Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

저자는 마우스 샘플 이미지를 제공 하기 위한 UCLA에서 타오 구 엔과 아츠 시 나카노에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH (Tzung K. Hsiai)에 HL118650, HL083015 (Tzung K. Hsiai)를, (N. C. 치 및 Tzung K. Hsiai)에 HD069305, HL111437 (Tzung K. Hsiai N. C. 치)를, (에 Tzung K. Hsiai), HL129727 및 텍사스 대학교 시스템 교부 받음 (지주에 자금에 의해 지원 되었다 리)입니다.

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아에서 기관 검토 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 영상 시스템 설치
주: 그림 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
<ol><li>3 파장 연속파 (CW) 레이저 검색: 405 nm, 473 nm와 532 nm. 장소 2 거울 (M1 및 M2) 150 mm 떨어져와 45 ° 광속에 그들...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM 시스템 및 여기에 설명 된 기술 개발의 출생 및 성인 단계에서 이미지 마우스 마음에 광 청소와 함께 양면 조명 광속을 이용 한다. 전통적인 단일 조명 광선은 광자 산란 및 흡수 두꺼운 및 더 큰 조직 샘플1,3에서 겪고 있다. 양면 보 샘플, 스트라이핑 및 종종 한 면 조명에 의해 생산 하는 이미지에 표시 되는 다른 아티팩트 효과 최소화의 더 심지어 ?...

빛-시트 형광 현미경 검사 법 1903 년에 처음 개발 하는 기술 이었고, 유전자 발현을 연구 하 고 조직 샘플1,2,3또는 4 차원 3 차원 모델을 생성 하는 방법으로 오늘 사용 된다. 이 이미징 방법만 그 비행기는 검출기에 의해 캡처 있도록 샘플의 단일 면을 밝히는 빛의 얇은 시트를 사용 합니다. 샘플 다음 이동할 수 있습니다 축 방향으로 각각 캡처 레이어, 한 번에 하나의 섹션 및 인수 이미지4의 후 처리 후 3 차원 모델을 렌더링. 그러나, 흡수 및 산란 광자의 LSFM 되었습니다 샘플 중 몇 미크론 두께 또는 광학 투명1을 제한.
LSFM의 한계는 제 브라 같은 광학 투명 한 조직 있는 생물의 광범위 한 연구를이 끌고있다. 심장 개발 및 차별화는 종종 연구 zebrafish에 있기 때문에 인간과 zebrafish5,6보존된 유전자. 이러한 연구는 cardiomyopathies6,7에 관련 된 심장 연구에 발전을 이끈, 비록 여전히 포유류와 같은 수준의 유기 체에 유사한 연구 수행 필요가 하다.
포유류 심장 조직의 두께와 불투명도 조직, 전통적인 LSFM 방법1 아래 샘플의 단면 조명으로 인해 발생 하는 스트라이핑에 붉은 혈액 세포, 헤모글로빈 때문 흡수의 과제를 안으십시오 , 8. 이러한 제한에 대 한 보상, 우리 양면 조명과 선명도 기법9 일치 하는 솔루션 (RIMS) 굴절 인덱스와 결합의 단순화 된 버전을 사용 하 여 제안. 따라서,이 시스템은8비행기 축과 측면에서 좋은 품질의 해상도 유지 하면서 10 m m3 x 10 x 10 보다 크면 시료의 이미징에 대 한 수 있습니다.
이 시스템은 먼저 유리 튜브 내에서 다른 구성에서 배열 하는 형광 구슬을 사용 하 여 보정 됩니다. 그런 다음, 시스템 출생 및 성인 murine 마음을 이미지를 사용 되었다. 첫째, 출생 후 마우스 마음은 7 일 (P7) 심 실 구멍, 심 실 벽, 밸브 구조 및 trabeculation의 존재의 두께 공개에 몇 군데. 둘째, 연구 cardiomyocytes Cre 표시와 노란 형광 성 단백질 (YFP) 1 일 (P1)에서 출생 마우스 마음을 사용 하 여 cardiomyocytes에 분화 것 셀을 식별 하기 위해 실시 됐다. 마지막으로, 7.5 개월에서 성인 쥐 유전자 치료8후 신장 외부 골 수 칼륨의 존재 (ROMK) 채널을 관찰 하는 몇 군데 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

빛 시트 형광 현미경 검사 법은 축 고해상도 마이크로미터에서 밀리미터 규모와 빠른 이미지 수집을 위해 널리 사용 되었습니다. 전통적인 빛 시트 기술 샘플 조직에서 기가 감독 단일 조명 광속의 사용을 포함 한다. 단일 조명 광선을 사용 하 여 생성 되는 큰 샘플의 이미지 줄무늬 또는 아티팩트를 포함 하 고는 조직에 의해 빛의 흡수와 산란 감소 해상도에서 고통. 이 연구 양면 조명 광속 및 단순화 된 선명도 광학 기술 murine 마음에 대 한 삭제를 사용 합니다. 이러한 기술은 마음에서 지질을 제거 하 여 깊은 이미징에 대 한 허용 하 고 영상, 10 x 10 x 10 m m3보다 더 큰 분야를 생산. 결과적으로,이 전략을 수 있습니다 계량 실의 크기, 심장 계보를 추적 하 고 심장 특정 단백질 및 충분 한 대비와 성인 쥐 심 혼에는 출생에서 이온 채널의 공간 분포를 지역화 하 고 해상도입니다.

설명 하는 기술은 여기 깊은 이미징 깊이 및 충분 한 이미지 해상도 (그림 1) 더 큰 이미징 볼륨 마우스 심장 조직 샘플의 광학 청소와 함께 양면 조명 광선을 사용. 시스템 보정, 형광 구슬 유리 튜브 내부와 이미징 시스템 내에서 배치 했다. 구슬에 몇 군데 했다 그리고 x y 평면, y z 평면, 시각 그리고 포인트를 x-z 평면에서 시스템8기...

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Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

이 기술의 주요 장점은 마우스 심장 중 하나의 빠른 이미징을 허용한다는 것입니다. 그리고 유전자 치료 후 공기 채널의 존재를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 발달 심장학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 신경학 및 폐학과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로, 개별은 성인 마우스 심혼의 화상 진찰을 장착하는 것은 어려울 수 있고, 공초점 및 반전된 현미경 검사법과 같은 그밖, 전통적인 기술에서 다르기 때문에 이 기술로 투쟁할 것입니다. 405 나노미터, 473 나노미터 및 532 나노미터의 3 개의 파장을 가진 연속 파레이저를 배치합니다. 그런 다음 미러를 부착하고 45도에서 거울 평면과 빔에 정렬합니다.이렇게 하면 레이저가 빔 스플리터쪽으로 향하게 되며, 이는 양면 조명 설정을 형성합니다. 다음으로, 50mm 직경의 중성 밀도 필터, 빔 익스팬더 및 25mm 직경핀 구멍을 통해 빔을 전달하며, 모두 서로 150mm 떨어진 곳에 배치됩니다. 핀홀에서 150밀리미터 떨어진 50-50 빔 스플리터를 통과합니다.다음으로 빔 스플리터에서 150mm 떨어진 미러 2개를 90도에서 전방 빔으로 배치하고 미러 평면이 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 그런 다음 미러 2에서 미러 3 개를 100밀리미터 3개 배치하고 미러 평면이 미러 2에서 반사되는 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 이 반사 빔을 사용하여 이중 조명 라이트 시트의 한쪽을 형성합니다.빔 스플리터의 맨 쪽에 미러 5를 배치하여 미러 평면이 전방 방향으로 방출되는 빔에 45도 떨어져 있습니다. 미러 5에서 방출되는 빔을 사용하여 이중 조명 광시트의 두 번째 면을 형성합니다. 다음으로, 체계적인 방식으로 이중 측 조명 시스템을 설정합니다.원통형 렌즈2대150밀리미터 에서 미러 3, 또 다른 동일한 원통형 렌즈를 거울 5에서 150밀리미터 떨어진 곳에 두면 이중 조명 설정의 반대편에 놓습니다. 다음으로, 각각 원통형 렌즈에 맞춰 각각 2개의 거울을 50mm 의 거리에 배치하여 빔을 90도반사합니다. 라이트 시트의 양쪽에, 렌즈 의 쌍에서 achromatic 더블을 형성, 첫 번째 렌즈는 이전 거울에서 100 밀리미터 배치되고, 1 인치 직경과 100 밀리미터의 초점 길이를 갖는.두 번째 렌즈는 렌즈 1개에서 160mm, 직경은 1인치, 초점 거리는 60mm로 배치되어야 합니다. 그런 다음, 조명 목표를 이전 achromatic doublets에서 150밀리미터, 그래서 빔과 일치되도록 배치합니다. 목표에서 방출되는 빔은 샘플을 이미징하기 위한 광시트를 형성합니다.먼저, 0.53 마이크로미터 비드 용액을 1~150, 000으로 미리 데워진 굴절률 매칭 솔루션에 희석하여 형광 비드 샘플을 준비하고, 1% 낮은 용융을 가리키는 아가로즈를 사용한다. 다음으로, 12밀리미터의 내지름과 외경 18mm의 보로실리케이트 유리 튜브를 길이 30mm로 사용합니다. 보로실리케이트 튜브의 비드 아가로즈 용액파이펫을 피펫하여 실온에서 아가로즈가 고화되도록 합니다.지금, 99.5 % gylcerol 솔루션으로 3 D 인쇄 ABS 챔버를 채우기. 구슬이 들어 있는 보로실리케이트 유리 튜브를 챔버 내부에 놓습니다. ABS 챔버 내의 시료의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 borosilicate 유리 튜브에 부착합니다.그런 다음 사용자 지정 설계 소프트웨어를 사용하여 초당 30 프레임의 속도로 sCMOS 카메라를 사용하여 이미지를 수집합니다. 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 측면 방향으로 1밀리미터 이동하고 전체 샘플이 이미지화될 때까지 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택하고 이러한 비드 이미지를 사용하여 시스템의 포인트 확산 기능을 측정합니다.7.5의 pH와 굴절 인덱스 일치 솔루션을 사용하고 1%의 아가로즈를 일치 솔루션에 용해합니다. 클리어된 성인 마우스 심장 샘플을 굴절지수 매칭 솔루션에 넣고 1%의 아가로즈가 용해됩니다. 그런 다음, 샘플을 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입하고, 아가로즈가 실온에서 고화되도록 한다.3D 프린팅 ABS 챔버 내에서 샘플의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 보로실리케이트 유리 튜브에 부착합니다. 이중 조명 시스템에 의해 생성된 가우시안 빔의 중심에 있도록 샘플을 배치합니다. 그런 다음 sCMOS 카메라의 획득 속도를 초당 30프레임으로 설정합니다.이제 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 축 방향으로 1밀리미터 이동하고 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 전체 샘플이 이미지화될 때까지 계속합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택합니다.이러한 이미지 스택을 사용하여 3D 이미지를 개발합니다. 이를 위해 이전에 결정된 포인트 스프레드 함수를 데온볼브하고 획득한 이미지 스택에 활용합니다. 마지막으로 픽셀 임계값 을 설정하여 심장의 윤곽을 관찰하고 이 회색 배율 강도를 기반으로 이미지에 의사 색상을 추가합니다.어느 날 산후, 하나는 밸브, 아트리움, 심실, 페티나테 근육 및 궤적을 시각화 할 수 있습니다. 산후 7일째에 그 특징은 더욱 정의됩니다. 심실, 심실 구멍 치수 및 심실 벽 두께는 모두 분명합니다.심장 내의 심근세포 분화를 연구하기 위해 이종구스 노크인 마우스는 심근세포를 보여주기 위해 크레라벨을 부착했습니다. 표지된 셀은 각 평면 방향으로 여기에 표시됩니다. 세 개의 평면이 병합되어 심장의 3D 렌더링을 만들었습니다.인셋 내의 빨간색 원영역은 선명도 기술을 받고 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입된 후 두 개의 반투명 마우스 하트를 보여줍니다. 산후 마우스를 공부하는 것 외에도, 이미징 시스템은 성인 마우스 심장을 연구하는 데사용할 수도 있습니다. 여기서, GFP 태그 ROMK 채널은 7.5 개월에 표시됩니다.이들은 주로 심실 벽에서 찾아냈습니다. 이 기술을 마스터하면 1~2분 후에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 튜브의 샘플 주위의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다.이미지 스택의 자동 세분화와 같은 다른 방법은 심혈관 손상 및 재생과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 마우스에 있는 산후 및 성인 발달 단계에 있는 심장 건축을 공부하기 위하여 연구원에 의해 이용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

심장의 환자 별 모델링 : 심실 섬유 오리엔테이션의 추정

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial 기계 Characterizations 것 심장 밸브의

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...