Name: light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Yazarlar Thao Nguyen ve Atsushi Nakano UCLA'dan fareler örnek görüntü sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (için Tzung K. Hsiai), HL083015 (için Tzung K. Hsiai), HD069305 (için N. C. Chi ve Tzung K. Hsiai.), HL111437 (için Tzung K. Hsiai ve N. C. Chi), HL129727 (için Tzung K. Hsiai) ve University of Texas sistemi yıldız (Juhyun için finansman tarafından desteklenen Lee).

Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, California kurumsal inceleme komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmış olması.
1. görüntüleme sistem kurulumu
Not: Resim 1 ve Şekil 2bakın.
<ol><li>Sürekli dalga (CW) lazer 3 dalga boyu ile almak: 405 nm, 473 nm ve 532 nm. Place 2 (M1 ve M2) 150 mm ayrı yansıtır ve onları ayna uçaklarını kirişe 45 °...

<ol>
	<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution.">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209 (2017).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+excision+of+murine+aorta;+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease.">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).</li><li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).</li><li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping.">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736 (2016).</li><li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes.">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li><li>FEI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amira User's Guide. , 59-138 (2017).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit.">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li></ol>

LSFM sistemi ve burada açıklanan tekniği kullanır onun gelişim Doğum sonrası ve yetişkin aşamasında görüntü fare kalp için bir optik temizlenmesi ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını. Foton saçılma ve emilimi ile daha büyük ve kalın doku örnekleri1,3geleneksel tek aydınlatma ışını muzdarip. Çift taraflı kirişler örnek böylece şeritleme ve tek taraflı bir aydınlatma tarafından üretilen görüntüler sık görülen...

Işık sayfalık floresans mikroskobu ilk 1903 yılında geliştirilen bir teknik olduğunu ve bugün bir yöntem olarak gen ekspresyonu çalışma ve doku örnekleri1,2,33-b veya 4-D modelleri üretmek için kullanılır. Böylece sadece o uçağı dedektörü tarafından yakalanır örneği tek bir uçağı aydınlatmak için ışık ince bir levha bu görüntüleme yöntemini kullanır. Örnek sonra eksenel yönde her yakalamak için hareket edebilir, her seferinde bir bölümü katman ve 3B modele alınan görüntüleri4sonrası işlendikten sonra render. Ancak, emme ve fotonlar saçılma nedeniyle, LSFM ya da birkaç mikron kalınlığında veya optik şeffaf1örnekleri sınırlı olmuştur.
LSFM sınırlamaları optik şeffaf, zebra balığı gibi dokulara sahip organizmaların kapsamlı çalışmalar yol açmıştır. İnsanlar ve zebra balığı5,6arasında korunmuş gen olduğundan kalp geliştirme ve farklılaşma ilgili çalışmalar kez zebra balığı üzerinde yapılmaktadır. Bu çalışmalar kalp araştırma kardiyomiyopatiler6,7' ye ile ilgili gelişmeler yol açmıştır, ancak, bu hala memeliler gibi üst düzey organizmalar üzerinde benzer araştırma yapmak gerek vardır.
Memeli kalp doku kalınlığı ve opaklık doku, kırmızı kan hücreleri ve tek taraflı aydınlatma geleneksel LSFM yöntemleri1 altında örnek nedeniyle oluşur şeritleme hemoglobin nedeniyle emme nedeniyle bir meydan okuma sunuyor , 8. Bu sınırlamalar için telafi etmek için biz çift taraflı aydınlatma ve çözüm (jant) eşleşen bir kırılma indisi ile kombine netlik tekniği9 basitleştirilmiş bir sürümünü kullanmak için önerilen. Bu nedenle, bu sistem bakımı iyi nitelik kararlılık Aksiyel ve yanal8uçak iken 10 x 10 x 10 mm3 daha büyük bir örnek görüntüleme için sağlar.
Bu sistem ilk floresan boncuk cam boru içinde farklı konfigürasyonlarda düzenlenmiş kullanılarak kalibre. Sonra sistem Doğum sonrası ve yetişkin fare kalpler görüntü için kullanıldı. İlk olarak, Doğum sonrası fare kalp 7 gün (ventrikül boşluğuna, kalınlığı ventrikül duvar, vana yapıları ve trabeculation varlığını ortaya çıkarmak için P7) görüntüsü. İkinci olarak, bir çalışma cardiomyocytes 1 gün (P1) Cre etiketli cardiomyocytes ve Sarı floresan protein (YFP) ile Doğum sonrası fare kalp kullanarak hücre tanımlamak için yapılmıştır. Son olarak, yetişkin fareler 7,5 aylıkken böbrek dış medüller potasyum varlığı (ROMK) kanalları gen terapisi8' den sonra gözlemlemek için görüntüsü.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:967px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">CW Laser</td>
			<td style="width:136px;">Laserglow Technologies</td>
			<td style="width:393px;">LMM-GBV1-PF3-00300-05</td>
			<td style="width:191px;">Excitation of fluorophores</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Neutral density filter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">NDC-50C-4M</td>
			<td style="width:191px;">Controls amount of light entering system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Achromatic beam expander</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">GBE05-A</td>
			<td style="width:191px;">Expands the beam of light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Mechanical slit</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">VA100C</td>
			<td style="width:191px;">Controls width of beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Beam splitter</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">BS013</td>
			<td style="width:191px;">Forms dual-illumination beam</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Stereo microscope with 1X objective lense</td>
			<td style="width:136px;">Olympus</td>
			<td style="width:393px;">MVX10</td>
			<td style="width:191px;">Used for observation of sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td>
			<td style="width:136px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:393px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:191px;">Used to capture Images</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)</td>
			<td style="width:136px;">Stratasys</td>
			<td style="width:393px;">uPrint</td>
			<td style="width:191px;">Material used to 3-D print a sample holder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Fluorescent polystyrene beads</td>
			<td style="width:136px;">Spherotech Inc</td>
			<td style="width:393px;">PP-05-10</td>
			<td style="width:191px;">Used for imaging system calibration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass tubing</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:393px;">Pyrex 7740</td>
			<td style="width:191px;">Tubing for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP229-4</td>
			<td style="width:191px;">Fill for sample chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:393px;">BP39920</td>
			<td style="width:191px;">Rinse solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:393px;">RT-15700</td>
			<td style="width:191px;">First incubation solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">AAL-107</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with 2,2&#39;-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">2,2&#39;-Azobis dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:393px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">71725</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:393px;">A74-1</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Sigma D2158</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">D2158</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11332465001</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:191px;">Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP</td>
			<td style="width:136px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:393px;">VB2045</td>
			<td style="width:191px;">Expresses GFP when bound to ROMK</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">DC Servo Motor Actuator</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">Z825B</td>
			<td style="width:191px;">Used for movement of sample in axial direction within light sheet</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td>
			<td style="width:136px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:393px;">KDC101</td>
			<td style="width:191px;">Connects to motor actuator and controls movement of the actuator</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Amira</td>
			<td style="width:136px;">FEI Software</td>
			<td style="width:393px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">Visualization software for producing 2-D and 3-D images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart

Işık sayfalık floresans mikroskobu mikrometre yüksek bir Aksiyel çözünürlüğünden milimetre ölçek ile hızlı resim alma için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel ışık sayfalık teknikleri uygun örnek doku yönettiği bir tek aydınlatma ışın kullanımı dahil. Bir tek aydınlatma ışını kullanılarak üretilen büyük örnekleri görüntüleri şeritler veya eserler içeren ve düşük çözünürlüğe saçılma ve doku tarafından ışık emilimi nedeniyle muzdarip. Bu çalışmada bir çift taraflı aydınlatma ışını ve Basitleştirilmiş netlik fare kalp için teknik Temizleme optik kullanır. Bu teknikler yürekten lipidler kaldırarak daha derin görüntüleme için izin ve büyük bir alan görüntüleme, 10 x 10 x 10 mm3daha büyük üreten. Sonuç olarak, bu strateji ventrikül boyutları ölçmek, kardiyak lineage izlemek ve kardiyak spesifik proteinler ve iyon-kanalları Doğum sonrası yetişkin fare kalpler yeterli kontrast için kayma dağılımını yerelleştirmek bize sağlar ve çözünürlük.

Açıklanan tekniği fare kalp doku örnekleri bir optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını daha derin bir görüntüleme derinliği ve daha büyük görüntüleme birimi yeterli görüntü çözünürlüğü (Şekil 1) ile elde etmek için burada kullanılmıştır. Sistem ayarlamak için floresan boncuk cam boru içinde ve görüntüleme sistemi içinde yerleştirildi. Boncuk sonra yansıma ve x-y uçak, y-z uçak, görüntülenir ve...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Bu teknolojinin en büyük avantajı fare kalp ya hızlı görüntüleme için izin olmasıdır. Ve gen terapisi nden sonra hava kanallarının varlığını gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntem gelişim kardiyolojisi hakkında bilgi sağlasa da nöroloji ve pulmonoloji gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Genellikle bireyler bu teknikle mücadele edeceklerdir, çünkü yetişkin fare kalbinin bir görüntülemesini yapmak zor olabilir ve konfokal ve ters mikroskopi gibi diğer geleneksel tekniklerden farklıdır. 405 nanometre, 473 nanometre ve 532 nanometre üç dalga boyları ile sürekli dalga lazer yerleştirin. Daha sonra, ayna bir yapıştırın ve kiriş için 45 derece ayna düzlemi ile hizalayın.Bu, lazeri çift taraflı aydınlatma kurulumlarını oluşturan ışın ayırıcıya yönlendirir. Daha sonra, 50 milimetre çapında nötr yoğunluk filtresi, bir ışın genişletici ve 25 milimetre çapında iğne deliği, birbirinden 150 milimetre konumlandırılmış bir ışın geçmek. Kirişi iğne deliğinden 150 milimetre uzaklıktaki 50-50 ışın bölücüse geçirin.Sonra, aynayı ışın ayırıcısından 150 milimetre, ileri ışına 90 derece, ve ayna düzlemi ışına 45 derecelik açıyla hizala. Sonra, aynayı aynadan üç 100 milimetre uzakta yerleştirin ve ayna düzleminin ayna ikiden yansıyan ışınına 45 derecelik bir açıyla hizala. Bu yansıyan ışını çift aydınlatma Lı ışık sayfasının bir tarafını oluşturmak için kullanın.Işın ayırıcısının uzak tarafına, ayna yıyerleştir inki, böylece ayna düzlemi 45 derecede, ileri yönde yayılan ışına kadar. Çift aydınlatma ışık sayfasının ikinci tarafını oluşturmak için ayna beşten yayılan ışını kullanın. Daha sonra, sistemik moda çift taraflı aydınlatma sistemi kurmak.Silindirik lensi ayna üçten iki 150 milimetre uzağa, diğer bir özdeş silindirik lensi ise ayna beşten 150 milimetre uzakta, çift aydınlatma düzeninin diğer tarafına yerleştirin. Daha sonra, her biri silindirik lenslerle aynı hizada, 90 derecelik kirişi yansıtacak şekilde 50 milimetrelik mesafelere iki ayna yerleştirin. Işık tabakasının her iki tarafında, bir çift mercekten akromatik bir doublet oluşturur, ilk lens önceki aynadan 100 milimetre uzaklıkta ve bir inç çapında ve odak uzaklığı 100 milimetredir.İkinci lens lens bir 160 milimetre yerleştirilmelidir, bir inç çapı ile, ve odak uzaklığı 60 milimetre. Daha sonra, aydınlatma hedeflerini önceki akromatik doublet'lerden bir ve iki 150 milimetre yerleştirin, böylece ışınla aynı hizada olurlar. Hedeflerden yayılan ışın, numunelerin görüntülenmesi için ışık sayfasını oluşturur.İlk olarak, floresan boncuk örneğini, önceden ısıtılmış kırılma indisi eşleştirme çözeltisinde 1'den 150'ye kadar olan 0,53 mikrometre boncuk çözeltisini seyrelterek, yüzde bir düşük erime ile agarose'u işaret ederek hazırlayın. Sonra, 12 milimetre iç çapı ile borosilikat cam boru bir parça kullanın, ve 18 milimetre bir dış çapı, 30 milimetre uzunluğunda. Pipet borosilikat boru boncuk agarose çözeltisi ve oda sıcaklığında katılaşmak için agarose sağlar.Şimdi, bir 3-D baskılı ABS odası doldurun 99.5 yüzde gylcerol çözeltisi ile. Borosilikat cam boru yerleştirin, boncuk içeren, odanın içine. ABS haznesinde numunenin hareketini ve yönünü kontrol etmek için borosilikat cam boruya 3 boyutlu motorlu çeviri aşaması takın.Ardından, saniyede 30 kare hızında sCMOS kamerayı kullanarak görüntü elde etmek için özel tasarlanmış yazılımkullanın. Motor denetleyicisini kullanarak, numuneyi yanal yönde bir milimetre hareket ettirin ve numunenin tamamı görüntülene ne kadar görüntülenene kadar her bir milimetrelik artışla görüntüler elde edin. Bir görselleştirme yazılımı kullanarak edinilen görüntüleri yığını ve bu boncuk görüntüleri kullanarak sistemin nokta yayma işlevini ölçmek.PH'sı 7,5 olan bir kırılma indisi eşleştirme çözümü kullanın ve eşleşen çözeltiye yüzde bir agarose çözün. Kırgın indeks eşleştirme çözeltisine yüzde bir agarose çözünmüş olarak temizlenmiş bir yetişkin fare kalp örneği yerleştirin. Daha sonra, borosilikat cam boru içine örnek ekleyin ve agarose oda sıcaklığında katılaşmak için izin.Numunenin hareketini ve yönünü kontrol etmek için borosilikat cam boruya 3-B baskılı ABS haznesine 3-B motorlu çeviri aşaması takın. Numuneyi, çift aydınlatma sistemi tarafından oluşturulan Gauss kirişinin merkezinde olacak şekilde yerleştirin. Ardından, sCMOS kameranın satın alma oranını saniyede 30 kare olarak ayarlayın.Şimdi, motor kumandasını kullanarak, numuneyi eksenel yönde bir milimetre hareket ettirin ve her bir milimetrelik artışta görüntüler elde edin. Tüm örnek görüntülenene kadar devam edin. Bir görselleştirme yazılımı kullanarak elde edilen görüntüleri yığını.Bu görüntü yığınlarını kullanarak 3-B görüntüleri geliştirin. Bunu başarmak için, daha önce belirlenen nokta yayma işlevini deconvolve ve elde edilen görüntü yığınları için kullanmak. Son olarak, kalbin hatlarını gözlemlemek için bir piksel eşik yoğunluğu değeri ayarlayın ve bu gri ölçek yoğunluğuna bağlı olarak görüntülere sözde renk ekleyin.Doğum sonrası ilk günde, diğer özelliklerin yanı sıra kapakçıklar, atriyum, ventrikül, pektinate kas ve trabekülasyon görselleştirebilirsiniz. Doğumdan sonraki yedinci günde, özellikler daha da tanımlanır. Atriyum, ventrikül, ventriküler kavite boyutları ve ventrikül duvar kalınlığı belirgindir.Kalp içinde kardiyomiyosit farklılaşmasını incelemek için, heterozigot knock-in fareler kardiyomiyositgöstermek için cre-labeled edildi. Etiketli hücreler burada, her düzlem yönünde gösterilir. Üç uçak birleşerek kalbin 3 boyutlu bir görüntüünü oluşturdu.Inset içinde kırmızı daire li bölge netlik tekniği geçiyor ve borosilikat cam boru içine yerleştirilen sonra iki yarı saydam fare kalpleri gösterir. Doğum sonrası fareleri incelemenin yanı sıra, görüntüleme sistemi yetişkin fare kalbini incelemek için de kullanılabilir. Burada, GFP etiketli ROMK kanalları 7,5 ay olarak gösterilir.Bunlar çoğunlukla ventriküler duvarda bulunmuştur. Bir kez hakim, bu teknik bir ila iki dakika içinde yapılabilir. Bu yordamı çalışırken, tüp içinde örnek etrafında tüm kabarcıklar kaldırmak için önemlidir.Görüntü yığınlarının otomatik bölümlenmesi gibi diğer yöntemler, kardiyovasküler yaralanma ve rejenerasyon ile ilgili ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Gelişiminden sonra, bu teknik araştırmacılar tarafından farelerde doğum sonrası ve erişkin gelişim evrelerinde kardiyak mimariyi incelemek için kullanılmıştır.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Biyomühendislik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Atriyoventriküler kalp kapakları biaxial mekanik karakterizasyonu

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının Sanal Gerçeklik Etkileşimi ile Analizi

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Yazar Spotlight: Kalp Fonksiyonunun Tek Hücreli Analizi için Zebra Balığında Yüksek Çözünürlüklü 4D Işık Sayfası Görüntüleme ve Sanal Gerçeklik

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...