Name: methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00
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노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.

1. 제한 효소 처리
<ol><li>총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화. 참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다.</li>
	<li>각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물</li>
	<li>4 h 37 ° c.에 ?...

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 ?...

미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 "황산 시퀀싱", 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.

이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.
제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.
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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...