicklung von Produkten, die über neue MoAs handeln, auch durch Unterbrechung der neue molekulare Targets und biochemischen Bahnen, es wird entscheidend sein, mehrere phänotypische Endpunkte zusätzlich zu denen z. B. Mortalität zu erzielen und Paralyse. Die oben genannten Tests erlauben solche Untersuchungen, wodurch es einen Schritt in Richtung Insektizide hochinnovative Technologien von morgen.

Mücken übertragen die Erreger von Infektionskrankheiten, die menschliche Gesundheit weltweit auswirken1. Die drei wichtigsten Moskito Gattungen die menschliche Gesundheit sind Aedes, Culexund Anopheles . Arten der Aedes -Mücken Vektor Arboviren, die Zika, Dengue-Fieber, Gelbfieber und Chikungunya-Fieber verursachen. Anopheles -Arten Vektor Malaria-Parasiten und Culex -Arten, West-Nil-Virus und filarial Nematoden2übertragen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Beseitigung von zehn vernachlässigten tropischen Krankheiten (NTD) von 20203 gefordert und Moskito-Kontrolle als die praktikabelste Strategie identifiziert. Insektizide sind mächtige Werkzeuge, um Mücken zu kontrollieren und reduzieren Krankheit Getriebe4,5. Die Entstehung von Insektizid-resistente Moskito-Populationen droht aber die kontinuierliche Kontrolle der viele Krankheiten6,7,8. Die innovativen Vector Control Consortium (IVCC) startete den ersten dedizierte Versuch, Ersatz Insektizide für Mosquito Control9entwickeln. Neue Insektizide mit neuartigen Wirkmechanismen (MoA) sind zu treffen, die Ziele und erreichen Seuchenbekämpfung erforderlich. Die Entdeckung und Entwicklung neuer Insektizid-Klassen mit Roman MoAs erfordern Gesamtorganismus Assays für schnelle, Hochdurchsatz-Analyse von Chemikalien und im Vergleich zu Industrie-Standards-10.
Mehrere Tests stehen die Schmutzabweisung und Toxizität von Insektiziden, Larven und Erwachsene Mücken zu bewerten, und einige eignen sich für die Bewertung von neuartigen formulierten oder unformulated Chemikalien. Die WHO Protokoll11 ist ein Kontakt Assay verwendet, um Produkte gegen vierten Instar Larven zu testen. Veröffentlichte Studien beschreiben auch eine Vielzahl von Larven Assays verwendet, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien für Larven von Aedes Aegypti, Anopheles Gambiae und Culex Quinquefasciatus10,12, testen 13,14,15,16. Die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Flasche Bioassay dient zur Insektizid Widerstand im Feld gefangen Populationen von Erwachsenen Mücken über Auswertung von letale Konzentration (LC) und tödliche Zeit (LT) im Vergleich zu einem diagnostischen Standard Bewertung Dosis von einer kommerziellen Insektizid-17. Die WHO-Empfindlichkeitstest bietet einen anderen Ansatz um Insektizid Widerstand in erwachsene Mücken zu bewerten, wobei Mücken Insektizid imprägnierten Papier innen Glasfläschchen für 1 h ausgesetzt sind und Mortalität ist bei 24 h18bewertet. Anderen Assays sprühen Formulierungen in versiegelten Käfige und Rekord Moskito Zuschlag und Tod in der gewünschten Zeitpunkten19. Topische Anwendung auf der Moskito-Thorax wurde zur Potenz der verschiedenen Pestiziden20zu bewerten. Die Liverpool Insekt Testing Einrichtung (LITE)21 beschäftigt Standard Operating Procedures, die Bioaktivität der Chemikalien auf erwachsene Mücken zu bewerten. Der LITE Erwachsenen aktuelle Test gilt ein kleines Volumen des Testprodukts für Thorax erwachsene Mücken mit Sterblichkeit erzielte bei 48 h. Der Test ermöglicht Quantifizierung der Dosis pro einzelnen Moskito21erhalten. Die LITE tarsal Assay wertet die Toxizität von Testprodukt erwachsene Mücken ruht auf einer chemisch behandelten Oberfläche und wird verwendet, um Chemikalien mit Entwicklungspotenzial als indoor residual Sprays (IRS) zu identifizieren oder die Verwendung in Insektizid behandelt Moskitonetze (ITN) Anopheles -Mücken zu steuern.
Die WHO und CDC-Assays haben Einschränkungen für die Prüfung von neuartiger, unformulated Chemikalien, und das Ziel der CDC Flasche Bioassay ist Bewertung der Empfindlichkeit über kurze Assay Zeiträume (zwei Stunden) anstatt Toxizität22,23. Darüber hinaus Assays für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien in der Blutmahlzeit geliefert und Potenzial für die Entwicklung von systemischen wirkenden Produkten (z.B. Endectocides) fehlen. Hier beschreiben wir Assays für die Prüfung der Mosquitocidal Aktivität des neuartigen Chemikalien, die in Wasser oder eine der verschiedenen organischen Lösungsmitteln gegen die Larven und Erwachsene von Aedes, Anopheles und Culexlöslich sind. Erstens zeigen wir einen Larvenstadium Assay zuvor durch unsere Gruppe10,12,13,16beschrieben, durchgeführt und hier als (1) ein Bildschirm, um schnell mehrere Chemikalien an einem einzigen Punkt bewerten Dosis, (2) eine Dosis-Antwort-Assay die letale Konzentration (z. B. LC50, LC75 oder LC-90) einer einzigen Chemie bestimmt. Anschließend beschreiben wir zwei Erwachsene Assays für die Bestimmung der letale Dosis (LD). Die erste davon ist eine Adaption des LITE-Protokolls für die Prüfung von topisch applizierten, neuartigen Chemikalien gegen die Erwachsenen Mücken im Vergleich zu einer positiven Kontrolle. Die zweite ist eine Fütterung Assay für die Bewertung von Chemikalien über die Blutmahlzeit systemisch geliefert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1215">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Insecticide susceptible mosquito strains&#160;</td>
			<td colspan="2" style="width:313px;">Malaria Research and Reagent Reference Repository&#160;</td>
			<td style="width:525px;">https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>CAS 67-64-1</td>
			<td>Use for dilutions and control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amitraz</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CAS 33089-61-1</td>
			<td>Requires dilution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amitriptyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CAS: 549-18-8</td>
			<td>Can be diluted in acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bifenthrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CAS: 51529-01-2</td>
			<td>Synthetic pyrethorid used as positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cis-(Z)-flupenthixol</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CAS: 51529-01-2</td>
			<td>Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defibrinated rabbit blood</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>DRB0100</td>
			<td>Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>MKBF2985</td>
			<td>Organic solvent used to disolve amitraz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Hemotek membrane feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Serial no. 1303</td>
			<td>Used for feeding mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Micro-applicator</td>
			<td>Burkard Manufacturing Co.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool needed for topical application experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advantage rubber bands</td>
			<td>Alliance Rubber Co.</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to seal the paper cups</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass syringe (1 ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>512004</td>
			<td>Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scintillation vials (20 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74505-20</td>
			<td>Glass vials prevent evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tulle fabric, white</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paper cups</td>
			<td>Dixie Consumer Products LLC.</td>
			<td>PF15675/13D</td>
			<td>Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes (150 mm)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to maintain the mosquitoes &#34;slept&#34; on cold without direct contact with ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>Used to sort larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ6045</td>
			<td>Used to score larval assays and perform micro-applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers (fine)</td>
			<td>Fontax&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to handle adult mosquitoes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes

Neue Klassen von Insektiziden mit neuartigen Wirkmechanismen sind erforderlich, um Insektizide resistenten Populationen von Moskitos zu steuern, die Krankheiten wie Zika, Dengue-Fieber und Malaria übertragen. Assays für Rapid, werden Hochdurchsatz-Analysen der unformulated Roman Chemikalien gegen Moskitolarven und Erwachsene präsentiert. Wir beschreiben Protokolle für Punkt-Einzeldosis und Dosis-Antwort-Assays auszuwertende die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien dem Aedes Aegypti Vektor von Zika, Dengue-Fieber und Gelbfieber, Malaria-Vektor, Anopheles Gambiae und der nördlichen Haus Mücke, Culex Quinquefasciatus auf Kontakt und durch Verschlucken. Als Beispiel haben wir die Toxizität von Amitriptylin, ein kleines Molekül Antagonist von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren, über Larven, Erwachsene aktuell und Erwachsenen Blut-Fütterung-Test ausgewertet. Die Protokolle stellen einen Ausgangspunkt um potenzielle Insektizid zu untersuchen. Ergebnisse werden im Rahmen von zusätzlichen Experimenten Produktanwendungen und Mechanismen für die Lieferung zu erkunden diskutiert.

Abbildung 6 zeigt die prozentuale Mortalität von L3 Ae. Aegypti nach Exposition gegenüber fünf Dosen von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin im Vergleich zu Wasser nur (negative) Kontrolle auf 24, 48 und 72 h. In diesem Beispiel an den Zeitpunkten jeweils erhobenen Daten zeigen eine typische logarithmische Kurve und offenbaren eine dosisabhängige Wirkung von Amitriptylin auf larval Sterblichkeit. Der LC50 Wert sinkt über den zeitlichen Verlauf des Experiments und kann anhand der 72 h-Daten (d. h. Mittelpunkt der logarithmischen Kurve) berechnet werden.
Abbildung 7 zeigt die prozentuale Mortalität von 3 - 5 Tage alte adulte Weibchen Ae. Aegypti nach Exposition gegenüber einer 400 µM-Dosis (10 µg/µL) von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin und im Vergleich zu den synthetischen Pyrethroid Bifenthrin-positiv-Kontrolle (technischer Qualität; 500 Pg/µL), Aceton nur negativ-Kontrolle und unbehandelten Mücken (leer). In diesem Beispiel verursachen Amitriptylin und Bifenthrin erhebliche Erwachsenensterblichkeit bezogen auf die negativ-Kontrolle. Beachten Sie, dass Erwachsenensterblichkeit verringert sich im Laufe der Zeit vermutlich durch metabolische Entgiftung des Test-Chemikalien.
Abbildung 8 zeigt der Prozent Sterblichkeit (linke y-Achse) 3 bis 5 Tage alte Erwachsenfrau Ae. Aegypti gefüttert eine Blutmahlzeit behandelt mit einem der vier Dosen von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin und der Fruchtbarkeit (Rechte y-Achse; durchschnittliche Ei Graf / weibliche) für die ersten Gonotrophic Zyklus Post Belichtung im Vergleich zu steuern Moskitos (Blut gefüttert nur; negative Kontrolle). Die Daten zeigen, dass es keinen signifikanten Einfluss von Amitriptylin auf Erwachsenensterblichkeit relativ zum Steuerelement zeigen aber, dass Amitriptylin erhöht Fruchtbarkeit bei der höchsten Dosis (400 µM).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig1.jpg"> Abbildung 1 . Aufbau der Larven Dosis-Antwort-Assay. Bild zeigt den Aufbau des larvalen Dosis Antwort Assays mit Aedes Aegypti L3-Larven in 24-Well-Platte durchgeführt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig2v2.jpg"> Abbildung 2 . Schematischen Verfahren für Satz (A) Einzelpunkt-Dosis oder (B) Dosis Antwort Larven Assay in 24-Well-Platte angezeigt. Nach Überführung der fünf L3-Larven, Brunnen überschüssiges Wasser sanft per Pipette entfernt und ersetzt mit frischen, sterilen DdH2O. Als nächstes sind Lager Verdünnungsreihen der Chemie Test vorbereitet und zu einem Endvolumen von 1 mL/Brunnen hinzugefügt. <a href="/files/ftp_upload/57768/57768fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig3.jpg"> Abbildung 3 . Kultur der erwachsenen Mücken. Bild zeigt 20 L Kunststoff-Eimer zur Kultur der erwachsenen Mücken und Nutzungsbedingungen eine Absauganlage Mücken. entfernen
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig4.jpg"> Abbildung 4 . Erwachsenen topische Assay durchgeführt mit 4-5 Tage alt weiblich Aedes Aegypti. Nach der Behandlung mit Chemie oder Lösungsmittel, Erwachsene Mücken sind in Pappbecher platziert und für die Dauer des Tests in einer Prüfkammer übertragen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig5.jpg"> Abbildung 5 . Lager und Verdünnungsreihen. Schematische Darstellung zeigt das Verfahren zur Vorbereitung der Lager (A) und (B) serielle Testlösungen für die Erwachsenen aktuell-Assay. <a href="/files/ftp_upload/57768/57768fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig6.jpg"> Abbildung 6 . Repräsentative Daten aus einen Larven Kontakt Dosis-Antwort-Assay. Repräsentative Daten aus einer larvalen Kontakt Dosis-Antwort Test zeigt Prozent Sterblichkeit von Aedes Aegypti L3 Larven nach Exposition gegenüber den Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin bei 24, 48 und 72 h. Jeder Datenpunkt repräsentiert bedeuten in µM ± SEM Daten repräsentieren n = 3 biologische repliziert.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig7.jpg"> Abbildung 7 . Repräsentative Daten aus einer topischen Dosis für Erwachsene Antwort Assay. Repräsentative Daten aus einer topischen Dosis für Erwachsene Antwort Assay zeigt Toxizität von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin (10 µg/µL), 3-5 Tage alten weiblichen Gelbfiebermücke im Vergleich zu den synthetischen Pyrethroid, Bifenthrin (500 Pg/µL) positive Kontrolle) und der negativen Kontrolle (Aceton Fahrzeug nur) 2, 24 und 48 Stunden. Darstellung von Daten n = 3 biologische repliziert. Fehlerbalken zeigen SEM
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig8.jpg"> Abbildung 8 . Repräsentative Daten von einem Erwachsenen Verschlucken Assay. Repräsentative Daten von einem Erwachsenen Verschlucken Assay zeigt Toxizität der Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin in 400 µM, 100 µM und 200 µM Dosis auf 3-5 Tage alten Erwachsenen weiblichen Gelbfiebermücke und Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit (ausgedrückt als die durchschnittlichen gesamten Ei gelten Sie pro Weibchen über den ersten Gonotrophic-Zyklus). Darstellung von Daten n = 3 biologische Wiederholungen ± SEM
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="6">A. Einzelpunkt-Dosis-Assays mit drei Chemikalien</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chemie</td>
			<td colspan="5">Konzentration (400 ähm)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Amitriptylin</td>
			<td colspan="5">
80 mM Lager: 2 mg Amitriptylin X 98 % (Reinheit des Pulvers) X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol 313,86 g X 1 L/0,08 Mol X 106 µL/L = 78.06 µL Wasser.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
Serielle Verdünnungen: Verdünnen Sie Lager 1:2 mit DdH2O und dann 1:4 bis 10 mM zu erreichen. 40 µL 10 mM Lager hinzu kommt gut mit 960 µL DdH20, eine Endkonzentration von 400 µM/gut zu erreichen.  Bereiten Sie serielle Verdünnungen von 10 mM Lager 1:2, 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM und 0,625 mM Bestände zu erreichen.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CIS-(Z)-Flupenthixol</td>
			<td colspan="5">
80 mM Lager: 2 mg des Cis (Z) Flupenthixol X 98 % (Reinheit des Pulvers) X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol/507.44-g-Cis (Z) Flupenthixol X 1 L/0.08 Mol X 106 µL/L = 48.28 µL Wasser.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
Serielle Verdünnungen: Wie oben.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Amitraz</td>
			<td colspan="5">
80 mM Lager: 2 mg von Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol/293,4 g Amitraz X 1 L/0.08 Mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL DMSO (Hinweis: Amitraz ist nur löslich in DMSO).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
Serielle Verdünnungen: Wie oben.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">B. Dosis-Antwort-assay</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Chemie</td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>400 ΜM</td>
			<td>200 ΜM</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>50 ΜM</td>
			<td>25 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">z. B. Amitriptylin, Cis-(Z)-Flupenthixol oder Amitraz</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Lager</td>
			<td>5 mM Lager</td>
			<td>2,5 mM Lager</td>
			<td>1,25 mM Lager</td>
			<td>0,625 mM Lager</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Beispielrechnungen für Aedes Aegypti L3 Larven (A) einzelne Punkt Dosis Assay und (B) Dosis-Antwort-Assay.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57768/57768tbl2.jpg"> Tabelle 2: Beispiel Bewertungsbogen verwendet, um Daten aus der Moskito Larven Dosis Antwort Test. Steuerung, nur mit Wasser oder Wasser mit 1 % DMSO oder andere Lösungsmittel nur. Typische Dosierungen verwendet, um niedermolekulare Antagonist Chemikalien wie Amitriptylin testen sind 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM und 400 µM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Erwachsenen Mücke (3-5 Tage alt) topische Assay</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Datum eingeleitet:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Ermittler:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Art/Sorte:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">
Assay Typ: Einzelpunkt-Dosis/Wirkungs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">A. Sterblichkeit (No. tote Mücken)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit (Stunden)</td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">B. Prozent Sterblichkeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit (Stunden)</td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Beispiel Notenblatt verwendet, um Daten aus der Dosis für Erwachsene topische Reaktion Test.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Erwachsenen Mücke (3-5 Tage alt) Einnahme Assay</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Datum eingeleitet:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Ermittler:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Art/Sorte:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">
Assay Typ: Einzelpunkt-Dosis/Wirkungs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">A. Zahl gefüttert Mücken</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gefüttert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicht Fed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>gesamt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>% Fed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>% Nicht Fed</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">B. Mortalität (No. tote Mücken)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit (Stunden)</td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>48</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">C. Prozent Sterblichkeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit (Stunden)</td>
			<td>Dosis 1</td>
			<td>Dosis 2</td>
			<td>Dosis 3</td>
			<td>Dosis 4</td>
			<td>Dosis 5</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>48</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4. Beispiel Bewertungsbogen verwendet, um Daten von Erwachsenen Blut-Fütterung Assays. Typische Dosierungen verwendet, um niedermolekulare Antagonist Chemikalien wie Amitriptylin testen sind 400 µM, 200 µM, 50 µM und 100 µM.

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Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokolle sind für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien zu unreif und Erwachsene Mücken für Entwicklung als neue Klassen von Larviziden, Adulticides und Endectocides beschrieben. Die Protokolle ermöglichen Hochdurchsatz-Prüfung von mehreren Chemikalien bei Einzelpunkt-Dosis und anschließende Auswertung über Dosis-Antwort-Assay Toxizität auf Kontakt zu bestimmen oder Verschlucken.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Insektizid-Erkennung und Vektorkontrolle zu beantworten. Wie toxisch ist eine unformulierte Chemie für eine Population von Mückenlarven oder Erwachsenen? Hat die Chemie Entwicklungspotenzial als Larvizid oder Adultizid?Und, was könnte der effektivste Lieferweg sein? Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass es verwendet werden kann, um die Toxizität von unformulierten Chemikalien zu bewerten Die Toxizität einer Chemie gegen mehrere Arten von Vektormücken, und es kann bis zu Hunderten von Verbindungen in hoher Durchsatzkapazität bewertet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Jasleen Kaur, einer wissenschaftlichen Technikerin aus meinem Labor.Zunächst beschriften Sie die Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Verwenden Sie eine analytische Waage, um die Testverbindung zu wiegen. Lösen Sie dann die Verbindung in sterilem doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5 ml-Rohr, was zu einer 80mM-Stammlösung führt.Anschließend wird die Stammlösung mit doppelt destilliertem Wasser seriell verdünnt, um Arbeitsstofflösungen der gewünschten Konzentrationen vorzubereiten. Beachten Sie, dass die Larven den Brunnen hinzugefügt werden, während der Entfernung von überschüssigem Wasser, und wenn die Testchemie hinzugefügt wird, um körperliche Schäden an den Larven zu vermeiden. Verletzungen können die Sterblichkeit erhöhen und somit falsche positive Ergebnisse hervorbringen oder den Test ungültig machen.Verwenden Sie eine breite Bohrung Kunststoff TransferPipette fünf Drittel inStar Larven auf jeden Brunnen der Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine 1 ml Pipette, um das Wasser vorsichtig zu entfernen, und ersetzen Sie es durch das gewünschte Volumen an doppelt destilliertem Wasser. Achten Sie darauf, die Larven nicht zu berühren, wenn das Wasser schnell zu entfernen, um sicherzustellen, dass die Larven nicht auslöschen, und fügen Sie vorsichtig die Testchemie durch Pipettieren gegen die gegenüberliegende Seite des Kunststoffbrunnens hinzu.Fügen Sie jedem Bohrgut ein geeignetes Testvolumen hinzu und drehen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. Platzieren Sie die Platte in einer Wachstumskammer, die 12 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus bei 25 Grad Celsius mit 75 bis 85 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit aufrechterhält. Um die Larvenbewegung zu überprüfen, tippen Sie vorsichtig auf die Platte.Wenn keine Bewegung beobachtet wird, berühren Sie die Larve vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher. Bewerten Sie die Larve als tot, wenn keine Antwort bemerkt wird, und verwenden Sie ein Scoresheet, um die Gesamtzahl der toten Larven in jedem Brunnen zu den im Textprotokoll beschriebenen Zeitpunkten aufzuzeichnen. Kultur drei bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken in einem 20-Liter-Plastikkäfig.Etikettieren Sie neun Unzen Papierbecher mit dem Namen und der Konzentration der Prüfmasse. Als nächstes bereiten Sie eine 10mg/ml-Stammlösung der Prüfverbindung in Aceton in einer 20ml Glasdurchstechflasche vor. Anschließend wird die Lagerlösung seriell verdünnt, um die gewünschten Arbeitskonzentrationen zu erhalten.Reinigen Sie die eine ml Glasspritze mit Aceton. Dann mit der Testlösung in der entsprechenden Konzentration füllen. Befestigen Sie die Spritze in einem Mikro-Applikator, der auf ein Volumen von 0,25 uL eingestellt ist.Als nächstes verwenden Sie einen Aspirator, um 10, drei bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken aus dem Käfig zu entfernen. Anästhesisieren Sie sie für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann die Mücken auf eine Petrischale übertragen.Legen Sie das Gericht für 10 Minuten auf Eis. Um zu vermeiden, dass die erwachsene Mücke, die zur Sterblichkeit beitragen könnte, zu schädigen, stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr als fünf Minuten im Kühlschrank beäscht oder mehr als 10 Minuten lang auf Eis immobilisiert werden, und minimieren Sie den Umgang mit den Mücken. Wenn Sie Zugang zu einer kalten Platte und einem Mikromanipulator mit einer beweglichen Stufe haben, kann dies den Umgang mit den Mücken weiter minimieren.Verwenden Sie eine feine Pinzette, um jede Mücke aus der Schale zu entfernen. Mit der Spritze Mikroapplikator 0,25uL der Testlösung auf den dorsalen Thorax auftragen, unter einem Sezieren Mikroskop Next, übertragen Sie die Mücken auf einen beschrifteten Papierbecher auf Eis. Versiegeln Sie den Becher mit einem 10 x 10cm Mesh-Quadrat und einem Gummiband Dann, übertragen Sie ihn in die Wachstumskammer, und notieren Sie die Anzahl der toten Mücken wie zuvor beschrieben.Sammeln Sie etwa 150 vier bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken mit einem Aspirator und übertragen Sie sie in einen separaten Käfig. Entfernen Sie die Zuckerquelle ein bis 24 Stunden vor dem Fütterungstest. Bereiten Sie eine 80mM Stofflösung der Prüfmasse in Wasser vor.Dann, seriell mit Wasser verdünnen, um Arbeitsmateriallösungen der gewünschten Konzentrationen zu erhalten. Um die gewünschten Testkonzentrationen zu erhalten, fügen Sie 40uL jeder Verdünnung zu 960uL defibriniertem Kaninchenblut in einem 1,5 ml-Rohr hinzu und mischen Sie sie durch Pipetten. Legen Sie einen Elementfilter auf eine Zuführeinheit und versiegeln Sie ihn mit einem Gummiring.Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um ein ml des Blutes mit Testlösung durch den Zustellanschluss zu übertragen, der sich auf der Rückseite der Zuführeinheit befindet. Befestigen Sie die Zuführeinheit an einer Heizeinheit. Dann die Membranoberfläche vorsichtig mit frisch zubereiteter 10-prozentigen Milchsäurelösung abwischen.Legen Sie die Futtereinheit in den Käfig. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tuch, und lassen Sie die Mücken für eine Stunde füttern. Nachdem die Mücken gefüttert haben, legen Sie den Käfig fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank, um sie zu beästhesieren.Zählen und erfassen Sie dann die Gesamtzahl der Mücken im Käfig. Durch die Untersuchung des Bauches zählen und erfassen Sie die Gesamtzahl der vollständig und teilweise gefütterten weiblichen Mücken. Pro Dosis sollten mindestens 50 blutgefütterte Mücken erhalten werden.Entfernen Sie alle Mücken, die nicht gefüttert haben. Übertragen Sie als Nächstes den Käfig in eine Wachstumskammer, und verwenden Sie ein Merkblatt, um die Anzahl der toten Mücken zu den entsprechenden Zeitpunkten aufzuzeichnen. Am dritten Tag nach der Blutfütterung einen Eierbecher 72 Stunden in den Käfig legen.Verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops, um die Gesamtzahl der pro Behandlung produzierten Eier zu zählen. Ein Larvenkontakt-Assay wurde durchgeführt, um die Wirkung von Amitriptinin, einem Dopaminrezeptor-Antagonisten, auf die Larvensterblichkeit im Laufe der Zeit zu bewerten. Die Daten zeigten, dass der LC 50-Wert im Laufe des Experiments abnimmt.Die Wirkung von Amitriptinin auf die Sterblichkeit erwachsener weiblicher Mücken wurde mit Bifenthrin und zwei negativen Kontrollen verglichen. Im Vergleich zu acetonbehandelten und unbehandelten Negativkontrollen induzierten sowohl Amitriptinin als auch Bifenthrin zu jedem experimentellen Zeitpunkt eine signifikante Sterblichkeit. Ein quantitativer Fütterungstest wurde durchgeführt, um die Wirkung von drei verschiedenen Dosen von Amitriptinin auf die Fruchtbarkeit und die prozentuale Sterblichkeit erwachsener weiblicher Mücken zu bewerten.Die Daten zeigten keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Fruchtbarkeit von Amitriptinin gefütterten Mücken in der höchsten Dosis im Vergleich zu nur blutgefütterten Kontrollen. Einmal gemeistert, kann jeder der hier beschriebenen Assays in etwa zwei Stunden von einer einzelnen Person abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sanft mit dem Organismus umzugehen, und es sollte Konsistenz bei topischen Anwendungen und beim Scoring Larven oder Erwachsenen-Assay geben.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Bio-Assays zur Bewertung der Toxizität über Absorption, durch den Mückentarsi, den CDC-Flaschentest und den WHO-Rohrtest durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Wirksamkeit der unformulierten Chemie oder eines formulierten Produkts und entwicklungsfähigen Entwicklungspotenzialals als Kontaktinsektizid oder Weltraumspray zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

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The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

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Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...