Name: methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00
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नोवो Nordisk फाउंडेशन बुनियादी चयापचय अनुसंधान के लिए केंद्र कोपेनहेगन के विश्वविद्यालय में एक स्वतंत्र अनुसंधान केंद्र आंशिक रूप से नोवो Nordisk फाउंडेशन से एक अप्रतिबंधित दान द्वारा वित्त पोषित है ।

1. प्रतिबंध एंजाइम उपचार
<ol><li>Linearize प्रतिबंध एंजाइम BamHI के साथ कुल मानव डीएनए के इलाज से mtDNA, कि मानव mitochondrial डीएनए में १४२५८ की स्थिति में कटौती । नोट: माउस डीएनए के लिए, नीचे के रूप में समान शर्तों के तहत प्रतिबं...

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

यहाँ, हम विशेष रूप से mtDNA मिथाइल पूछताछ करने के लिए बनाया गया है जो एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. जीनोमिक डीएनए के लिए इस्तेमाल bisulfite-अनुक्रमण प्रोटोकॉल के साथ मतभेद एक पूर्व प्रतिबंध एंजाइम ?...

mitochondrial जीनोम एक परिपत्र, लगभग १६.५-किलो बेस (केबी) लंबे समय से, एक भारी और एक प्रकाश किनारा का गठन की संरचना डबल असहाय है । mitochondrial जीनोम प्रत्येक कोशिका के भीतर कई प्रतियां में मौजूद है, मातृ-विरासत में मिला है, और encodings सांस की चेन परिसरों के आवश्यक घटकों1। बैक्टीरियल जीनोम के समान और परमाणु जीनोम के विपरीत, mitochondrial जीनोम कई माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं में आयोजित किया जाता है, जैसे कुंडलित और supercoiled संरचनाओं में2, जो उपयोग मुश्किल प्रदान कर सकते हैं अनुक्रमण के दौरान गडबड३.
नाभिक में, डीएनए के मिथाइल एक बड़े पैमाने पर अध्ययन epigenetic निशान है कि कई प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में । स्तनधारी जीनोम में, डीएनए मिथाइल deoxycytidines के न्यूक्लियोटाइड अंगूठी की 5-स्थिति पर मुख्य रूप से होता है, ज्यादातर तटरक्षक dinucleotides (या CpG) पर । Cytosine मिथाइल दैहिक कोशिकाओं के जीनोम में सभी CpG के ७०% पर पाया जाता है और कुल डीएनए ठिकानों के ~ 1% के लिए खातों4। डीएनए मिथाइल को भी गैर-CpG संदर्भों में वर्णित किया गया है, इस तरह सीपीए, CpT, और सीपीसी के रूप में और परमाणु डीएनए में विभिंन मात्रा में मौजूद, सभी methylated cytosines के 25% के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में5,6,7के ऊपर मूल्यों के साथ ।
जबकि परमाणु जीनोम के cytosine मिथाइल व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं, mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल का अस्तित्व अभी भी विवादास्पद है । mtDNA मिथाइल की जांच करने वाले पहले अध्ययन में उन प्रसंस्कृत कक्षों का प्रदर्शन किया गया जहां mtDNA मिथाइल का आसानी से पता लगाया गया था, हालांकि परमाणु डीएनए8की तुलना में निचले स्तरों पर । दोनों मानव और murine कोशिकाओं में, mtDNA मिथाइल भी कम स्तर पर पाया गया (2-5%) । 5 methylcytosine कैप्चर पर आश्रित परख का उपयोग करना जैसे methylated डीएनए immunoprecipitation (MeDIP) मात्रात्मक पीसीआर के बाद, mtDNA मिथाइल भी विभिंन माउस और मानव और कोशिकाओं लाइनों में पाया गया था9,10, 11,12. एक एलिसा परख या मास स्पेक्ट्रोमेट्री में 5-methylcytosine के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रयोग, डीएनए मिथाइल का पर्याप्त स्तर शुद्ध mitochondrial अंशों13,14,15से पता लगाया गया, 16. हालांकि, aforementioned अध्ययन में परख के सबसे तकनीक है कि एक आधार-संकल्प पर डीएनए मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान डिजाइन नहीं थे इस्तेमाल किया ।
मात्रात्मक और resolutive डीएनए मिथाइल विश्लेषण "bisulfite अनुक्रमण" नाम की एक तकनीक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित करने के लिए एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में17 . bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर, अध्ययन के एक नक्षत्र विभिन्न स्तरों पर cytosine मिथाइल की उपस्थिति का पता चला है. डी-लूप क्षेत्र में मिथाइल mtDNA, 12S या 16S क्षेत्र में मानव के18,19,20,21,22,23 और माउस24 में आसानी से पाया गया ऊतकों और कोशिकाओं, तथापि, एक पेचीदा परिवर्तनशीलता के साथ, कुल cytosines के 1-20% की पढ़ाई के पार ।
इन कई अध्ययनों की तुलना में, केवल कुछ अध्ययनों, हमारे समूह सहित, mtDNA मिथाइल3,25,26,27 की उपस्थिति पर विवादित है या की जैविक प्रासंगिकता पर सवाल उठाए mtDNA स्तरों के बहुत निम्न स्तर (2%)28से नीचे । हाल ही में, हम पूरे mitochondrial bisulfite अनुक्रमण3में एक संभावित bisulfite अनुक्रमण विरूपण साक्ष्य के अवलोकन की सूचना दी । हम mitochondrial डीएनए की माध्यमिक संरचना bisulfite अनुक्रमण में झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकता है कि सबूत प्रदान की है, जिससे मिथाइल स्तर का आंकलन । हम यहां एक bisulfite के एक विरूपण साक्ष्य-mtDNA के रूपांतरण को रोकने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल mtDNA माध्यमिक संरचनाओं को बाधित और एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल के बाद bisulfite के लिए पूर्ण पहुँच की अनुमति देने के लिए डीएनए के एक सरल एंजाइमी पाचन का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम bisulfite अनुक्रमण के विश्लेषण के लिए एक साथ bioinformatic पाइपलाइन प्रदान करते हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

डीएनए ठहराव के bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित, एक एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में । Bisulfite अनुक्रमण (पीसीआर का उपयोग) लक्षित किया जा सकता है या पूरे जीनोम पर प्रदर्शन किया और एकल आधार-संकल्प पर cytosine मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान करता है । नाभिकीय और mitochondrial डीएनए की विशिष्ट प्रकृति को देखते हुए, विशेष रूप से द्वितीयक संरचना में, mtDNA में cytosine मिथाइल की जांच के लिए bisulfite अनुक्रमण विधियों के रूपांतरों को बनाया जाना चाहिए । mtDNA के माध्यमिक और तृतीयक संरचना वास्तव में एक-कतरा डीएनए को bisulfite के अधूरे विकार गरीब पहुंच के कारण झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी bisulfite अनुक्रमण कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहां, हम bioinformatic विश्लेषण पाइपलाइन के साथ युग्मित के साथ डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए cytosine में mtDNA मिथाइल स्तर के सटीक ठहराव अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम mtDNA के लिए विशिष्ट bisulfite अनुक्रमण प्राइमरों डिजाइनिंग के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, ताकि अवांछनीय परमाणु MiTochondrial खंडों (NUMTs) परमाणु जीनोम में डाला लक्ष्यीकरण से बचने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल में दो कदम महत्वपूर्ण जब mtDNA मिथाइल की जांच कर रहे हैं । 1) माध्यमिक संरचना के उद्घाटन और 2) mitochondrial डीएनए के डिजाइन विशिष्ट प्राइमरों ।
प्रतिबंध एंजाइम BamHI (<strong c...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

यहां, हम mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल के सटीक ठहराव की अनुमति देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का वर्णन एक bioinformatic विश्लेषण पाइप लाइन के साथ युग्मित जो mtDNA मिथाइल mtDNA की माध्यमिक संरचना की वजह से स्तर के अधिक से अधिक अनुमान से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ मिलकर BamHI ।

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

मरीज के ऊतकों के लिए मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कब्जा

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

उपन्यास आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अलगाव तेजी पद्धति द्वारा

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu धुंधला द्वारा ड्रोसोफिला एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के सीटू लेबलिंग में

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

क्रोनिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया मरीजों में मिथाइल-सीपीजी-बाध्यकारी डोमेन कैप्चर-आधारित पद्धति का उपयोग करके व्यापक डीएनए मेथिलैलेशन विश्लेषण

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

द्विदिश रेट्रोवायरल इंटीग्रेशन साइट पीसीआर क्रियाविधि और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

त्रुटि-सही डीएनए और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर दुर्लभ घटना का पता लगाने

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...