Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA per fornire il campione di topi all'immagine. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (per Tzung K. Hsiai), HL083015 (per Tzung K. Hsiai), HD069305 (per N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (per Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (per Tzung K. Hsiai) e University of Texas System Star finanziamenti (per match Lee).

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state approvate da comitati di revisione istituzionale (IACUC) presso la University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Nota: Vedere Figura 1 e Figura 2.
<ol><li>Recuperare un laser ad onda continua (CW) con 3 lunghezze d'onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Posto 2 specchi (M1 e M2) distanza di 150 mm e allinearli con i loro aer...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni1,3. Le travi-retro forniscono un'illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l'effetto di str...

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l'espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell'aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite4. Tuttavia, dovuto l'assorbimento e la dispersione dei fotoni, LSFM è stato limitato ai campioni che sono entrambi a pochi micron di spessore o sono otticamente trasparente1.
Le limitazioni di LSFM hanno portato a studi approfonditi di organismi che hanno i tessuti che sono otticamente trasparenti, come il pesce zebra. Studi condotti su differenziazione e sviluppo cardiaco sono spesso condotte su zebrafish poiché ci sono geni conservati tra esseri umani e zebrafish5,6. Anche se questi studi hanno portato a progressi nella ricerca cardiaca legate a cardiomiopatie6,7, c'è ancora la necessità di condurre una simile ricerca sugli organismi di livello superiore come i mammiferi.
Mammiferi del tessuto cardiaco presenta una sfida a causa dello spessore e l'opacità del tessuto, l'assorbimento a causa dell'emoglobina nei globuli rossi e lo striping che si verifica a causa di illuminazione unilaterale del campione sotto tradizionale LSFM metodi1 , 8. per compensare queste limitazioni, abbiamo proposto di utilizzare-retro illuminazione e una versione semplificata della chiarezza tecnica9 combinati con un indice di rifrazione corrispondente soluzione (cerchi). Di conseguenza, questo sistema permette l'imaging di un campione che è maggiore di 10 x 10 x 10 mm3 mentre mantenendo una buona qualità risoluzione assiale e laterale piani8.
Questo sistema è stato calibrato prima utilizzando perline fluorescenti disposti in diverse configurazioni all'interno della tubazione di vetro. Quindi, il sistema è stato usato all'immagine cuori murini postnatali e adulti. In primo luogo, il cuore del topo postnatale era imaged in 7 giorni (P7) per rivelare la cavità ventricolare, lo spessore della parete ventricolare, le strutture di valvola e la presenza di trabeculation. In secondo luogo, è stato condotto uno studio per identificare le celle che vuoi differenziare in cardiomiociti utilizzando un cuore del topo postnatale al giorno 1 (P1) con Cre-labeled cardiomiociti e la proteina fluorescente gialla (YFP). Infine, topi adulti a 7,5 mesi erano imaged per osservare la presenza di potassio midollare esterna renale canali (ROMK) dopo la terapia di gene8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l'acquisizione rapida immagine con un'alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l'uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell'esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm3. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.

La tecnica descritta qui usato un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica dei campioni di tessuto del cuore del mouse per ottenere una maggiore profondità di imaging e un più grande volume di imaging con sufficiente formazione immagine ad alta risoluzione (Figura 1). Per calibrare il sistema, perline fluorescenti sono stati collocati all'interno dei tubi di vetro e all'interno del sistema di imaging. Le perle sono stati p...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Il vantaggio principale di questa tecnologia è che consente una rapida imaging del cuore del mouse. E può essere usato per osservare la presenza di canali d'aria dopo la terapia genica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla cardiologia dello sviluppo, può anche essere applicato ad altri sistemi, come la neurologia e la pneumologia.Generalmente, gli individui avranno difficoltà con questa tecnica perché montare un'immagine del cuore del topo adulto può essere difficile, ed è diverso da altre tecniche tradizionali, come la microscopia confocale e invertita. Posizionare un laser ad onda continua con tre lunghezze d'onda di 405 nanometri, 473 nanometri e 532 nanometri. Quindi, apporre uno specchio e allinearlo con il piano dello specchio a 45 gradi al fascio.Questo dirigerà il laser verso lo splitter del fascio, che forma la configurazione dell'illuminazione a due lati. Quindi, passare il fascio attraverso un filtro di densità neutra di 50 millimetri di diametro, un espansore di travi e un foro perno di 25 millimetri di diametro, tutti posizionati a 150 millimetri l'uno dall'altro. Passare la trave attraverso uno splitter a fascio 50-50, posizionato a 150 millimetri dal foro stenopeico.Quindi, posizionare lo specchio a due 150 millimetri dallo splitter del fascio, a 90 gradi al fascio in avanti, e allinearlo in modo che il suo piano specchio sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio. Quindi, posizionare lo specchio a tre 100 millimetri dallo specchio due, e allinearlo in modo che il suo piano speculare sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio riflesso dallo specchio due. Utilizzare questo fascio riflesso per formare un lato della scheda luminosa a doppia illuminazione.Sul lato opposto dello splitter del fascio, posizionare lo specchio cinque in modo che il suo piano speculare sia a 45 gradi dal fascio emesso in avanti. Utilizzare il fascio emesso dallo specchio cinque per formare il secondo lato della doppia scheda luminosa di illuminazione. Successivamente, impostare il sistema di illuminazione a doppia aspetto in modo sistemico.Posizionare l'obiettivo cilindrico a due 150 millimetri di distanza dallo specchio tre e un'altra lente cilindrica identica a 150 millimetri di distanza dallo specchio cinque, dall'altra parte della configurazione a doppia illuminazione. Quindi, posizionare due specchi, ciascuno in linea con le lenti cilindriche, a distanze di 50 millimetri per riflettere il fascio a 90 gradi. Su entrambi i lati del foglio luminoso, formare un farsettino acromatico da un paio di lenti, con la prima lente posizionata a 100 millimetri dallo specchio precedente e con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 100 millimetri.La seconda lente deve essere posizionata a 160 millimetri dall'obiettivo uno, con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 60 millimetri. Quindi, posizionare gli obiettivi di illuminazione uno e due 150 millimetri dai precedenti doppietti acromatici, in modo che siano in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma la scheda luminosa per l'imaging dei campioni.In primo luogo, preparare il campione di perline fluorescenti diluendo una soluzione di perline da 0,53 micrometri, da uno a 150.000, in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione pre-riscaldata, con un'agarose di puntamento a bassa fusione dell'uno per cento. Successivamente, utilizzare un pezzo di tubi di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 millimetri e un diametro esterno di 18 millimetri, per una lunghezza di 30 millimetri. Pipettare la soluzione di agarosio di perline nei tubi borosilicati e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.Ora, riempire una camera abs stampata in 3D con una soluzione di gylcerolo al 99,5%. Posizionare i tubi di vetro borosilicate, contenenti le perline, all'interno della camera. Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D ai tubi di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS.Quindi, utilizza un software progettato su misura per acquisire immagini utilizzando la fotocamera sCMOS, a una velocità di 30 fotogrammi al secondo. Utilizzando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione laterale e acquisire immagini con ogni incremento di un millimetro, fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione e misurare la funzione di diffusione del punto del sistema utilizzando queste immagini di perline.Utilizzare una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con un pH di 7,5, e sciogliere l'uno per cento di agarosio nella soluzione corrispondente. Posizionare un campione di cuore di topo adulto cancellato nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con l'uno per cento di agarosio sciolto. Quindi, inserire il campione in tubi di vetro borosilicato e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno di una camera ABS stampata in 3D. Posizionare il campione in modo che si trova al centro del fascio gaussiano, creato dal sistema di doppia illuminazione. Quindi, impostare la velocità di acquisizione della fotocamera sCMOS su 30 fotogrammi al secondo.Ora, usando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione assiale e acquisire immagini ad ogni incremento di un millimetro. Continuare fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione.Sviluppa le immagini 3D usando questi stack di immagini. A tale scopo, deconvolgere la funzione di diffusione del punto determinata in precedenza e utilizzarla per gli stack di immagini acquisiti. Infine, impostate un valore di intensità della soglia di pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungete pseudocolore alle immagini, in base a questa intensità in scala di grigi.Al primo giorno post-natale, si possono visualizzare le valvole, l'atrio, il ventricolo, il muscolo pectinato e la trabeculazione, tra le altre caratteristiche. Al settimo giorno post-natale, le caratteristiche sono ancora più definite. L'atrio, il ventricolo, le dimensioni della cavità ventricolare e lo spessore della parete ventricolare sono tutti evidenti.Per studiare la differenziazione dei cardiomiociti all'interno del cuore, i topi knock-in eterozigoti sono stati etichettati per mostrare cardiomiociti. Le celle etichettate sono mostrate qui, in ogni direzione del piano. I tre piani furono uniti, per creare un rendering 3D del cuore.La regione cerchiata rossa all'interno dell'inserto mostra due cuori di topo traslucidi dopo aver subito la tecnica della chiarezza e essere stati inseriti nei tubi di vetro borosilicati. Oltre a studiare i topi post-natali, il sistema di imaging può anche essere utilizzato per studiare il cuore adulto del topo. Qui, i canali ROMK taggati GFP sono mostrati a 7,5 mesi.Questi sono stati trovati principalmente nella parete ventricolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due minuti. Quando si tenta questa procedura, è importante rimuovere tutte le bolle intorno al campione nel tubo.Altri metodi, come l'auto-segmentazione degli stack di immagini, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive relative alle lesioni cardiovascolari e alla rigenerazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per studiare l'architettura cardiaca nelle fasi di sviluppo post-natale e adulto nei topi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ricerca

Bioingegneria

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Paziente-specifica modellazione del Cuore: Stima di orientamento delle fibre ventricolari

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Caratterizzazioni biassiale meccaniche delle valvole atrioventricolari cuore

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Trapianto di una patch biostampa 3D in un modello Murine di infarto miocardico

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...