Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Thao Nguyen og Atsushi Nakano fra UCLA for å gi mus prøven bildet. Denne studien ble støttet av tilskudd NIH HL118650 (til Tzung K. Hsiai), HL083015 (til Tzung K. Hsiai), HD069305 (til N. C. Chi og Tzung K. Hsiai.), HL111437 (til Tzung K. Hsiai og N. C. Chi), HL129727 (til Tzung K. Hsiai) og University of Texas stjerner midler (til Juhyun Lee).

Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr har blitt godkjent av institusjonelle gjennomgang komiteer (IACUC) ved University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Merk: Se figur 1 og figur 2.
<ol><li>Hente med 3 bølgelengder kontinuerlige bølgen (CW) laser: 405 nm, 473 nm og 532 nm. Sted 2 speil (M1 og M2) 150 mm fra hverandre og justere dem med flyene sine speil på 45° av st...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM systemet og teknikken beskrevet her benytter en tosidig belysning bjelke kombinert med en optisk avregning bildet musen hjertet på postnatal og voksen stadier av sin utvikling. En tradisjonell enkelt belysning bjelke lider Foton spredning og absorpsjon gjennom tykkere og større vev prøver1,3. Tosidig bjelker gir en jevnere belysning av prøven, og dermed minimere effekten av striping og andre gjenstander som er ofte sett i bilder produsert av en ensidig b...

Lys arks fluorescens mikroskopi var en teknikk utviklet i 1903, og brukes i dag som å studere genuttrykk og også å produsere 3D eller 4 D modeller vev prøver1,2,3. Denne tenkelig metoden bruker et tynt ark av lys til å lyse opp et enkelt fly av en prøve slik at bare det flyet er fanget av detektoren. Prøven kan deretter flyttes i aksial-retning å fange hvert lag, ett avsnitt om gangen, og gjengi en 3D modell etter post-prosessering av ervervet bilder4. Men absorpsjon og spredning av fotoner, har LSFM vært begrenset til prøvene som enten få mikrometer tykke eller optisk gjennomsiktig1.
Begrensningene for LSFM har ført til omfattende studier av organismer som har vev som er optisk gjennomsiktige, som sebrafisk. Studier med hjerte utvikling og differensiering er ofte utført på sebrafisk siden det er bevart gener mellom mennesker og sebrafisk5,6. Selv om disse studiene har ført til fremskritt i cardiac forskning knyttet til cardiomyopathies6,7, er det fortsatt behov for å utføre lignende forskning på høyere nivå organismer som pattedyr.
Pattedyr hjerte vev presenterer en utfordring på grunn av tykkelse og tetthet av vev, opptaket på grunn av hemoglobin i røde blod celler og striping som oppstår grunnet ensidig belysning av prøven under tradisjonelle LSFM metoder1 , 8. for å kompensere for disse begrensningene, vi foreslått å bruke tosidig belysning og en forenklet versjon av KLARHET teknikk9 kombinert med en brytningsindeks matchende løsning (FELGER). Derfor lar dette systemet for avbilding av et utvalg som er større enn 10 x 10 x 10 mm3 mens opprettholde en god oppløsning i aksial og lateral fly8.
Dette systemet ble først kalibrert med fluorescerende perler ordnet i forskjellige konfigurasjoner i glass slangen. Da ble systemet brukt å image postnatal og voksen murine hjerter. Først ble postnatal musen hjertet avbildet på 7 dager (P7) å avsløre ventrikkel hulrom, tykkelsen på ventrikkel veggen, ventil strukturer og tilstedeværelsen av trabeculation. For det andre, en studie ble utført for å identifisere celler som vil differensiere i cardiomyocytes ved å bruke et postnatal musen hjerte i 1 dag (P1) med grobunn-merket cardiomyocytes og gule fluorescerende protein (YFP). Til slutt, voksen mus på 7,5 måneder ble fotografert for å observere tilstedeværelsen av nyre ytre medullær kalium (ROMK)-kanaler etter gene terapi8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Lys arks fluorescens mikroskopi er mye brukt for rask bildeopptak med høy aksiell oppløsning fra mikrometer millimeter skala. Tradisjonelle lys arks teknikker innebærer bruk av en enkelt belysning bjelke ortogonalt rettet eksempel vev. Bilder av store prøver som er produsert ved hjelp av en enkelt belysning bjelke inneholder striper eller gjenstander og lider en redusert oppløsning spredning og absorpsjon av lys av vev. Denne studien bruker en tosidig belysning stråle og en forenklet KLARHET optisk fjerne teknikk for murine hjertet. Disse teknikkene tillater dypere bildebehandling ved å fjerne lipider fra hjertet og produsere et stort felt av bildebehandling, større enn 10 x 10 x 10 mm3. Som et resultat, denne strategien kan vi kvantifisere ventrikkel dimensjonene, spore cardiac slektslinje og lokalisere den romlige fordelingen av hjerte-spesifikke proteiner og ion-kanaler fra den postnatal til voksen mus hjerter med tilstrekkelig kontrast og oppløsning.

Teknikken er beskrevet brukt her en tosidig belysning bjelke kombinert med en optisk clearing av musen hjertet for å oppnå en dypere tenkelig dybde og en større tenkelig volum med tilstrekkelig tenkelig oppløsning (figur 1). Kalibrer systemet ble fluorescerende perler plassert i glass slangen og innen tenkelig system. Perler ble deretter fotografert og visualisert i x-y flyet, y-z-fly, og i x-z flyet, for å få poenget spre funksjon (PSF) for systemet<su...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Denne studien bruker en tosidig belysning lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM) teknikk kombinert med optisk avregning for å studere murine hjertet.

Lys arks fluorescens mikroskopi for studier av Murine hjertet

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Den største fordelen med denne teknologien er at den gir rask avbildning av enten musehjertet. Og det kan brukes til å observere tilstedeværelsen av luftkanaler etter genterapi. Selv om denne metoden kan gi innsikt i utvikling kardiologi, kan den også brukes på andre systemer, for eksempel nevrologi og lungeologi.Vanligvis vil enkeltpersoner slite med denne teknikken fordi montering av et bilde av det voksne musehjertet kan være vanskelig, og det er forskjellig fra andre tradisjonelle teknikker, for eksempel konfokal og omvendt mikroskopi. Plasser en kontinuerlig bølgelaser med tre bølgelengder på 405 nanometer, 473 nanometer og 532 nanometer. Deretter feste speile en og justere den med speilplanet på 45 grader til strålen.Dette vil lede laseren mot strålesplitteren, som danner det dobbeltsidige belysningsoppsettet. Deretter passerer strålen gjennom et 50 millimeter diameter nøytralt tetthetsfilter, en stråleutvider og et 25 millimeter diameter pin hull, alle plassert 150 millimeter fra hverandre. Pass strålen gjennom en 50-50 strålesplitter, plassert 150 millimeter fra pinhole.Deretter plasserer du speil to 150 millimeter fra strålesplitteren, ved 90 grader til fremre stråle, og justerer den slik at speilplanet er i en 45 graders vinkel til strålen. Deretter plasserer du speil tre 100 millimeter fra speil to, og justerer det slik at speilplanet er i en 45 graders vinkel til strålen reflektert fra speil to. Bruk denne reflekterte strålen til å danne den ene siden av det doble belysningslysarket.På den andre siden av strålesplitteren plasserer du speil fem slik at speilplanet er på 45 grader til strålen som slippes ut i en fremoverretning. Bruk strålen som sendes ut fra speil fem for å danne den andre siden av det doble belysningslysarket. Deretter setter du opp det dobbeltsidige belysningssystemet på systemisk måte.Plasser sylindrisk linse to 150 millimeter unna speil tre, og en annen identisk sylindrisk linse 150 millimeter unna speil fem, på den andre siden av det doble belysningsoppsettet. Deretter plasserer du to speil, hver i tråd med sylindriske linser, i avstander på 50 millimeter for å reflektere strålen ved 90 grader. På begge sider av lysarket danner du en achromatic doublet fra et par linser, med den første linsen plassert 100 millimeter fra forrige speil, og har en en tomme diameter og en brennvidde på 100 millimeter.Den andre linsen skal plasseres 160 millimeter fra linse en, med en diameter på en tomme, og en brennvidde på 60 millimeter. Deretter plasserer du belysningsmålene en og to 150 millimeter fra de tidligere achromatic doublets, slik at de er i tråd med strålen. Strålen som slippes ut fra målene danner lysarket for avbildning av prøvene.Først forberede fluorescerende perle prøve ved å fortynne en 0,53 mikrometer perle løsning, en til 150,000, i en forvarmet brytning indeks matchende løsning, med en prosent lav smelte peker agarose. Deretter bruker du et stykke borosilikatglassrør med en indre diameter på 12 millimeter, og en ytre diameter på 18 millimeter, til en lengde på 30 millimeter. Pipette perlen agarose løsning i borosilikat rør og la agarose å stivne ved romtemperatur.Fyll nå et 3D-trykt ABS-kammer med en 99,5 prosent gylcerolløsning. Plasser borosilikatglassslangen, som inneholder perlene, inne i kammeret. Fest en 3D motorisert translasjonell fase til borosilikatglassrørene for å kontrollere bevegelsen og orienteringen til prøven i ABS-kammeret.Deretter bruker du spesialdesignet programvare til å skaffe bilder ved hjelp av sCMOS-kameraet, med en hastighet på 30 bilder per sekund. Bruk motorkontrolleren til å flytte prøven én millimeter i sideretningen, og få bilder ved hver trinn på én millimeter, til hele prøven er avbildet. Stable de oppkjøpte bildene ved hjelp av en visualiseringsprogramvare, og mål poengspredningsfunksjonen til systemet ved hjelp av disse perlebildene.Bruk en brytningsindeks matchende løsning, med en pH på 7,5, og oppløs en prosent agarose i matchende løsning. Plasser en ryddet voksen mus hjerte prøve i brytningsindeks matchende løsning, med en prosent agarose oppløst. Deretter setter du prøven inn i borosilikatglassrør, og la agarose å stivne ved romtemperatur.Fest en 3D motorisert translasjonell fase til borosilikatglassrørene for å kontrollere bevegelsen og retningen på prøven i et 3D-trykt ABS-kammer. Plasser prøven slik at den er i midten av den gaussiske strålen, skapt av det doble belysningssystemet. Deretter setter du oppkjøpshastigheten til sCMOS-kameraet til 30 bilder per sekund.Nå, ved hjelp av motorkontrolleren, flytte prøven en millimeter i aksial retning og skaffe bilder på hver en millimeter økning. Fortsett til hele prøven er avbildet. Stable de kjøpte bildene ved hjelp av en visualiseringsprogramvare.Utvikle 3D-bildene ved hjelp av disse bildestakkene. For å oppnå dette, dekonvolve poengspredningsfunksjonen som er bestemt tidligere, og bruk den for de kjøpte bildestakkene. Til slutt angir du en pikselterskelintensitetsverdi for å observere hjertets konturer, og legger til pseudofarge til bildene, basert på denne gråskalaintensiteten.På dag én postnatal kan man visualisere ventilene, atrium, ventrikkel, brystmuskulatur og trabekulasjon, blant andre funksjoner. På dag sju postnatal er funksjonene enda mer definert. Atrium, ventrikkel, ventrikulær hulrom dimensjoner, og ventrikkel veggtykkelse er alle tydelig.For å studere kardiomyocytt differensiering i hjertet, ble heterozygous knock-in mus cre-merket for å vise kardiomyocytter. De merkede cellene vises her, i hver planretning. De tre flyene ble slått sammen, for å skape en 3D-gjengivelse av hjertet.Den røde sirkelen i innfelt viser to gjennomsiktige musehjerter etter å ha gjennomgått klarhetsteknikken og satt inn i borosilikatglassslangen. I tillegg til å studere postnatale mus, kan bildesystemet også brukes til å studere det voksne musehjertet. Her vises GFP-merkede ROMK-kanaler på 7,5 måneder.Disse ble hovedsakelig funnet i ventrikulær vegg. Når mestret, kan denne teknikken gjøres i ett til to minutter. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å fjerne alle boblene rundt prøven i røret.Andre metoder, for eksempel automatisk segmentering av bildestablene, kan utføres for å svare på flere spørsmål knyttet til kardiovaskulær skade og regenerering. Etter utviklingen ble denne teknikken brukt av forskere til å studere hjertearkitekturen i postnatale og voksne utviklingsstadier hos mus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Pasient-spesifikke Modeling of the Heart: Beregning av Ventrikulære Fiber Orientations

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedheft formasjon i celler ved hjelp av avansert spinner disken totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekanisk Characterizations av atrioventrikulær hjertet ventiler

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Transplantasjon av en 3D Bioprinted Patch i en Murine Modell av hjerteinfarkt

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...