Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

المؤلفون يود أن يعرب عن امتنانه نغوين ثاو وناكانو أتسوشي من جامعة كاليفورنيا لتقديم نموذج الفئران للصورة. هذه الدراسة وأيده النجوم المنح HL118650 المعاهد الوطنية للصحة (إلى Tzung ك. هسياي)، HL083015 (إلى Tzung ك. هسياي)، HD069305 (لتشي جيم نون وهسياي ك. Tzung.)، HL111437 (إلى هسياي ك. Tzung وا. جيم تشي)، HL129727 (إلى Tzung ك. هسياي)، وجامعة تكساس نظام التمويل (جوهيون لي).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات بلجان المراجعة المؤسسية (إياكوك) في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجليس، كاليفورنيا.
1-تصوير نظام الإعداد
ملاحظة: انظر الشكل 1 و الشكل 2.
<ol><li>استرداد ليزر (CW) موجات مست?...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

نظام لسفم والأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير ضوئية للصورة قلب الماوس في مراحل ما بعد الولادة والكبار من تطورها. شعاع إضاءة تقليدية واحد يعاني من تشتت فوتون والاستيعاب من خلال عينات الأنسجة أكثر سمكا وأكبر1،3. توفر ?...

مجهرية الفلورية الضوء-ورقة تقنية وضعت في بادئ الأمر في عام 1903 ويستخدم اليوم كطريقة لدراسة التعبير الجيني وأيضا لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد أو 4-د من الأنسجة العينات1،،من23. يستخدم هذا الأسلوب التصوير ورقة رقيقة من الضوء لإضاءة طائرة واحدة من عينة حيث أن فقط تلك الطائرة يتم التقاطها بواسطة الجهاز. يمكن ثم نقل العينة باتجاه المحوري لالتقاط كل طبقة، قسم واحد في كل مرة، وتقديم نموذج ثلاثي الأبعاد بعد تجهيز الصور المكتسبة4. ومع ذلك، نظراً لامتصاص وتشتت الفوتونات، كانت محدودة للعينات التي تكون أما بضعة ميكرونات سميكة أو شفافة بصريا1لسفم.
وأدت القيود المفروضة على لسفم لدراسات مستفيضة للكائنات التي لها الأنسجة التي تكون شفافة بصريا، مثل الزرد. غالباً ما تجري دراسات شملت التنمية القلب والتمايز الزرد أن هناك جينات المصانة بين البشر والزرد5،6. على الرغم من أن هذه الدراسات أدت إلى التقدم في مجال أبحاث أمراض القلب المتصلة بالقلب6،7، لا تزال هناك حاجة إجراء بحوث مماثلة على الكائنات ذات مستوى أعلى مثل الثدييات.
أنسجة القلب الثدييات تحديا نظراً لسمك والتعتيم للأنسجة، الاستيعاب سبب الهيموغلوبين في خلايا الدم الحمراء، وشريطية الذي يحدث بسبب الإضاءة على وجه واحد من العينة تحت الأساليب التقليدية في لسفم1 , 8-للتعويض عن هذه القيود، اقترحنا على استخدام الإضاءة الوجهين المزدوج ونسخة مبسطة من تقنية الوضوح9 جنبا إلى جنب مع إنكسار مطابقة الحل (دواليب). ولذلك، يسمح هذا النظام لتصوير عينة التي أكبر من 10 × 10 × 10 ملم3 في حين الحفاظ على قرار ذات نوعية جيدة في محوري والأفقي طائرات8.
أولاً معايرة هذا النظام استخدام الخرز الفلورسنت مرتبة في تكوينات مختلفة داخل أنابيب زجاجية. ثم، استخدم النظام لصورة قلوب مورين بعد الولادة والكبار. أولاً، تم تصويرها قلب الماوس بعد الولادة في 7 أيام (P7) للكشف عن تجويف البطين، وسمك جدار البطين وهياكل صمام، ووجود ترابيكوليشن. ثانيا، أجريت دراسة لتحديد الخلايا التي تفرق في cardiomyocytes باستخدام قلب ماوس بعد الولادة في اليوم 1 (P1) مع لجنة المساواة العرقية المسمى كارديوميوسيتيس وبروتين فلوري الصفراء (يفب). وأخيراً، تم تصويرها الفئران الكبار في أشهر 7.5 مراعاة وجود البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي قنوات (رومك) بعد العلاج الجيني8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للحصول على الصور السريع مع ارتفاع قرار محوري من ميكرومتر إلى مقياس ملليمتر. التقنيات التقليدية للضوء--ورقة تنطوي على استخدام شعاع واحد الإضاءة الموجهة أورثوجونالي في عينة الأنسجة. صور لعينات كبيرة التي يتم إنتاجها باستخدام شعاع إضاءة واحدة تحتوي على تخطيطات أو التحف ويعانون من قرار تخفيض بسبب تشتت وامتصاص الضوء بواسطة الأنسجة. تستخدم هذه الدراسة شعاع إضاءة الوجهين المزدوج ومبسطة وضوح بصري مسح تقنية لقلب مورين. هذه التقنيات تسمح لتصوير أعمق عن طريق إزالة الدهون من القلب وإنتاج حقل كبير من التصوير، وأكبر من 10 × 10 × 10 ملم3. ونتيجة هذه الاستراتيجية تمكننا من قياس أبعاد البطين وتتبع نسب أمراض القلب، وتعريب التوزيع المكاني للبروتينات الخاصة بالقلب وقنوات أيون من بعد الولادة إلى قلوب الكبار الماوس مع تباين كافي و القرار.

الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير عينات أنسجة القلب الماوس ضوئية لتحقيق عمق تصوير أعمق وأكبر حجم تصوير مع القرار التصوير كافية (الشكل 1). لمعايرة النظام، وضعت الخرز نيون داخل أنابيب زجاجية ومن خلال نظام التصوير. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

هذه الدراسة يستخدم تقنية مجهرية () ورقة الضوء فلورية إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع مسح بصري لدراسة قلب موريني.

ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها تسمح للتصوير السريع لأي قلب الماوس. ويمكن استخدامه لمراقبة وجود قنوات الهواء بعد العلاج الجيني. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في أمراض القلب التنمية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل علم الأعصاب والبولون.عموما، سوف الأفراد النضال مع هذه التقنية لأن تركيب التصوير لقلب الماوس الكبار يمكن أن يكون صعبا، وانها مختلفة عن غيرها من التقنيات التقليدية، مثل المجهر confocal والمقلوب. ضع ليزر الموجة المستمرة مع ثلاثة أطوال موجية من 405 نانومتر و 473 نانومتر و 532 نانومتر. ثم، الصق مرآة واحدة ومحاذاتها مع مستوى المرآة عند 45 درجة إلى الشعاع.هذا سيوجه الليزر نحو الفاصل شعاع، الذي يشكل الإعداد الإضاءة مزدوجة الجانب. بعد ذلك، تمرير شعاع من خلال مرشح كثافة محايدة قطرها 50 ملليمتر، وموسع شعاع، وثقب دبوس قطرها 25 ملليمتر، وكلها متمركزة 150 ملليمتر من بعضها البعض. مرر الشعاع من خلال مقسم شعاع 50-50، وضعت 150 ملليمتر من الثقب.بعد ذلك، ضع مرآة 150 ملليمتر من مقسّم الشعاع، عند 90 درجة إلى الشعاع الأمامي، ومحاذاته بحيث يكون مستوى المرآة عند زاوية 45 درجة للشعاع. ثم، ضع مرآة ثلاثة 100 ملليمتر من المرآة الثانية، ومحاذاة بحيث انها مرآة الطائرة هو في زاوية 45 درجة إلى شعاع ينعكس من مرآة اثنين. استخدم هذا الشعاع المنعك لتشكيل جانب واحد من ورقة الإضاءة المزدوجة.على الجانب البعيد من الفاصل شعاع، مكان مرآة خمسة بحيث انها مرآة الطائرة هو في 45 درجة إلى شعاع الذي ينبعث في اتجاه أمامي. استخدام شعاع المنبعث من مرآة خمسة لتشكيل الجانب الثاني من ورقة الإضاءة المزدوجة الخفيفة. بعد ذلك، قم بإعداد نظام الإضاءة المزدوجة الجانب بطريقة نظامية.ضع العدسة الأسطوانية اثنين 150 ملليمتر بعيدا عن المرآة ثلاثة، وآخر عدسة أسطوانية متطابقة 150 ملليمتر بعيدا عن مرآة خمسة، على الجانب الآخر من الإعداد الإضاءة المزدوجة. بعد ذلك، ضع مرآتين، كل منها متماشياً مع العدسات الأسطوانية، على مسافات 50 ملليمتراً لتعكس الشعاع عند 90 درجة. على جانبي ورقة الضوء، تشكل مزدوجة اللونية من زوج من العدسات، مع العدسة الأولى يجري وضع 100 ملليمتر من المرآة السابقة، وبعد أن قطر بوصة واحدة و طول بؤري من 100 ملليمتر.يجب وضع العدسة الثانية 160 ملليمتر من العدسة واحدة ، مع قطر بوصة واحدة ، وطول بؤري من 60 ملليمترا. ثم، ضع أهداف الإضاءة واحد واثنين 150 ملليمتر من المضاعفة اللونية السابقة، بحيث تكون في خط مع شعاع. يشكل الشعاع المنبعث من الأهداف ورقة الضوء لتصوير العينات.أولاً، إعداد عينة حبة الفلورسنت عن طريق تمييع محلول حبة ميكرومتر 0.53، من واحد إلى 150،000، في محلول مطابقة معامل الانكسار قبل تسخينها، مع واحد في المئة منخفضة تذوب مشيرا agarose. بعد ذلك، استخدم قطعة من أنابيب الزجاج البورسليكات مع قطر داخلي من 12 ملليمتر، وقطر خارجي من 18 ملليمتر، إلى طول 30 ملليمتر. الميبت الحل agarose حبة في أنابيب البورسليكات والسماح لأغاروز لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.الآن، ملء غرفة ABS المطبوعة ثلاثية الأبعاد مع حل gylcerol بنسبة 99.5 في المائة. وضع أنابيب الزجاج borosilicate، التي تحتوي على الخرز، داخل الغرفة. إرفاق مرحلة تحويلية ثلاثية الأبعاد بمحركات إلى أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في حركة واتجاه العينة داخل غرفة ABS.ثم، استخدم برامج مصممة خصيصا للحصول على الصور باستخدام كاميرا sCMOS، بمعدل 30 لقطة في الثانية. باستخدام وحدة تحكم المحرك، حرك العينة ملليمتر واحد في الاتجاه الجانبي، والحصول على الصور في كل زيادة ملليمتر واحد، حتى تم تصوير العينة بأكملها. كومة الصور المكتسبة باستخدام برنامج مرئي، وقياس وظيفة انتشار نقطة من النظام باستخدام هذه الصور حبة.استخدم محلول مطابقة لمؤشر الانكسار، مع الرقم الـ 7.5، واذاب واحد بالمائة من الأكروز في محلول المطابقة. ضع عينة قلب فأرة بالغة واضحة في محلول مطابقة مؤشر الانكسار ، مع واحد في المئة agarose حل. ثم، أدخل العينة في أنابيب الزجاج البورسليكات، والسماح لأاغروز لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.إرفاق مرحلة تحويلية ثلاثية الأبعاد بمحركات إلى أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في حركة واتجاه العينة داخل غرفة ABS مطبوعة ثلاثية الأبعاد. ضع العينة بحيث تكون في وسط الشعاع الغاوسي ، الذي تم إنشاؤه بواسطة نظام الإضاءة المزدوج. ثم، تعيين معدل اقتناء الكاميرا sCMOS إلى 30 لقطة في الثانية.الآن، باستخدام وحدة تحكم المحرك، حرك عينة ملليمتر واحد في الاتجاه المحوري والحصول على الصور في كل زيادة ملليمتر واحد. استمر حتى يتم تصوير النموذج بأكمله. قم بتكديس الصور المكتسبة باستخدام برنامج مرئي.قم بتطوير الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام رصة الصور هذه. لتحقيق ذلك ، deconvolve وظيفة انتشار نقطة محددة مسبقا ، واستخدامها للحصول على كومة الصورة المكتسبة. وأخيراً، قم بتعيين قيمة كثافة عتبة البكسل لمراقبة ملامح القلب، وإضافة لون زائف إلى الصور، استنادًا إلى هذه الكثافة الرمادية.في اليوم واحد بعد الولادة، يمكن للمرء أن تصور الصمامات، الأذين، البطين، العضلات البكتين، وtrabeculation، من بين ميزات أخرى. في اليوم السابع بعد الولادة، تكون الميزات أكثر تحديدًا. الأذين، البطين، أبعاد تجويف البطين، وسمك جدار البطين كلها واضحة.لدراسة تمايز cardiomyocyte داخل القلب ، تم تسمية الفئران heterozygous في وضع العلامات لإظهار cardiomyocytes. تظهر الخلايا المسماة هنا، في كل اتجاه من اتجاه الطائرة. تم دمج الطائرات الثلاث، لخلق تقديم 3-D من القلب.المنطقة الحمراء الدائرة داخل inset يظهر اثنين من قلوب الماوس شفافة بعد خضوعه تقنية وضوح ويجري إدراجها في أنابيب الزجاج borosilicate. بالإضافة إلى دراسة الفئران بعد الولادة، يمكن استخدام نظام التصوير أيضًا لدراسة قلب الفأر البالغ. هنا، يتم عرض قنوات ROMK الموسومة من GFP في 7.5 أشهر.وُجدت هذه الذّات بشكل رئيسي في جدار البطين. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في دقيقة إلى دقيقتين. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم إزالة جميع الفقاعات حول العينة في الأنبوب.يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تجزئة تكدس الصور تلقائيًا، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بإصابة القلب والأوعية الدموية والتجدد. بعد تطورها ، استخدم الباحثون هذه التقنية لدراسة هندسة القلب في مراحل النمو بعد الولادة والبالغين في الفئران.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

المريض محددة النمذجة من القلب: تقدير توجهات الألياف البطيني

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

بياكسيال الخصائص الميكانيكية لصمامات القلب بي

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

زرع رقعة مطبوعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد في نموذج مورين من احتشاء عضلة القلب

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...