Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
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作者希望向加州大学洛杉矶分校的邵阮和淳浩表示感谢, 他们为小鼠提供了图像样本。这项研究得到了 NIH HL118650 (粽子 k Hsiai) 的资助, HL083015 (粽子 k Hsiai), HD069305 (到北卡罗来纳州和粽子 k Hsiai), HL111437 (粽子 k. Hsiai 和北卡罗来纳州), HL129727 (粽子 k Hsiai), 德克萨斯大学系统明星资助 (Juhyun李)。

所有涉及使用动物的程序都已被加州大学洛杉矶分校的机构审查委员会 (IACUC) 批准。
1. 成像系统设置
注: 见图 1和图 2。
<ol><li>检索3波长的连续波 (CW) 激光器: 405 nm、473 nm 和 532 nm。将2镜 (M1 和 M2) 分开150毫米, 并将其与在45°上的镜面平面对准光束。 注意: 执行此步骤可将激光从双面照明设置中重定向。产生...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. 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V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

这里描述的 LSFM 系统和技术利用双侧照明光束和光清除相结合, 在产后和成人阶段对鼠标心脏进行图像处理。传统的单一光照光束受光子散射和吸收通过更厚和更大的组织样本1,3。双面光束为样品提供了更均匀的光照, 从而最大限度地减少了条带和其他工件在单面光照产生的图像中经常看到的效果。该技术还可以通过调整双高斯光束8的...

光片荧光显微镜是1903年首次开发的一种技术, 目前作为一种研究基因表达的方法, 也用于生产3维或4维组织样本1,2,3的模型。这种成像方法使用一层薄薄的光来照亮样本的单个平面, 以便只有该平面被探测器捕获。然后, 可以在轴向方向移动样本以捕获每一层, 一次一节, 并在获得的图像4后处理后呈现一个3维模型。然而, 由于光子的吸收和散射, LSFM 仅限于几微米厚或光学上透明1的样品。
LSFM 的局限性导致了对生物体的广泛研究, 这些有机体具有光学上透明的组织, 如斑马鱼。有关心脏发育和分化的研究往往是对斑马鱼, 因为有保守的基因之间的人和斑马鱼5,6。尽管这些研究已经导致了与心肌6,7相关的心脏研究的进展, 但仍有必要对哺乳动物等高级生物进行类似的研究。
哺乳动物的心脏组织提出了一个挑战, 由于组织的厚度和不透明, 红细胞中血红蛋白的吸收, 以及在传统的 LSFM 方法下, 由于样品单面光照产生的条带.1,8. 为了弥补这些限制, 我们建议使用双侧照明和简化版的清晰度技术9结合折射率匹配解决方案 (轮辋)。因此, 该系统允许对大于 10 x 10 x 10 毫米3的样本进行成像, 同时在轴向和侧面平面上保持良好的质量分辨率8。
该系统是第一次校准使用荧光珠安排在不同的配置在玻璃管。然后, 该系统用于图像产后和成年鼠心脏。首先, 产后鼠心脏被成像7天 (P7), 以揭示心室腔, 心室壁的厚度, 瓣膜结构, 和 trabeculation 的存在。其次, 研究了在1天 (P1) 用培养的心肌细胞和黄色荧光蛋白 (YFP), 通过使用产后小鼠心脏, 来识别将会分化为细胞的干细胞。最后, 7.5 月的成年小鼠在基因治疗后观察到肾外髓质钾 (ROMK) 通道的存在,8。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

光片荧光显微技术已广泛应用于从微米到毫米尺度的高轴向分辨率的快速图像采集。传统的光片技术涉及在样品组织中使用单一光照束定向正交。使用单一光照光束制作的大型样品的图像含有条纹或工件, 由于组织的散射和吸收, 导致分辨率降低。本研究采用双侧光照光束和简化的小鼠心脏清晰度光清除技术。这些技术可以通过去除心脏的脂质和产生一个大的成像领域, 大于 10 x 10 x 10 毫米3, 更深层次的成像。因此, 这一策略使我们能够量化的心室尺寸, 跟踪心脏谱系, 并本地化的心脏特异性蛋白和离子通道的空间分布, 从产后到成年小鼠心脏有充分的对比度和分辨率。

这里描述的技术使用了双侧照明光束结合光清除鼠标心脏组织样本, 以达到更深的成像深度和更大的成像量, 有足够的成像分辨率 (图 1)。为了校准系统, 荧光珠被放置在玻璃管和成像系统内。然后将珠子在 x-y 平面、y z 平面和 x z 平面上进行成像和可视化, 以获得系统8的点扩展函数 (PSF)。系统标定产生了在 d侧向≈2.8 µm 的横...

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Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

本研究采用双侧光照光片荧光显微镜 (LSFM) 技术, 结合光清除法对小鼠心脏进行研究。

光片荧光显微术在小鼠心脏研究中的应用

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

这项技术的主要优点是，它允许对鼠标心脏进行快速成像。它可以用来观察基因治疗后空气通道的存在。虽然此方法可以提供对心脏病学发展有深入的见解，但它也可以应用于其他系统，如神经学和肺病学。一般来说，个人将很难与这种技术，因为安装成人小鼠心脏成像可能很困难，它不同于其他传统技术，如共和和倒置显微镜。放置三个波长为 405 纳米、473 纳米和 532 纳米的连续波激光器。然后，粘贴一面镜子，并在 45 度时将其与镜面对齐。这将将激光引导到光束分路器，从而形成双面照明设置。接下来，通过一个直径为50毫米的中性密度滤波器、一个光束膨胀器和一个直径为25毫米的针孔，所有位置彼此150毫米。通过 50-50 光束分路器，从针孔放置 150 毫米。接下来，将两个 150 毫米的镜面从光束分离器放置，在 90 度处放置到正向光束，并对齐它，使其镜面与光束保持 45 度角。然后，将镜子从镜子二处放置三个 100 毫米，并对齐镜子，使其镜面与从镜像二反射的光束保持 45 度角。使用此反射光束形成双照明灯片的一侧。在梁分离器的远侧，放置镜面 5，以便其镜面在 45 度处，以向前进方向发射的光束。使用镜子五发出的光束形成双照明灯片的第二面。其次，以系统的方式建立双面照明系统。将圆柱透镜两个 150 毫米远离镜子三，另一个相同的圆柱透镜 150 毫米远离镜子五，在另一侧的双照明设置。接下来，放置两面镜子，每面与圆柱镜一样，距离为 50 毫米，以 90 度反射光束。在光片的两侧，从一对透镜中形成一个无色双片，第一个镜头从前一面镜子放置100毫米，直径1英寸，焦距为100毫米。第二个镜头应放置在镜头一的160毫米，直径为一英寸，焦距为60毫米。然后，将照明目标从以前的无色双精度线放置 1 和 2 个 150 毫米，以便它们与光束一致。从目标发出的光束形成用于成像样品的光片。首先，在预热折射率匹配溶液中稀释0.53微米珠溶液（1至15万）来制备荧光珠样品，用1%的低熔体指向阿加糖。接下来，使用一块内径为 12 毫米、外径为 18 毫米、长度为 30 毫米的硅酸盐玻璃管。在硅酸盐管中移液珠子，使红糖在室温下凝固。现在，用 99.5% 的陀螺仪溶液填充 3D 打印 ABS 腔室。将含有珠子的硅酸盐玻璃管放在室内。将三维电动平移级连接到硅酸盐玻璃管，以控制 ABS 腔室中样品的移动和方向。然后，使用自定义设计的软件以每秒 30 帧的速度使用 sCMOS 摄像机获取图像。使用电机控制器，将样品在横向方向移动一毫米，并在每一毫米增量中获取图像，直到对整个样品进行成像。使用可视化软件堆叠采集的图像，并使用这些珠子图像测量系统的点传播功能。使用 pH 为 7.5 的折射率匹配溶液，将 1% 的 agarose 溶解到匹配溶液中。将清除的成年小鼠心脏样本放入折射率匹配溶液中，溶解百分之一的阿加罗斯。然后，将样品插入硅酸盐玻璃管中，使糖在室温下凝固。将三维电动平移级连接到硅酸盐玻璃管，以控制三维打印 ABS 腔室中样品的移动和方向。放置样品，使样品位于由双照明系统创建的高斯光束的中心。然后，将 sCMOS 摄像机的采集速率设置为每秒 30 帧。现在，使用电机控制器，将样品在轴向方向上移动一毫米，并在每一毫米增量下获取图像。继续，直到整个样本被成像。使用可视化软件堆叠获取的图像。使用这些图像堆栈开发三有图像。为此，可以解构以前确定的点传播函数，并用于获取的图像堆栈。最后，设置像素阈值强度值以观察心脏的轮廓，并基于此灰度强度向图像添加伪色。在产后的第一天，人们可以可视化的阀门，中庭，心室，腹膜肌肉，和撕裂，以及其他功能。在产后第七天，特征更加明确。心房、心室、心室腔尺寸和心室壁厚都很明显。为了研究心脏内的心肌细胞分化，异质细胞敲击小鼠被贴上了微环标签，以显示心肌细胞。标记的单元格显示在这里，在每个平面方向。三个平面被合并，以创建心脏的三D渲染。内嵌内的红色圆圈区域显示两个半透明的小鼠心后，通过进行清晰度技术，并插入到硅酸盐玻璃管。除了研究产后小鼠，成像系统还可用于研究成年小鼠心脏。在这里，GFP 标记的 ROMK 频道显示在 7.5 个月。这些主要发现在心室壁。一旦掌握了，这项技术可以在一到两分钟内完成。尝试此过程时，必须清除管中样品周围的所有气泡。其他方法（如图像堆栈的自动分段）可以执行，以回答与心血管损伤和再生相关的其他问题。研究者在发育后，利用该技术研究小鼠产后和成人发育阶段的心脏结构。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

房室心脏瓣膜的双轴力学特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

定量荧光显微镜为基础的单脂体测定，用于检测单个脂质体之间的成分不均匀性

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

心肌梗塞穆林模型中的 3D 生物打印贴片移植

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...