Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for Thao Nguyen og Atsushi Nakano fra UCLA for at give eksemplet mus til billede. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NIH HL118650 (til Tzung K. Hsiai), HL083015 (til Tzung K. Hsiai), HD069305 (til N. C. Chi og Tzung K. Hsiai.), HL111437 (til Tzung K. Hsiai og N. C. Chi), HL129727 (til Tzung K. Hsiai) og University of Texas System stjerner finansiering (til Juhyun Lee).

Alle de procedurer, der involverer brug af dyr er blevet godkendt af institutionelle anmeldelse udvalg (IACUC) på University of California, Los Angeles, Californien.
1. imaging System Setup
Bemærk: Se figur 1 og figur 2.
<ol><li>Hente en kontinuerlig bølge (CW) laser med 3 bølgelængde: 405 nm, 473 nm og 532 nm. Sted 2 spejle (M1 og M2) 150 mm fra hinanden og bringe dem på linje med deres spejl fly p...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM system og teknik beskrevet her udnytter en dobbelt-sidet belysning stråle kombineret med en optisk clearing til billede mus hjertet på efter fødslen og voksen stadier af dets udvikling. En traditionel enkelt belysning stråle lider photon spredning og absorption gennem tykkere og større væv prøver1,3. De dobbelt-sidet bjælker giver en mere jævn belysning af den prøve, derved at minimere effekten af striping og andre artefakter, der ofte ses i billed...

Lys-ark Fluorescens mikroskopi var en teknik, først udviklet i 1903 og bruges i dag som en metode til at studere genekspression og også til at fremstille 3D- eller 4-D modeller af væv prøver1,2,3. Denne billedbehandling metode bruger en tynd plade af lys til at belyse et enkelt fly af en prøve, således at kun at flyet er fanget af detektoren. Prøven kan derefter flyttes i aksial retning at fange hvert lag, en sektion ad gangen, og gøre en 3D-model efter efterbehandling af erhvervede billeder4. Men på grund af absorption og spredning af fotoner, LSFM har været begrænset til prøver, der er enten et par mikron tyk eller optisk gennemsigtig1.
Begrænsninger i LSFM har ført til omfattende undersøgelser af organismer, der har væv, der er optisk gennemsigtige, såsom zebrafisk. Undersøgelser, hvor hjertets udvikling og differentiering er ofte udført på zebrafisk siden der er bevarede gener mellem mennesker og zebrafisk5,6. Selv om disse undersøgelser har ført til fremskridt i hjertets forskning relateret til cardiomyopatier6,7, er der stadig behov for at gennemføre lignende forskning på højere niveau organismer såsom pattedyr.
Hjerte pattedyrvæv præsenterer en udfordring på grund af tykkelsen og opacitet af væv, absorption på grund af hæmoglobin i røde blodlegemer, og den opdeling, der opstår på grund af et enkeltsidet belysning af prøven under traditionelle LSFM metoder1 , 8. for at kompensere for disse begrænsninger, vi har foreslået at bruge dobbelt-sidet belysning og en forenklet version af klarhed teknik9 kombineret med et brydningsindeks matchende løsning (fælge). Derfor, dette system giver mulighed for billeddannelse af en stikprøve, der er større end 10 x 10 x 10 mm3 mens opretholde en god kvalitet opløsning i den aksiale og laterale fly8.
Dette system blev først kalibreret ved hjælp af fluorescerende perler arrangeret i forskellige konfigurationer i glas slangen. Derefter, at systemet blev brugt til at billede efter fødslen og voksen murine hjerter. Først, den postnatale mus hjerte blev afbildet på 7 dage (P7) til at afsløre den ventrikulære hulrum, tykkelsen af den ventrikulære væg, ventil strukturer og tilstedeværelsen af trabeculation. For det andet blev en undersøgelse udført for at identificere celler, der vil differentiere i cardiomyocytes ved hjælp af et postnatal mus hjerte på 1 dag (P1) med Cre-mærket cardiomyocytes og gul fluorescerende proteiner (YFP). Endelig blev voksen mus på 7,5 måneder afbildet for at konstatere tilstedeværelsen af renal ydre medullær kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi har været meget anvendt til hurtig billede erhvervelse med en aksial højopløselige fra mikrometer til millimeter skala. Traditionelle lys-ark teknikker indebærer brug af en enkelt belysning stråle rettet vinkelret på vævsprøve. Billeder af store prøver, der er fremstillet ved hjælp af en enkelt belysning stråle indeholder striber eller artefakter og lider af en reduceret opløsning på grund af spredning og absorption af lys ved væv. Denne undersøgelse anvender en dobbelt-sidet belysning stråle og en forenklet klarhed optisk clearing teknik for murine hjertet. Disse teknikker giver mulighed for dybere billeddannelse ved at fjerne lipider fra hjertet og producere et stort felt af imaging, større end 10 x 10 x 10 mm3. Som et resultat, denne strategi gør det muligt at kvantificere de ventrikulære dimensioner, spore hjerte slægt og lokalisere den geografiske fordeling af hjertestop-specifikke proteiner og ion-kanaler fra den postnatale til voksen mus hjerter med tilstrækkelig kontrast og opløsning.

Den teknik beskrevet brugt her en dobbelt-sidet belysning stråle kombineret med en optisk clearing af vævsprøver mus hjertet for at opnå en dybere imaging dybde og en større imaging volumen med tilstrækkelig imaging opløsning (figur 1). Hvis du vil kalibrere systemet, blev fluorescerende perler placeret inde glas slangen og inden for billedbehandling system. Perlerne blev derefter afbildet og visualiseret i x-y plane, y-z planet, og i x-z planet, for a...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Denne undersøgelse anvender en dobbelt-sidet belysning lys-ark Fluorescens mikroskopi (LSFM) teknik kombineret med optisk clearing for at studere murine hjertet.

Lys-ark Fluorescens mikroskopi for studiet af Murine hjertet

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Den største fordel ved denne teknologi er, at det giver mulighed for hurtig billeddannelse af enten musens hjerte. Og det kan bruges til at observere tilstedeværelsen af luftkanaler efter genterapi. Selv om denne metode kan give indsigt i udvikling kardiologi, det kan også anvendes til andre systemer, såsom neurologi og pulmonologi.Generelt vil enkeltpersoner kæmpe med denne teknik, fordi montering af en billeddannelse af den voksne mus hjerte kan være svært, og det er forskelligt fra andre, traditionelle teknikker, såsom konfokale og omvendt mikroskopi. Placer en kontinuerlig bølge laser med tre bølgelængder af 405 nanometer, 473 nanometer, og 532 nanometer. Derefter anbringe spejl en og tilpasse det med spejlet flyet ved 45 grader til strålen.Dette vil lede laseren mod strålesplitteren, som danner den dual-sidede belysningsopsætning. Dernæst passerer strålen gennem en 50 millimeter diameter neutral tæthed filter, en stråle expander, og en 25 millimeter diameter pin hul, alle placeret 150 millimeter fra hinanden. Pass strålen gennem en 50-50 stråle splitter, placeret 150 millimeter fra pinhole.Dernæst skal du placere spejl to 150 millimeter fra bjælken splitter, ved 90 grader til den forreste stråle, og tilpasse den, så dens spejl plan er i en 45 graders vinkel til strålen. Derefter sted spejl tre 100 millimeter fra spejl to, og tilpasse det, så det spejl plan er i en 45 graders vinkel til strålen reflekteres fra spejl to. Brug denne reflekterede stråle til at danne den ene side af det dobbelte belysningslysark.På den anden side af bjælken splitter, sted spejl fem, så det spejl plan er på 45 grader til den stråle, der udsendes i en fremadrettet retning. Brug den stråle, der udsendes fra spejl fem, til at danne den anden side af det dobbelte lysark. Dernæst skal du oprette det dobbeltsidede belysningssystem på systemisk vis.Placer cylindrisk linse to 150 millimeter væk fra spejl tre, og en anden identisk cylindrisk linse 150 millimeter væk fra spejl fem, på den anden side af den dobbelte belysning setup. Dernæst placere to spejle, hver i overensstemmelse med de cylindriske linser, på afstande på 50 millimeter for at afspejle strålen ved 90 grader. På begge sider af lysarket danner en akromatisk doublet fra et par linser, hvor den første linse placeres 100 millimeter fra det tidligere spejl og har en diameter på en tomme og en brændvidde på 100 millimeter.Den anden linse skal placeres 160 millimeter fra linse en, med en diameter på en tomme, og en brændvidde på 60 millimeter. Derefter placere belysning mål en og to 150 millimeter fra de tidligere akromatisk doublets, så de er i overensstemmelse med strålen. Den stråle, der udsendes fra målene, danner lysarket til billeddannelse af prøverne.Først forberede fluorescerende perle prøve ved at fortynde en 0,53 mikrometer perle opløsning, en til 150, 000, i en præ-opvarmet brydningsindeks matchende opløsning, med en procent lav smelte peger agarose. Brug derefter et stykke borosilikatglasrør med en indre diameter på 12 millimeter og en ydre diameter på 18 millimeter til en længde på 30 millimeter. Pipette perle agarose opløsning i borosilikat slange og lad agarose at størkne ved stuetemperatur.Nu fylde en 3-D trykt ABS kammer med en 99,5 procent gylcerol løsning. Placer borosilikat glasrør, der indeholder perlerne, inde i kammeret. Fastgør en 3D motoriseret translationel fase til borosilikatglasslangen for at styre prøvens bevægelse og orientering i ABS-kammeret.Brug derefter specialdesignet software til at erhverve billeder ved hjælp af sCMOS-kameraet med en hastighed på 30 billeder pr. sekund. Brug motorcontrolleren til at flytte prøven en millimeter i sideretningen og hente billeder ved hvert enkelt millimeterinterval, indtil hele prøven er afbildet. Stak de erhvervede billeder ved hjælp af en visualisering software, og måle punkt spredning funktion af systemet ved hjælp af disse perle billeder.Brug en brydningsindeks matchende opløsning, med en pH-værdi på 7,5, og opløse en procent agarose i matchende opløsning. Placer en ryddet voksen mus hjerte prøve i brydningsindeks matchende løsning, med en procent agarose opløst. Derefter indsættes prøven i borosilikatglasrør, og lad agarose at størkne ved stuetemperatur.Fastgør en 3D motoriseret translationel fase til borosilikatglasslangen for at styre prøvens bevægelse og orientering i et 3D-printet ABS-kammer. Placer prøven, så den er i midten af gaussiske stråle, skabt af det dobbelte belysningssystem. Derefter indstille erhvervelse sats af sCMOS kamera til 30 billeder i sekundet.Nu, ved hjælp af motor controller, flytte prøven en millimeter i aksial retning og erhverve billeder på hver en millimeter interval. Fortsæt, indtil hele eksemplet er afbildet. Stable de erhvervede billeder ved hjælp af en visualisering software.Udvikt 3D-billederne ved hjælp af disse billedstakke. For at opnå dette, dekonvolve punkt spredning funktion bestemmes tidligere, og udnytte det for de erhvervede billede stakke. Endelig skal du indstille en pixelgrænseintensitetsværdi for at observere hjertets konturer og føje pseudofarve til billederne baseret på denne gråskalaintensitet.På dag ét post-natal, kan man visualisere ventiler, atrium, hjertekammer, pektinate muskel, og trabeculation, blandt andre funktioner. På dag syv efter fødslen, er funktionerne endnu mere defineret. Atrium, hjertekammer, ventrikelhule dimensioner, og ventrikel vægtykkelse er alle indlysende.At studere cardiomyocyte differentiering i hjertet, heterozygode mus blev cre-mærket til at vise kardiomyocytter. De mærkede celler vises her i hver planretning. De tre fly blev slået sammen for at skabe en 3D-gengivelse af hjertet.Den røde cirkel region i indsat viser to gennemskinnelige mus hjerter efter at have gennemgået klarhed teknik og blive indsat i borosilikat glasrør. Ud over at studere postnatale mus kan billeddannelsessystemet også bruges til at studere det voksne musehjerte. Her vises GFP-mærkede ROMK-kanaler efter 7,5 måneder.Disse blev hovedsageligt fundet i ventrikelvæggen. Når mestrer, kan denne teknik gøres i et til to minutter. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at fjerne alle boblerne omkring prøven i røret.Andre metoder, såsom automatisk segmentering af billedet stakke, kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål i forbindelse med hjerte-kar-skade og regenerering. Efter dens udvikling, denne teknik blev brugt af forskere til at studere hjertearkitektur i postnatal og voksen udviklingsmæssige stadier i mus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specifikke Modeling of the Heart: Estimering af Ventrikulære fiberorienteringer

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaksiale mekaniske beskrivelser af atrioventrikulær hjerteklapper

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Transplantation af en 3D Bioprinted Patch i en Murine model af myokardieinfarkt

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...