Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Författarna vill uttrycka tacksamhet till Thao Nguyen och Atsushi Nakano från UCLA för att tillhandahålla möss provet till bild. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (till Tzung K. Hsiai), HL083015 (till Tzung K. Hsiai), HD069305 (till N. C. Chi och Tzung K. Hsiai.), HL111437 (till Tzung K. Hsiai och N. C. Chi), HL129727 (till Tzung K. Hsiai) och University of Texas stjärnor finansiering (till Juhyun Lee).

Alla sådana förfaranden som inbegriper användning av djur har godkänts av den institutionella granskning kommittéer (IACUC) vid University of California, Los Angeles, Kalifornien.
1. imaging System Setup
Obs: Se figur 1 och figur 2.
<ol><li>Hämta en kontinuerlig våg (CW) laser med 3 våglängder: 405 nm, 473 nm och 532 nm. Plats 2 speglar (M1 och M2) 150 mm isär och justera dem med sina spegel pla...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM system och teknik som beskrivs här använder tredjeparts en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing till bild mus hjärtat på postnatal och vuxna stadier av sin utveckling. En traditionell enda belysning balk lider photon spridning och absorption genom tjockare och större vävnad prover1,3. Dubbelsidiga balkar ger en mer jämn belysning av provet, vilket minimerar effekten av striping och andra artefakter som ofta ses i bilder som pro...

Ljus-ark fluorescensmikroskopi var en teknik som utvecklades först 1903 och används idag som en metod att studera genuttryck och också att producera 3D- eller 4-D modeller av vävnad prover1,2,3. Detta imaging metoden använder en tunn plåt av ljus att lysa upp ett enda plan ett urval så att endast det planet fångas av detektorn. Provet kan då flyttas i axiell riktning-att fånga varje lager, ett avsnitt i taget, och rendera en 3D-modell efter efterbehandling av förvärvade bilder4. Dock på grund av absorption och spridning av fotoner, har LSFM begränsats till prover som är antingen några mikrometer tjock eller optiskt transparent1.
Begränsningar i LSFM har lett till omfattande studier av organismer som har vävnader som är optiskt transparenta, såsom zebrafiskar. Studier på hjärt utveckling och differentiering genomförs ofta zebrafiskar eftersom det finns bevarade gener mellan människor och zebrafiskar5,6. Även om dessa studier har lett till framsteg i hjärt forskning som rör kardiomyopatier6,7, finns det fortfarande ett behov av att genomföra liknande forskning på högre organismer såsom däggdjur.
Hjärt däggdjursvävnader utmaning en på grund av tjockleken och opacitet av vävnad, upptaget på grund av hemoglobin i röda blodkroppar och den striping som uppstår p.g.a. ensidig belysning av provet enligt traditionell LSFM metoder1 , 8. för att kompensera för dessa begränsningar, vi föreslagit att använda dubbelsidiga belysning och en förenklad version av klarhet teknik9 kombinerat med ett brytningsindex på lösningen (fälgar). Detta system möjliggör därför avbildning av ett prov som är större än 10 x 10 x 10 mm3 samtidigt bibehålla en bra upplösning i axiell och laterala plan8.
Detta system var först kalibreras med hjälp av fluorescerande pärlor arrangerade i olika konstellationer inom glas slangen. Systemet användes sedan till bild efter förlossning och vuxen murina hjärtan. Det första fotograferades postnatal mus hjärtat på 7 dagar (P7) att avslöja den ventrikulära kaviteten, tjockleken på ventrikulära väggen, ventil strukturer och förekomsten av trabeculation. För det andra, en studie genomfördes för att identifiera celler som skulle differentieras till hjärtmuskelcellerna genom en postnatal mus hjärtat på 1 dag (P1) med Cre-märkt hjärtmuskelceller och gula fluorescerande protein (YFP). Slutligen var vuxna möss vid 7,5 månader avbildas för att observera förekomsten av nedsatt yttre medullär kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi har använts för snabb bild förvärv med en hög axiell upplösning från mikrometer till millimeter skala. Traditionella ljus ark tekniker innebär användning av en enda belysning stråle riktad vinkelrätt mot vävnadsprover. Bilder av stora prover som produceras med hjälp av en enda belysning balk innehålla ränder eller artefakter och lider av en minskad upplösning tack vare spridningen och ljus absorberas av vävnaden. Denna studie använder en dubbelsidig belysning balk och en förenklad tydlighet optiska clearing teknik för murina hjärtat. Dessa tekniker möjliggör djupare imaging genom att ta bort lipider från hjärtat och producera ett stort fält av imaging, större än 10 x 10 x 10 mm3. Som ett resultat, denna strategi gör det möjligt att kvantifiera de ventrikulära dimensionerna, spåra hjärt härstamning och lokalisera den rumsliga fördelningen av hjärt-specifika proteiner och jonkanaler från den postnatala till vuxen mus hjärtan med tillräcklig kontrast och upplösning.

Den teknik som beskrivs används här en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing av mus hjärtat vävnadsprover för att uppnå en djupare imaging djup och en större imaging volym med tillräcklig imaging upplösning (figur 1). För att kalibrera systemet, placerades fluorescerande pärlor inuti glas slangen och inom imaging system. Pärlor var sedan avbildas och visualiseras i x-y-planet, y-z-planet, och i det x-z-planet, för att få p...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Denna studie använder en dubbelsidig belysning ljus ark fluorescence mikroskopi (LSFM) teknik kombinerat med optisk clearing för att studera murina hjärtat.

Ljus-ark fluorescensmikroskopi för studien av murina hjärtat

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör snabb avbildning av antingen musen hjärtat. Och det kan användas för att observera närvaron av luftkanaler efter genterapi. Även om denna metod kan ge insikt i utveckling kardiologi, det kan också tillämpas på andra system, såsom neurologi och pulmonologi.Generellt kommer individer att kämpa med denna teknik eftersom montering en bildbehandling av den vuxna musen hjärtat kan vara svårt, och det skiljer sig från andra, traditionella tekniker, såsom konfokal och inverterad mikroskopi. Placera en kontinuerlig våglaser med tre våglängder på 405 nanometer, 473 nanometer, och 532 nanometer. Sedan, fäst spegel ett och anpassa den med spegeln planet i 45 grader till balken.Detta kommer att rikta lasern mot strålklystna, som bildar dubbelsidig belysning setup. Därefter passerar strålen genom en 50 millimeters diameter neutral densitet filter, en balk expander, och en 25 millimeter diameter stifthål, alla placerade 150 millimeter från varandra. Passera strålen genom en 50-50 balk splitter, placeras 150 millimeter från hålhålet.Därefter placerar du spegel två 150 millimeter från balkdelaren, i 90 grader till framåtbalken, och riktar in den så att dess spegelplan är i 45 graders vinkel mot balken. Placera sedan spegel tre 100 millimeter från spegel två, och anpassa den så att det är spegelplanet är i en 45 graders vinkel mot strålen reflekteras från spegel två. Använd denna reflekterade strål för att bilda ena sidan av den dubbla belysningen ljusark.På den bortre sidan av balken splitter, placera spegel fem så att det är spegel plan är på 45 grader till balken som släpps ut i en framåt riktning. Använd strålen som avges från spegel fem för att bilda den andra sidan av den dubbla belysningen ljus ark. Därefter inrätta dual-sided belysning systemet i systemisk mode.Placera cylindrisk lins två 150 millimeter bort från spegel tre, och en annan identisk cylindrisk lins 150 millimeter bort från spegel fem, på andra sidan av den dubbla belysning setup. Därefter placerar två speglar, var och en i linje med de cylindriska linserna, på avstånd av 50 millimeter för att reflektera strålen vid 90 grader. På båda sidor av ljusbladet, bilda en akromatisk doublet från ett par linser, med den första linsen placeras 100 millimeter från föregående spegel, och har en en tum diameter och en brännvidd på 100 millimeter.Den andra linsen bör placeras 160 millimeter från lins ett, med en diameter på en tum, och en brännvidd på 60 millimeter. Placera sedan belysningsmålen ett och två 150 millimeter från de tidigare akromatiska dubbleterna, så att de är i linje med strålen. Strålen som avges från målen bildar ljusbladet för avbildning av proverna.Förbered först lysrörspärlor provet genom att späda en 0,53 mikrometer pärla pärla lösning, en till 150, 000, i en förvörd brytningsindex matchande lösning, med en procent låg smältpekande uppstod. Därefter använder en bit borosilikatglasrör med en innerdiameter på 12 millimeter, och en yttre diameter på 18 millimeter, till en längd av 30 millimeter. Pipettera pärlan agaroslösning i borosilikatrören och låt agarosen stelna vid rumstemperatur.Nu, fyll en 3-D tryckt ABS kammare med en 99,5 procent gylcerol lösning. Placera borosilikatglasrör, som innehåller pärlorna, inne i kammaren. Fäst ett 3-D motoriserat translationellt stadium på borosilikatglasslangen för att kontrollera provets rörelse och orientering inom ABS-kammaren.Sedan använder anpassad utformad programvara för att förvärva bilder med hjälp av sCMOS kameran, med en hastighet av 30 bilder per sekund. Använd motorstyrenheten, flytta provet en millimeter i den laterala riktningen, och skaffa bilder vid varje en millimeters steg, tills hela provet har avbildats. Stapla de förvärvade bilderna med hjälp av en visualiseringsprogramvara, och mät punktspridningsfunktionen i systemet med hjälp av dessa pärlbilder.Använd en brytningsindexmatchningslösning, med ett pH-värde på 7,5, och lös upp en procents agaros i den matchande lösningen. Placera ett rensat vuxenmushjärtaprov i brytningsindexmatchningslösningen, med en procents upplösta. Sätt sedan in provet i borosilikatglasrör, och låt agarosen stelna vid rumstemperatur.Fäst en 3-D motoriserad translationellt stadium till borosilikatglasrör för att kontrollera förflyttning och orientering av provet inom en 3D-tryckt ABS-kammare. Placera provet så att det är i mitten av gaussiska strålen, skapad av det dubbla belysningssystemet. Sedan ställer du in förvärvsfrekvensen för sCMOS-kameran till 30 bilder per sekund.Nu, med hjälp av motorstyrenheten, flytta provet en millimeter i axial riktning och skaffa bilder vid varje millimeter steg. Fortsätt tills hela provet har avbildats. Stapla de förvärvade bilderna med hjälp av en visualiseringsprogramvara.Utveckla 3D-bilderna med hjälp av dessa bildstaplar. För att åstadkomma detta, deconvolve punkt sprida funktion bestäms tidigare, och utnyttja den för de förvärvade bilden stackar. Ställ slutligen in ett värde för tröskelvärdet för tröskelvärdet för tröskelvärden för en pixel för att observera hjärtats konturer, och lägg till pseudofärg i bilderna, baserat på den här gråskaleintensiteten.Vid dag ett post-natal, kan man visualisera ventiler, atrium, ventrikel, pectinate muskel, och trabeculation, bland andra funktioner. Vid dag sju postnatal, funktionerna är ännu mer definierade. Atrium, ventrikel, ventrikulärt hålighet dimensioner, och ventrikelväggen tjocklek är alla uppenbara.Att studera kardiomycyt differentiering i hjärtat, heterozygous knock-in möss var cre-märkt att visa kardiomyocyter. De märkta cellerna visas här, i varje planriktning. De tre planen slogs samman, för att skapa en 3D-rendering av hjärtat.Den röda inringade regionen inom infälld visar två genomskinliga mushjärtan efter att ha genomgått klarhetstekniken och satts in i borosilikatglasslangen. Förutom att studera postnatala möss kan bildsystemet också användas för att studera det vuxna mushjärtat. Här visas GFP taggade ROMK-kanaler på 7,5 månader.Dessa hittades främst i ventrikelväggen. När behärskar, kan denna teknik göras i en till två minuter. När du försöker detta förfarande, är det viktigt att ta bort alla bubblor runt provet i röret.Andra metoder, såsom auto-segmentering av bilden stackar, kan utföras för att besvara ytterligare frågor som rör kardiovaskulär skada och regenerering. Efter dess utveckling, denna teknik användes av forskare för att studera hjärtarkitektur i postnatala och vuxna utvecklingsstadier hos möss.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specifik modellering av hjärta: Uppskattning av riktlinjer Ventrikulära Fiber

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-kardiell sido bränning ljus kateter för övervakning cellulär metabolism med transmural Absorbansspektroskopi av parfymera däggdjurs hjärtan

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekaniska karakteriseringar av atrioventrikulärt hjärtklaffar

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Transplantation av en 3D Bioprinted Patch i en Murine modell av hjärtinfarkt

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...