Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

המחברים רוצה להביע את תודתי תאו נגוין, אטסשי נאקאנו מ- UCLA למתן את הדגימה עכברים לתמונה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH HL118650 (ל Tzung ק Hsiai), HL083015 (ל Tzung ק Hsiai), HD069305 (כדי ש ג צ'י Tzung ק Hsiai.), HL111437 (ל Tzung ק Hsiai ו ש ג צ'י), HL129727 (ל Tzung ק Hsiai) ומערכת אוניברסיטת טקסס כוכבים מימון (כדי Juhyun לי).

כל ההליכים הקשורים בבעלי החיים אושרו על ידי המוסדיים סקירה ועדות (IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה.
1. התקנת מערכת הדמיה
הערה: ראה איור 1 באיור 2.
<ol><li>לאחזר לייזר (CW) רציף wave עם אורכי גל 3: 405 ננומטר, 473 ננומטר, 532 ננו...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

מערכת LSFM ואת בטכניקה המתוארת כאן מנצל קרן דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי תמונת הלב העכבר אחרי לידה ומבוגרים שלבי התפתחותה. קרן תאורה יחיד מסורתי סובל הפוטונים פיזור וקליטה דרך רקמות עבה יותר, גדול יותר דגימות1,3. הקורות דו-צדדית לספק תאורה אפילו יותר של ?...

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות הייתה הטכניקה פותחה לראשונה בשנת 1903 ומשמש היום כשיטה ללמוד ביטוי גנים וגם לייצר מודלים תלת-ממדי או 4-D של רקמות דגימות1,2,3. שיטה הדמיה זו משתמשת סדין דק של אור כדי להאיר מטוס בודד של מדגם כך רק את המטוס הוא נלכד על ידי הגלאי. המדגם יכול להיות עבר לכיוון-צירית ללכוד כל שכבה, מקטע אחד בכל פעם, ועיבוד דגם תלת-ממדי לאחר עיבוד שלאחר של תמונות רכשה4. עם זאת, עקב ספיגת פיזור של פוטונים, LSFM הוגבלה על דוגמאות או מיקרונים אחדים עבה או שטיחות שקוף1.
המגבלות של LSFM הובילו מחקרים מקיפים של אורגניזמים בעלי רקמות שקופים אופטים, כגון דג זברה. מחקרים שכללו פיתוח לב ובידול נערכות לעיתים קרובות על דג זברה מאז ישנם גנים שנשמרת בין בני האדם לבין דג זברה5,6. למרות מחקרים אלו הובילו ההתקדמות במחקר הלב הקשורים6,cardiomyopathies7, יש עדיין צורך לערוך מחקר דומה על אורגניזמים ברמה גבוהה יותר כגון יונקים.
יונקים ברקמת הלב מהווה אתגר עקב עובי האטימות של הרקמה, קליטתם עקב המוגלובין כדוריות דם אדומות, וכן את פיזור המתרחשת עקב תאורה חד צדדית של הדגימה תחת LSFM מסורתיים שיטות1 , 8. כדי לפצות על מגבלות אלה, הצענו להשתמש תאורה דו-צדדית, גרסה מפושטת של טכניקה בבהירות9 בשילוב עם מקדם שבירה התאמת פתרון (חישוקים). לכן, מערכת זו מאפשרת ההדמיה של מדגם זה גדול מ- 10 x 10 x 10 מ מ3 תוך שמירה על רזולוציה באיכות טובה צירית, לרוחב מטוסים8.
מערכת זו היה מכויל תחילה באמצעות חרוזים פלורסנט מסודרים תצורות שונות בתוך הצנרת זכוכית. לאחר מכן, המערכת שימשה תמונה אחרי לידה ומבוגרים מאתר לבבות. ראשית, בלב העכבר אחרי לידה צולמה ב 7 ימים (P7) כדי לחשוף את חלל חדרית, את עוביו של הקיר חדרית המבנים שסתום, הנוכחות של trabeculation. שנית, נערך מחקר כדי לזהות תאים להתמיין cardiomyocytes באמצעות העכבר אחרי לידה לב ב- 1 יום (P1) עם התווית על-ידי Cre cardiomyocytes, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). לבסוף, עכברים בוגרים בגיל 7.5 חודשים היו עם תמונה כדי לבחון את נוכחותם של כליות אשלגן מדולרי החיצוני ערוצים (ROMK) לאחר טיפול גנטי8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב עבור ייבוא תמונות מהירה עם רזולוציה צירית גבוהה מ מיקרומטר לקנה המידה מילימטר. טכניקות אור גיליונות מסורתיות לערב את השימוש קרן תאורה יחיד orthogonally מכוונת דגימת רקמה. תמונות של דוגמאות גדולות המיוצרים באמצעות קרן תאורה יחיד מכילות פסים או חפצים, סובלים ברזולוציה מופחתת עקב פיזור קליטת האור על ידי הרקמה. מחקר זה משתמש קרן תאורה דו-צדדית, צלילות מפושטת אופטי פינוי טכניקה ללב מאתר. שיטות אלה מאפשר הדמיה עמוק יותר על-ידי הסרת שומנים מהלב ומפיקים תחום רחב של הדמיה, גדול מ- 10 x 10 x 10 מ מ3. כתוצאה מכך, אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לכמת את הממדים חדרית, לעקוב אחר שושלת היוחסין לב לשפה את התפוצה המרחבית של חלבונים ספציפיים הלב ושל יון-ערוצים מכל אחרי לידה כדי העכבר למבוגרים לבבות עם חדות מספקת ו רזולוציה.

בטכניקה המתוארת כאן להשתמש קרן דו-צדדית תאורה בשילוב של ניקוי אופטי של דגימות רקמות הלב העכבר כדי להשיג עמוק יותר לעומק הדמיה הדימות נפח גדול יותר עם רזולוציה מספקת הדמיה (איור 1). כדי לכייל את המערכת, חרוזים פלורסנט הונחו בתוך הצנרת זכוכית ובתוך מערכת הדמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה מהירה של לב העכבר. וזה יכול לשמש כדי לבחון את נוכחותם של ערוצי אוויר לאחר ריפוי גנטי. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך קרדיולוגיה פיתוח, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון נוירולוגיה ופולמונולוגיה.בדרך כלל, אנשים יתקשו עם טכניקה זו כי הרכבה הדמיה של לב העכבר הבוגר יכול להיות קשה, וזה שונה טכניקות אחרות, מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקל הפוכה. מניחים לייזר גל מתמשך עם שלושה אורכי גל של 405 ננומטר, 473 ננומטר, ו 532 ננומטר. לאחר מכן, להדביק לשקף אחד וליישר אותו עם מישור המראה ב 45 מעלות לקורה.פעולה זו תכוון את הלייזר לכיוון מפצל הקרן, המהווה את מערך התאורה הדו-צדדי. לאחר מכן, העבירו את הקרן דרך מסנן צפיפות נייטרלי בקוטר 50 מ"מ, מרחיב קרן וחור סיכה בקוטר 25 מ"מ, כולם ממוקמים במרחק של 150 מילימטרים זה מזה. מעבירים את הקורה דרך מפצל קרן 50-50, ממוקם 150 מילימטרים מהחור.לאחר מכן, מניחים את המראה שני 150 מילימטרים ממפצל הקרן, ב 90 מעלות לקרן הקדמית, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן. לאחר מכן, מניחים את המראה שלושה 100 מילימטרים ממראה 2, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן משתקף ממראה 2. השתמש בקרן משתקפת זו כדי ליצור צד אחד של יריעת אור התאורה הכפולה.בצד הרחוק של מפצל הקרן, מניחים את המראה חמש כך שמישור המראה שלה הוא ב-45 מעלות לקרן הנפלטת בכיוון קדימה. השתמש בקרן הנפלטת מהמראה חמש כדי ליצור את הצד השני של יריעת אור התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את מערכת התאורה הדו-צדדית בצורה מערכתית.מניחים עדשה גלילית שני 150 מילימטרים מן המראה שלוש, ועוד עדשה גלילית זהה 150 מילימטרים מן המראה חמש, בצד השני של הגדרת תאורה כפולה. לאחר מכן, מניחים שתי מראות, כל אחת בתור עם העדשות הגליליות, במרחקים של 50 מילימטרים כדי לשקף את הקרן ב -90 מעלות. משני צידי יריעת האור, יוצרים כפיל אכרומטי מזוג עדשות, כאשר העדשה הראשונה ממוקמת 100 מילימטרים מהמראה הקודמת, וקוטר של סנטימטר אחד ואורך מוקד של 100 מילימטרים.העדשה השנייה צריכה להיות ממוקמת 160 מילימטרים מהעדשה אחת, עם קוטר של סנטימטר אחד, ואורך מוקד של 60 מילימטרים. לאחר מכן, מניחים את מטרות התאורה 1 ו -2 150 מילימטרים מן הכפלות האכרומטיות הקודמות, כך שהם בקו אחד עם הקרן. הקרן הנפלטת מהמטרות יוצרת את יריעת האור להדמיית הדגימות.ראשית, הכינו את דגימת חרוז הפלואורסצנט על ידי דילול תמיסת חרוזים 0.53 מיקרומטר, אחת עד 150,000, בתמיסת התאמת מדד שבירה מחוממת מראש, עם נקודת התכה נמוכה באחוז אחד. לאחר מכן, השתמש חתיכת צינורות זכוכית borosilicate עם קוטר פנימי של 12 מילימטרים, וקוטר חיצוני של 18 מילימטרים, לאורך של 30 מילימטרים. פיפטה תותבת חרוז agarose בצנרת borosilicate ולאפשר אגרוז להתגבש בטמפרטורת החדר.עכשיו, למלא תא ABS מודפס 3-D עם פתרון 99.5 אחוז gylcerol. מניחים את צינורות הזכוכית borosilicate, המכיל את חרוזים, בתוך התא. צרף שלב תרגום ממונע תלת-מיתוני לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ה- ABS.לאחר מכן, השתמש בתוכנה מעוצבת מותאמת אישית כדי להשיג תמונות באמצעות מצלמת sCMOS, בקצב של 30 מסגרות לשנייה. באמצעות בקר המנוע, הזז את הדגימה מילימטר אחד בכיוון הרוחד ורכוש תמונות בכל תוספת של מילימטר אחד, עד להדמיית המדגם כולו. ערמו את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי, ולמדוד את פונקציית התפשטות הנקודות של המערכת באמצעות תמונות חרוזים אלה.השתמש בפתרון התאמת אינדקס שבירה, עם pH של 7.5, ולהמיס אחוז אחד התעורר לתוך הפתרון התואם. מניחים דגימת לב עכבר בוגרת מנוקה לתוך פתרון התאמת אינדקס שבירה, עם אחוז אחד אגרוז מומס. לאחר מכן, להכניס את המדגם לתוך צינורות זכוכית borosilicate, ולאפשר agarose להתגבש בטמפרטורת החדר.צרף שלב תרגום ממונע תלת-ממד לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ABS מודפס תלת-ממד. מקם את הדגימה כך שהיא נמצאת במרכז הקרן הגאוסית, שנוצרה על ידי מערכת התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את קצב הרכישה של מצלמת sCMOS ל- 30 מסגרות לשנייה.עכשיו, באמצעות בקר המנוע, להזיז את המדגם מילימטר אחד בכיוון בית הספר ולרכוש תמונות בכל תוספת מילימטר אחד. המשך עד להדמיית הדגימה כולה. אחסן את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי.פתח את התמונות תלת-מיות באמצעות ערימות תמונות אלה. כדי לבצע זאת, הפוך את פונקציית כפולת הנקודות שנקבעה קודם לכן, ונצל אותה עבור ערימות התמונות שנרכשו. לבסוף, קבעו ערך עוצמת סף של פיקסלים לצפייה בקווי המתאר של הלב, והוסיפו צבע מדומה לתמונות, בהתאם לעוצמה זו של גווני אפור.ביום אחד לאחר הלידה, אפשר לדמיין את השסתומים, אטריום, חדר, שריר pectinate, ו trabeculation, בין תכונות אחרות. ביום השביעי לאחר הלידה, התכונות מוגדרות עוד יותר. אטריום, חדר, ממדי חלל חדרית, ועובי קיר החדר ניכרים כולם.כדי לחקור התברמות קרדיומיוציטים בתוך הלב, עכברים הטרוזיגיים היו קרויים כדי להראות קרדיומיוציטים. התאים המסווים מוצגים כאן, בכל כיוון מישור. שלושת המטוסים מוזגו, כדי ליצור עיבוד תלת מימדי של הלב.האזור האדום בעיגול בתוך הכניסה מראה שני לבבות עכבר שקופים לאחר שעברו את טכניקת הבהירות והוחדרו לתוך צינורות הזכוכית הבורוסיליקטים. בנוסף ללימוד עכברים לאחר לידה, מערכת ההדמיה יכולה לשמש גם לחקר לב העכבר הבוגר. כאן, GFP מתויג ערוצי ROMK מוצגים ב 7.5 חודשים.אלה נמצאו בעיקר בקיר החדר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שתי דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להסיר את כל הבועות סביב המדגם בצינור.שיטות אחרות, כגון פילוח אוטומטי של ערימות התמונה, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לפגיעה לב וכלי דם והתחדשות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו שימשה את החוקרים לחקר ארכיטקטורת הלב בשלבים התפתחותיים לאחר לידה ומבוגרים בעכברים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

דוגמנות מטופל ספציפי של לב: אומדן של אורינטציות סיבי חדרית

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

אפיוני מכני biaxial של מסתמי הלב Atrioventricular

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

השתלה של תיקון ביו-מודפס בתלת מיתד במודל מורין של אוטם שריר הלב

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...