Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

De auteurs wil dankbaarheid uiten aan Thao Nguyen en Atsushi Nakano uit UCLA voor het verstrekken van het monster van de muizen naar afbeelding. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (naar Tzung K. Hsiai), HL083015 (naar Tzung K. Hsiai), HD069305 (te N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (aan Tzung K. Hsiai en N. C. Chi), HL129727 (naar Tzung K. Hsiai) en Universiteit van Texas systeem "STARS" financiering (Juhyun Lee).

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling commissies (IACUC) aan de Universiteit van Californië, Los Angeles, Californië.
1. imaging System Setup
Opmerking: Zie Figuur 1 en Figuur 2.
<ol><li>Ophalen van een continuous wave (CW) laser met 3 golflengten: 405 nm, 473 nm, en 532 nm. Plaats 2 spiegels (M1 en M2) 150 mm uit elkaar en sluiten ...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

Het LSFM systeem en de hier beschreven techniek maakt gebruik van een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing naar afbeelding het hart van de muis in postnatale en volwassen stadia van haar ontwikkeling. Een traditionele interne verlichting straal lijdt aan foton verstrooiing en absorptie via dikker en groter weefsel monsters1,3. De tweezijdig balken zorgen voor een gelijkmatiger verlichting van het monster, aldus het minimalise...

Licht vel fluorescentie microscopie was een techniek die in 1903 voor het eerst ontwikkeld en vandaag wordt gebruikt als een methode om te studeren van genexpressie en ook om 3D- of 4-D modellen van weefsel monsters1,2,3te produceren. Een dun blad van licht deze beeldvorming methode gebruikt voor het verlichten van een enkel vliegtuig van een sample zodat alleen dat vliegtuig is vastgelegd door de detector. Het monster kan vervolgens worden verplaatst in de axiale-richting te vangen elk layer, een sectie op een moment, en het renderen van een 3D-model na de nabewerking van de beelden van de verworven4. Echter als gevolg van de absorptie en verstrooiing van fotonen, heeft LSFM is beperkt tot monsters die ofwel een paar microns dik of optisch transparant1.
De beperkingen van LSFM hebben geleid tot uitgebreide studies van organismen die weefsels die optisch transparant zijn, zoals de zebravis hebben. Studies waarbij cardiale ontwikkeling en differentiatie worden vaak uitgevoerd op zebrafish aangezien er geconserveerde genen tussen mens en zebrafish5,6. Hoewel deze studies hebben geleid tot vooruitgang in de cardiale onderzoek met betrekking tot hartziekten6,7, moet er nog een soortgelijk onderzoek op een hoger niveau organismen zoals zoogdieren.
Zoogdieren cardiale weefsel uitdaging een vanwege de dikte en de opaciteit van het weefsel, de absorptie te wijten aan hemoglobine in rode bloedcellen en de striping die optreedt als gevolg van ' single-sided verlichting van het monster onder traditionele LSFM methoden1 , 8. om te compenseren voor deze beperkingen, hebben wij voorgesteld om tweezijdig verlichting en een vereenvoudigde versie van de duidelijkheid techniek9 gecombineerd met een brekingsindex bijpassende oplossing (velgen) te gebruiken. Dus, dit systeem zorgt voor de beeldvorming van een steekproef die groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3 terwijl het handhaven van een goede kwaliteit-resolutie op de axiale en laterale vliegtuigen8.
Dit systeem werd eerst gekalibreerd met behulp van fluorescerende kralen gerangschikt in verschillende configuraties binnen de glazen buis. Het systeem werd vervolgens gebruikt om het imago van postnatale en volwassen lymfkliertest harten. Ten eerste was het postnatale muis hart beeld op 7 dagen (P7) te onthullen de ventriculaire Holte, de dikte van de ventriculaire muur, de structuren van de klep en de aanwezigheid van trabeculation. Ten tweede, een studie werd uitgevoerd om cellen die in cardiomyocytes onderscheiden zou met behulp van een postnatale muis hart op 1 dag (P1) met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes en gele fluorescerende eiwit (YFP). Tot slot werden volwassen muizen op 7,5 maanden beeld om te zien hoe de aanwezigheid van renale buitenste Wallenberg kalium (ROMK) kanalen na gene therapie8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Licht vel fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt voor snelle Beeldacquisitie met een hoge axiale resolutie van micrometer op millimeter schaal. Traditionele licht vel technieken omvatten het gebruik van een interne verlichting lichtbundel orthogonaal gericht monster weefsel. Beelden van grote monsters die worden geproduceerd met behulp van een interne verlichting straal bevatten strepen of artefacten en lijden aan een lagere resolutie als gevolg van de verstrooiing en absorptie van licht door het weefsel. Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting lichtbundel en een vereenvoudigde duidelijkheid optische techniek voor het lymfkliertest hart wissen. Deze technieken zorgen voor diepere beeldvorming door het verwijderen van lipiden uit het hart en produceren van een groot gebied van imaging, groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3. Dientengevolge, deze strategie ons in staat stelt te kwantificeren van de ventriculaire afmetingen, bijhouden van de cardiale bloedlijn en lokaliseren van de ruimtelijke spreiding van de cardiale-specifieke proteïnen en ionenkanalen van de postnatale aan volwassen muis hart met voldoende contrast en resolutie.

De techniek beschreven gebruikt hier een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing van muis hart weefselsteekproeven te komen tot een diepere imaging diepte en een grotere beeldvorming volume met voldoende grafische resolutie (Figuur 1). Als u wilt kalibreren van het systeem, werden fluorescerende kralen geplaatst in de glazen buis en binnen het imaging systeem. De parels werden vervolgens beeld en gevisualiseerd in de x-y vla...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat het zorgt voor een snelle beeldvorming van ofwel de muis hart. En het kan worden gebruikt om de aanwezigheid van luchtkanalen te observeren na gentherapie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in ontwikkelingscardiologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals neurologie en longologie.Over het algemeen zullen individuen worstelen met deze techniek, omdat het monteren van een beeldvorming van het volwassen muishart moeilijk kan zijn, en het is anders dan andere, traditionele technieken, zoals confocale en omgekeerde microscopie. Plaats een continue golflaser met drie golflengten van 405 nanometer, 473 nanometer en 532 nanometer. Breng vervolgens spiegel één aan en lijn deze uit met het spiegelvlak op 45 graden aan de balk.Dit zal de laser naar de straalspleter leiden, die de dubbelzijdige verlichtingsopstelling vormt. Vervolgens passeert u de straal door een neutraal dichtheidsfilter met een diameter van 50 millimeter, een balk-uitvouwer en een speldengat met een diameter van 25 millimeter, allemaal 150 millimeter van elkaar geplaatst. Geef de balk door een 50-50 balk splitter, geplaatst 150 millimeter van het gaatje.Plaats vervolgens twee 150 millimeter van de balkspl splitter, bij 90 graden naar de voorwaartse balk, en lijn deze uit zodat het spiegelvlak zich in een hoek van 45 graden naar de balk bevindt. Plaats vervolgens spiegel drie 100 millimeter van spiegel twee, en uitlijnen zodat het spiegel vlak is in een hoek van 45 graden aan de balk gereflecteerd van spiegel twee. Gebruik deze gereflecteerde straal om één kant van de dubbele verlichtingslichtplaat te vormen.Aan de andere kant van de balk splitter, plaats spiegel vijf, zodat het spiegel vlak is op 45 graden aan de balk die wordt uitgezonden in een voorwaartse richting. Gebruik de straal die van spiegel vijf wordt uitgezonden om de tweede zijde van het dubbele verlichtingslichtblad te vormen. Zet vervolgens het dubbelzijdige verlichtingssysteem systemisch op.Plaats cilindrische lens twee 150 millimeter uit de buurt van spiegel drie, en een andere identieke cilindrische lens 150 millimeter uit de buurt van spiegel vijf, aan de andere kant van de dubbele verlichting setup. Plaats vervolgens twee spiegels, elk in lijn met de cilindrische lenzen, op afstanden van 50 millimeter om de balk op 90 graden te reflecteren. Aan beide zijden van de lichtplaat, vormen een achromatische doublet van een paar lenzen, met de eerste lens wordt geplaatst 100 millimeter van de vorige spiegel, en met een diameter van een inch en een brandpuntsafstand van 100 millimeter.De tweede lens moet worden geplaatst 160 millimeter van lens een, met een diameter van een inch, en een brandpuntsafstand van 60 millimeter. Plaats vervolgens de verlichtingsdoelstellingen één en twee 150 millimeter van de vorige achromatische doubletten, zodat ze in lijn zijn met de balk. De straal die uit de doelstellingen wordt uitgezonden, vormt de lichtplaat voor het beeldvorming van de monsters.Bereid eerst het fluorescerende kraalmonster voor door een 0,53 micrometer kraaloplossing, één tot 150.000, te verdunnen in een voorverwarmde refractieve indexmatchingoplossing, met een procent lage smeltmoer. Gebruik vervolgens een stuk borosilicaat glazen buizen met een binnendiameter van 12 millimeter, en een buitendiameter van 18 millimeter, tot een lengte van 30 millimeter. Pipette de kraal agarose oplossing in de borosilicaat buizen en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur.Vul nu een 3D-geprinte ABS-kamer met een gylceroloplossing van 99,5 procent. Plaats de borosilicaat glazen buizen, met de kralen, in de kamer. Bevestig een 3D gemotoriseerde translationele fase aan de borosilicaat glazen buizen om de beweging en oriëntatie van het monster in de ABS-kamer te controleren.Gebruik vervolgens op maat ontworpen software om afbeeldingen te verkrijgen met behulp van de sCMOS-camera, met een snelheid van 30 frames per seconde. Met behulp van de motorcontroller verplaatst u het monster een millimeter in de zijrichting en verwerft u beelden bij elke toename van één millimeter, totdat het hele monster is afgebeeld. Stapel de verkregen afbeeldingen met behulp van een visualisatiesoftware en meet de puntspreadfunctie van het systeem met behulp van deze kraalafbeeldingen.Gebruik een refractieve index matching oplossing, met een pH van 7,5, en los een procent agarose in de bijpassende oplossing. Plaats een gewist volwassen muis hart monster in de brekingsindex matching oplossing, met een procent agarose opgelost. Steek vervolgens het monster in de glazen buizen van borosilicate en laat de agarose stollen bij kamertemperatuur.Bevestig een 3D gemotoriseerde translationele fase aan de borosilicaat glazen buizen om de beweging en oriëntatie van het monster in een 3D-geprinte ABS-kamer te controleren. Plaats het monster zo dat het zich in het midden van de Gaussische balk bevindt, gecreëerd door het dubbele verlichtingssysteem. Stel vervolgens de aanschafsnelheid van de sCMOS-camera in op 30 frames per seconde.Nu, met behulp van de motor controller, verplaats het monster een millimeter in de axiale richting en het verwerven van beelden op elke een millimeter toename. Ga door totdat het hele voorbeeld is afgebeeld. Stapel de verkregen afbeeldingen met behulp van een visualisatiesoftware.Ontwikkel de 3D-afbeeldingen met behulp van deze afbeeldingsstapels. Om dit te bereiken, deconvolve de punt spread functie eerder bepaald, en gebruik het voor de verworven afbeelding stapels. Stel ten slotte een pixeldrempelintensiteit in om de contouren van het hart te observeren en voeg pseudo-kleur toe aan de afbeeldingen, op basis van deze intensiteit van de grijsschaal.Op dag één postnatale, kan men visualiseren de kleppen, atrium, ventrikel, pectinate spier, en trabeculatie, onder andere functies. Op dag zeven postnatale, de functies zijn nog meer gedefinieerd. Het atrium, ventrikel, ventriculaire spouwafmetingen en ventrikelwanddikte zijn allemaal duidelijk.Om cardiomyocyte differentiatie in het hart te bestuderen, werden heterozygoot-in muizen cre-gelabeld om cardiomyocyten te tonen. De gelabelde cellen worden hier weergegeven, in elke richting van het vlak. De drie vliegtuigen werden samengevoegd, om een 3D-weergave van het hart te creëren.Het rode omcirkelde gebied binnen de inzet toont twee doorschijnende muisharten na het ondergaan van de helderheidstechniek en wordt in de borosilicaatglazenbuis geplaatst. Naast het bestuderen van postnatale muizen, kan het beeldvormingssysteem ook worden gebruikt om het volwassen muizenhart te bestuderen. Hier worden GFP-gecodeerde ROMK-kanalen getoond na 7,5 maanden.Deze werden voornamelijk gevonden in de ventriculaire muur. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in een tot twee minuten. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om alle bellen rond het monster in de buis te verwijderen.Andere methoden, zoals automatische segmentatie van de beeldstapels, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen met betrekking tot cardiovasculaire schade en regeneratie te beantwoorden. Na de ontwikkeling werd deze techniek door onderzoekers gebruikt om de hartarchitectuur te bestuderen in postnatale en volwassen ontwikkelingsstadia bij muizen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patiënt-specifieke modellering van het Hart: Schatting van ventriculaire vezeloriëntaties

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mechanische karakteristieken van Atrioventriculaire hartkleppen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Transplantatie van een 3D Bioprinted Patch in een Murine Model van Myocardikoesie Infarct

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...