Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Författarna vill uttrycka tacksamhet till Thao Nguyen och Atsushi Nakano från UCLA för att tillhandahålla möss provet till bild. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (till Tzung K. Hsiai), HL083015 (till Tzung K. Hsiai), HD069305 (till N. C. Chi och Tzung K. Hsiai.), HL111437 (till Tzung K. Hsiai och N. C. Chi), HL129727 (till Tzung K. Hsiai) och University of Texas stjärnor finansiering (till Juhyun Lee).

Alla sådana förfaranden som inbegriper användning av djur har godkänts av den institutionella granskning kommittéer (IACUC) vid University of California, Los Angeles, Kalifornien.
1. imaging System Setup
Obs: Se figur 1 och figur 2.
<ol><li>Hämta en kontinuerlig våg (CW) laser med 3 våglängder: 405 nm, 473 nm och 532 nm. Plats 2 speglar (M1 och M2) 150 mm isär och justera dem med sina spegel pla...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM system och teknik som beskrivs här använder tredjeparts en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing till bild mus hjärtat på postnatal och vuxna stadier av sin utveckling. En traditionell enda belysning balk lider photon spridning och absorption genom tjockare och större vävnad prover1,3. Dubbelsidiga balkar ger en mer jämn belysning av provet, vilket minimerar effekten av striping och andra artefakter som ofta ses i bilder som pro...

Ljus-ark fluorescensmikroskopi var en teknik som utvecklades först 1903 och används idag som en metod att studera genuttryck och också att producera 3D- eller 4-D modeller av vävnad prover1,2,3. Detta imaging metoden använder en tunn plåt av ljus att lysa upp ett enda plan ett urval så att endast det planet fångas av detektorn. Provet kan då flyttas i axiell riktning-att fånga varje lager, ett avsnitt i taget, och rendera en 3D-modell efter efterbehandling av förvärvade bilder4. Dock på grund av absorption och spridning av fotoner, har LSFM begränsats till prover som är antingen några mikrometer tjock eller optiskt transparent1.
Begränsningar i LSFM har lett till omfattande studier av organismer som har vävnader som är optiskt transparenta, såsom zebrafiskar. Studier på hjärt utveckling och differentiering genomförs ofta zebrafiskar eftersom det finns bevarade gener mellan människor och zebrafiskar5,6. Även om dessa studier har lett till framsteg i hjärt forskning som rör kardiomyopatier6,7, finns det fortfarande ett behov av att genomföra liknande forskning på högre organismer såsom däggdjur.
Hjärt däggdjursvävnader utmaning en på grund av tjockleken och opacitet av vävnad, upptaget på grund av hemoglobin i röda blodkroppar och den striping som uppstår p.g.a. ensidig belysning av provet enligt traditionell LSFM metoder1 , 8. för att kompensera för dessa begränsningar, vi föreslagit att använda dubbelsidiga belysning och en förenklad version av klarhet teknik9 kombinerat med ett brytningsindex på lösningen (fälgar). Detta system möjliggör därför avbildning av ett prov som är större än 10 x 10 x 10 mm3 samtidigt bibehålla en bra upplösning i axiell och laterala plan8.
Detta system var först kalibreras med hjälp av fluorescerande pärlor arrangerade i olika konstellationer inom glas slangen. Systemet användes sedan till bild efter förlossning och vuxen murina hjärtan. Det första fotograferades postnatal mus hjärtat på 7 dagar (P7) att avslöja den ventrikulära kaviteten, tjockleken på ventrikulära väggen, ventil strukturer och förekomsten av trabeculation. För det andra, en studie genomfördes för att identifiera celler som skulle differentieras till hjärtmuskelcellerna genom en postnatal mus hjärtat på 1 dag (P1) med Cre-märkt hjärtmuskelceller och gula fluorescerande protein (YFP). Slutligen var vuxna möss vid 7,5 månader avbildas för att observera förekomsten av nedsatt yttre medullär kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi har använts för snabb bild förvärv med en hög axiell upplösning från mikrometer till millimeter skala. Traditionella ljus ark tekniker innebär användning av en enda belysning stråle riktad vinkelrätt mot vävnadsprover. Bilder av stora prover som produceras med hjälp av en enda belysning balk innehålla ränder eller artefakter och lider av en minskad upplösning tack vare spridningen och ljus absorberas av vävnaden. Denna studie använder en dubbelsidig belysning balk och en förenklad tydlighet optiska clearing teknik för murina hjärtat. Dessa tekniker möjliggör djupare imaging genom att ta bort lipider från hjärtat och producera ett stort fält av imaging, större än 10 x 10 x 10 mm3. Som ett resultat, denna strategi gör det möjligt att kvantifiera de ventrikulära dimensionerna, spåra hjärt härstamning och lokalisera den rumsliga fördelningen av hjärt-specifika proteiner och jonkanaler från den postnatala till vuxen mus hjärtan med tillräcklig kontrast och upplösning.

Den teknik som beskrivs används här en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing av mus hjärtat vävnadsprover för att uppnå en djupare imaging djup och en större imaging volym med tillräcklig imaging upplösning (figur 1). För att kalibrera systemet, placerades fluorescerande pärlor inuti glas slangen och inom imaging system. Pärlor var sedan avbildas och visualiseras i x-y-planet, y-z-planet, och i det x-z-planet, för att få p...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Denna studie använder en dubbelsidig belysning ljus ark fluorescence mikroskopi (LSFM) teknik kombinerat med optisk clearing för att studera murina hjärtat.

Ljus-ark fluorescensmikroskopi för studien av murina hjärtat

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör snabb avbildning av antingen musen hjärtat. Och det kan användas för att observera närvaron av luftkanaler efter genterapi. Även om denna metod kan ge insikt i utveckling kardiologi, det kan också tillämpas på andra system, såsom neurologi och pulmonologi.Generellt kommer individer att kämpa med denna teknik eftersom montering en bildbehandling av den vuxna musen hjärtat kan vara svårt, och det skiljer sig från andra, traditionella tekniker, såsom konfokal och inverterad mikroskopi. Placera en kontinuerlig våglaser med tre våglängder på 405 nanometer, 473 nanometer, och 532 nanometer. Sedan, fäst spegel ett och anpassa den med spegeln planet i 45 grader till balken.Detta kommer att rikta lasern mot strålklystna, som bildar dubbelsidig belysning setup. Därefter passerar strålen genom en 50 millimeters diameter neutral densitet filter, en balk expander, och en 25 millimeter diameter stifthål, alla placerade 150 millimeter från varandra. Passera strålen genom en 50-50 balk splitter, placeras 150 millimeter från hålhålet.Därefter placerar du spegel två 150 millimeter från balkdelaren, i 90 grader till framåtbalken, och riktar in den så att dess spegelplan är i 45 graders vinkel mot balken. Placera sedan spegel tre 100 millimeter från spegel två, och anpassa den så att det är spegelplanet är i en 45 graders vinkel mot strålen reflekteras från spegel två. Använd denna reflekterade strål för att bilda ena sidan av den dubbla belysningen ljusark.På den bortre sidan av balken splitter, placera spegel fem så att det är spegel plan är på 45 grader till balken som släpps ut i en framåt riktning. Använd strålen som avges från spegel fem för att bilda den andra sidan av den dubbla belysningen ljus ark. Därefter inrätta dual-sided belysning systemet i systemisk mode.Placera cylindrisk lins två 150 millimeter bort från spegel tre, och en annan identisk cylindrisk lins 150 millimeter bort från spegel fem, på andra sidan av den dubbla belysning setup. Därefter placerar två speglar, var och en i linje med de cylindriska linserna, på avstånd av 50 millimeter för att reflektera strålen vid 90 grader. På båda sidor av ljusbladet, bilda en akromatisk doublet från ett par linser, med den första linsen placeras 100 millimeter från föregående spegel, och har en en tum diameter och en brännvidd på 100 millimeter.Den andra linsen bör placeras 160 millimeter från lins ett, med en diameter på en tum, och en brännvidd på 60 millimeter. Placera sedan belysningsmålen ett och två 150 millimeter från de tidigare akromatiska dubbleterna, så att de är i linje med strålen. Strålen som avges från målen bildar ljusbladet för avbildning av proverna.Förbered först lysrörspärlor provet genom att späda en 0,53 mikrometer pärla pärla lösning, en till 150, 000, i en förvörd brytningsindex matchande lösning, med en procent låg smältpekande uppstod. Därefter använder en bit borosilikatglasrör med en innerdiameter på 12 millimeter, och en yttre diameter på 18 millimeter, till en längd av 30 millimeter. Pipettera pärlan agaroslösning i borosilikatrören och låt agarosen stelna vid rumstemperatur.Nu, fyll en 3-D tryckt ABS kammare med en 99,5 procent gylcerol lösning. Placera borosilikatglasrör, som innehåller pärlorna, inne i kammaren. Fäst ett 3-D motoriserat translationellt stadium på borosilikatglasslangen för att kontrollera provets rörelse och orientering inom ABS-kammaren.Sedan använder anpassad utformad programvara för att förvärva bilder med hjälp av sCMOS kameran, med en hastighet av 30 bilder per sekund. Använd motorstyrenheten, flytta provet en millimeter i den laterala riktningen, och skaffa bilder vid varje en millimeters steg, tills hela provet har avbildats. Stapla de förvärvade bilderna med hjälp av en visualiseringsprogramvara, och mät punktspridningsfunktionen i systemet med hjälp av dessa pärlbilder.Använd en brytningsindexmatchningslösning, med ett pH-värde på 7,5, och lös upp en procents agaros i den matchande lösningen. Placera ett rensat vuxenmushjärtaprov i brytningsindexmatchningslösningen, med en procents upplösta. Sätt sedan in provet i borosilikatglasrör, och låt agarosen stelna vid rumstemperatur.Fäst en 3-D motoriserad translationellt stadium till borosilikatglasrör för att kontrollera förflyttning och orientering av provet inom en 3D-tryckt ABS-kammare. Placera provet så att det är i mitten av gaussiska strålen, skapad av det dubbla belysningssystemet. Sedan ställer du in förvärvsfrekvensen för sCMOS-kameran till 30 bilder per sekund.Nu, med hjälp av motorstyrenheten, flytta provet en millimeter i axial riktning och skaffa bilder vid varje millimeter steg. Fortsätt tills hela provet har avbildats. Stapla de förvärvade bilderna med hjälp av en visualiseringsprogramvara.Utveckla 3D-bilderna med hjälp av dessa bildstaplar. För att åstadkomma detta, deconvolve punkt sprida funktion bestäms tidigare, och utnyttja den för de förvärvade bilden stackar. Ställ slutligen in ett värde för tröskelvärdet för tröskelvärdet för tröskelvärden för en pixel för att observera hjärtats konturer, och lägg till pseudofärg i bilderna, baserat på den här gråskaleintensiteten.Vid dag ett post-natal, kan man visualisera ventiler, atrium, ventrikel, pectinate muskel, och trabeculation, bland andra funktioner. Vid dag sju postnatal, funktionerna är ännu mer definierade. Atrium, ventrikel, ventrikulärt hålighet dimensioner, och ventrikelväggen tjocklek är alla uppenbara.Att studera kardiomycyt differentiering i hjärtat, heterozygous knock-in möss var cre-märkt att visa kardiomyocyter. De märkta cellerna visas här, i varje planriktning. De tre planen slogs samman, för att skapa en 3D-rendering av hjärtat.Den röda inringade regionen inom infälld visar två genomskinliga mushjärtan efter att ha genomgått klarhetstekniken och satts in i borosilikatglasslangen. Förutom att studera postnatala möss kan bildsystemet också användas för att studera det vuxna mushjärtat. Här visas GFP taggade ROMK-kanaler på 7,5 månader.Dessa hittades främst i ventrikelväggen. När behärskar, kan denna teknik göras i en till två minuter. När du försöker detta förfarande, är det viktigt att ta bort alla bubblor runt provet i röret.Andra metoder, såsom auto-segmentering av bilden stackar, kan utföras för att besvara ytterligare frågor som rör kardiovaskulär skada och regenerering. Efter dess utveckling, denna teknik användes av forskare för att studera hjärtarkitektur i postnatala och vuxna utvecklingsstadier hos möss.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxial mekaniska karakteriseringar av atrioventrikulärt hjärtklaffar

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Blodflödesavbildning med ultrasnabb Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Avbildning av biologiska vävnader med kombinerad tvåfoto fluorescens och stimulerad Raman spridningsmikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Analys av zebrafiskens hjärtkontraktion med Virtual Reality Interaction

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Författare i fokus: Högupplöst 4D Light-Sheet avbildning och virtuell verklighet i zebrafisk för encellsanalys av hjärtfunktion

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

4D-ljusarksavbildning av zebrafiskens hjärtkontraktion

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...