Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить признательность Тхао Нгуен и Atsushi Nakano из Калифорнийского университета для предоставления мышей образца изображения. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (для Tzung K. Hsiai), HL083015 (для Tzung K. Hsiai), HD069305 (для N. C. Чи и Tzung к Hsiai.), HL111437 (для Tzung K. Hsiai и N. C. Чи), HL129727 (для Tzung K. Hsiai) и университета штата Техас системы звезды, финансирование (для Juhyun Ли).

Все процедуры, связанные с использованием животных были одобрены организационного обзора комитетов (IACUC) в университете Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния.
1. Визуализация системы установки
Примечание: См. рис. 1 и рис.
<ol><l...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM система и метод, описанный здесь использует двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием изображение сердца мыши на послеродовой и взрослых этапах ее развития. Традиционный одноместный освещения пучка страдает от фотон рассеяние и поглощение через ткань то...

Микроскопии флуоресцирования свет листа была впервые разработана в 1903 году техника и сегодня используется как метод для изучения экспрессии генов, а также производить 3-D или 4-D моделей тканей образцы1,2,3. Этот метод визуализации использует тонкий лист света для освещения в одной плоскости образца так, что только что самолет захвачен детектора. Образца, затем могут быть перемещены в осевом направлении-захватить каждый слой, один раздел в то время и визуализации трехмерной модели после пост-обработки изображений4. Однако из-за поглощения и рассеяния фотонов, LSFM была ограничена образцов, которые являются либо несколько микрон или оптически прозрачные1.
Ограничения LSFM привели к обширные исследования организмов, которые имеют тканей, которые оптически прозрачным, как у рыбок данио. Исследования с участием сердца развития и дифференциации часто проводятся на данио рерио, поскольку есть сохранены генов между людьми и данио рерио5,6. Хотя эти исследования привели к достижениям в кардиологических исследованиях, связанных с кардиомиопатии6,7, по-прежнему существует необходимость в проведении аналогичного исследования высокого уровня организмов, таких как млекопитающие.
У млекопитающих сердечной ткани представляет собой проблему, из-за толщины и непрозрачность ткани, поглощение за счет гемоглобина в красных кровяных клеток и чередование, которое происходит из-за одностороннего освещения образца под традиционные методы LSFM1 , 8. чтобы компенсировать эти ограничения, мы предложили использовать двусторонняя освещения и упрощенная версия ЯСНОСТИ техника9 , в сочетании с показателем преломления соответствующие решения (колеса). Таким образом эта система позволяет для визуализации образца, это больше, чем 10 x 10 x 10 мм3 при поддержании хорошего качества резолюции в осевом и боковых плоскостей8.
Эта система была впервые калибруется с помощью флуоресцентных бусы, организовал в различных конфигурациях в стеклянных трубок. Затем система использовалась для изображения послеродовой и взрослых мышиных сердца. Во-первых послеродовой мыши сердце было imaged на 7 дней (P7) выявить полости желудочков, толщина стены желудочков, клапан структур и наличие trabeculation. Во-вторых было проведено исследование для определения ячеек, которые будут дифференцироваться в кардиомиоцитов, используя послеродовой мыши сердца на 1 день (P1) с КРР меченых кардиомиоцитов и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Наконец взрослых мышей на 7,5 месяцев были образы наблюдать присутствие почечной наружной медуллярного калия (ROMK) каналы после генной терапии8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии широко использовался для приобретения быстрого изображения с высоким разрешением осевой от микрометра миллиметровой шкалой. Традиционные методы свет лист связаны с использованием единого освещения пучка ортогонально направлены на образец ткани. Изображения крупных выборок, которые производятся с использованием единого освещения пучка содержат полосы или артефактов и страдают от сокращения резолюции из-за рассеяния и поглощения света в ткани. Это исследование использует двусторонняя освещения пучка и упрощенная ЯСНОСТИ оптических очистка техника для мышиных сердца. Эти методы позволяют глубже изображений путем удаления липиды из сердца и производят большое поле изображений, больше, чем 10 x 10 x 10 мм3. В результате, эта стратегия позволяет нам определить размеры желудочков, отслеживать линии сердца и локализовать пространственное распределение сердца специфических белков и каналы иона от послеродовой для сердца взрослых мыши с достаточным контрастом и резолюции.

Метод, описанный здесь используется двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием образцов ткани сердца мыши для достижения глубокого изображений глубину и объем изображений с достаточной разрешающей (рис. 1). Для калибровки си?...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Это исследование использует технику микроскопии (LSFM) свет лист флуоресценции двусторонняя освещения в сочетании с оптическим выравниванием учиться мышиных сердца.

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Основным преимуществом этой технологии является то, что она позволяет быстрое изображение сердца мыши. И его можно использовать для наблюдения за наличием воздушных каналов после генной терапии. Хотя этот метод может дать представление о развитии кардиологии, он также может быть применен к другим системам, таким как неврология и пульмонология.Как правило, люди будут бороться с этой техникой, потому что монтаж изображения сердца взрослой мыши может быть трудно, и это отличается от других, традиционных методов, таких как конфокальные и перевернутые микроскопии. Поместите непрерывный волновой лазер с тремя длинами волн 405 нанометров, 473 нанометров и 532 нанометров. Затем прикрепите зеркало одно и выровняете его с зеркальной плоскости при 45 градусах к лучу.Это направит лазер к сплиттеру луча, который образует двустороннюю установку освещения. Затем пройдите луч через фильтр нейтральной плотности диаметром 50 миллиметров, расширительную балку и отверстие диаметром 25 миллиметров, расположенные на 150 миллиметров друг от друга. Перейдите луч через 50-50 пучка сплиттер, помещенный 150 миллиметров от пинхол.Затем поместите зеркало в два 150 миллиметров от сплиттера луча, на 90 градусов к перемотке вперед, и выровняете его так, чтобы его зеркальная плоскость была под углом 45 градусов к лучу. Затем поместите зеркало три 100 миллиметров от зеркала два, и выровнять его так, что это зеркало плоскости находится под углом 45 градусов к лучу отражается от зеркала два. Используйте этот отраженный луч, чтобы сформировать одну сторону двойного светового листа освещения.На обратной стороне пучка сплиттера, поместите зеркало пять так, что это зеркальная плоскость находится на 45 градусов к лучу, который излучается в направлении вперед. Используйте луч, испускаемый из зеркала пять, чтобы сформировать вторую сторону двойного светового листа освещения. Далее, настроить двустороннюю систему освещения в системной форме.Поместите цилиндрический объектив на 2 150 миллиметров от зеркала три, и еще один идентичный цилиндрический объектив 150 миллиметров от зеркала пять, на другой стороне двойной установки освещения. Затем поместите два зеркала, каждое в соответствии с цилиндрическими линзами, на расстоянии 50 миллиметров, чтобы отразить луч при 90 градусах. По обе стороны светового листа образуют ахроматический дублет из пары линз, при этом первый объектив помещается на 100 миллиметров от предыдущего зеркала и имеет диаметр одного дюйма и фокусную длину 100 миллиметров.Второй объектив должен быть помещен 160 миллиметров от объектива один, с диаметром одного дюйма, и фокусной длиной 60 миллиметров. Затем поместите цели освещения на один и два 150 миллиметров от предыдущих ахроматических дублетов, чтобы они были в соответствии с лучом. Луч, испускаемый в результате целей, образует световой лист для визуализации образцов.Во-первых, подготовить флуоресцентный образец шарика, разбавляя 0,53 микрометра шариковый раствор, от одного до 150000, в предварительно разогретом рефракционном растворе соответствия индекса, с одним процентом низкого расплава указывая агарозу. Затем используйте кусок борозиликатной стеклянной трубки с внутренним диаметром 12 миллиметров и внешним диаметром 18 миллиметров длиной 30 миллиметров. Pipette бисера агарозы раствор в борозиликатных труб и позволяют агарозы затвердеть при комнатной температуре.Теперь заполните 3-D печатной abs камеры с 99,5 процента gylcerol решение. Поместите боросиликатные стеклянные трубки, содержащие бисер, внутри камеры. Прикрепите 3-D моторизованный этап перевода к борозиликатной стеклянной трубе для контроля движения и ориентации образца в камере ABS.Затем используйте специально разработанное программное обеспечение для получения изображений с помощью камеры sCMOS со скоростью 30 кадров в секунду. Используя контроллер двигателя, перемести образец на один миллиметр в боковом направлении и приобретайте изображения с шагом в один миллиметр, пока весь образец не будет изображен. Стек приобретенных изображений с помощью программного обеспечения визуализации, и измерить функцию распространения точки системы с помощью этих изображений шарика.Используйте рефракционный индекс соответствия решение, с рН 7,5, и растворить один процент агарозы в соответствующий раствор. Поместите очищенную образец сердца взрослой мыши в рефракционный раствор соответствия индекса, с растворенным одним процентом агарозы. Затем вставьте образец в борозиликатные стеклянные трубки и дайте агарозе затвердеть при комнатной температуре.Прикрепите 3-D моторизованный этап перевода к борозиликатной стеклянной трубе, чтобы контролировать движение и ориентацию образца в 3-D печатной камере ABS. Распоимите образец так, чтобы он был в центре гауссийского луча, созданного двойной системой освещения. Затем установите скорость приобретения камеры sCMOS до 30 кадров в секунду.Теперь, используя контроллер двигателя, перемести образец на один миллиметр в направлении ося и получить изображения на каждом миллиметре шагом. Продолжайте до тех пор, пока весь образец не будет изображен. Стек приобретенных изображений с помощью программного обеспечения визуализации.Разработайте 3-D изображения с помощью этих стеков изображений. Для достижения этой цели деконвольировать функцию распространения тока, определяемую ранее, и использовать ее для приобретенных стеков изображений. Наконец, установите значение интенсивности порога пикселей, чтобы наблюдать контуры сердца, и добавьте псевдоцвет к изображениям, основываясь на этой интенсивности серого масштаба.В первый день послеродовой, можно визуализировать клапаны, атриум, желудочек, пектинат мышцы, и трабекуляции, среди других особенностей. В седьмой день послеродового, функции еще более определены. Атриум, желудочек, желудочковые размеры полости, и толщина стенки желудочка все очевидны.Для изучения кардиомиоцитов дифференциации в сердце, гетерозиготные стук в мышей были cre-помечены, чтобы показать кардиомиоцитов. Помеченные ячейки показаны здесь, в каждом направлении плоскости. Три плоскости были объединены, чтобы создать трехмерную визуализацию сердца.Красный кружил области в вставке показывает два полупрозрачных сердца мыши после прохождения техники ясности и вставляется в borosilicate стеклянные трубки. В дополнение к изучению послеродовых мышей, система визуализации также может быть использована для изучения сердца взрослой мыши. Здесь GFP помечены ROMK каналы отображаются на 7,5 месяцев.Они были в основном найдены в желудочковой стенке. После освоения, эта техника может быть сделано в одну-две минуты. При попытке этой процедуры, важно удалить все пузырьки вокруг образца в трубке.Другие методы, такие как автоматическая сегментация стеков изображений, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с сердечно-сосудистыми травмами и регенерацией. После своего развития, этот метод был использован исследователями для изучения сердечной архитектуры в послеродовой и взрослой стадии развития у мышей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Пациент конкретного моделирования сердца: оценка ориентации волокон Желудочковая

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Внутрисердечная боковая стрельба Световой катетер для мониторинга клеточного метаболизма с помощью трансмуральной абсорбции спектроскопии Перфизуд млекопитающих сердец

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Двухосная механические характеристики Предсердно-желудочковые клапаны

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Трансплантация 3D биопечатного патча в муринной модели инфаркта миокарда

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...