Name: methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation at JoVE.com

Novo Nordisk Vakfı Merkezi temel metabolik araştırma Kopenhag Üniversitesi kısmen sınırsız bir bağış Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen bir bağımsız araştırma merkezidir.

1. Restriksiyon enzimi tedavi
<ol><li>MtDNA insan mitokondriyal DNA'sını 14258 pozisyonda keser BamHI, Restriksiyon enzimi ile toplam insan DNA'sı kabul ederek linearize. Not: fare DNA için aynı koşullar altında Restriksiyon enzimi BglII aşağıdaki gibi kullanın.</li>
	<li>Her biri için mtDNA metilasyonu değerlendirilmesi, bir 0.2 mL tepki tüp hazırlamak ve (fluorometry tarafından sayısal), aşağıdaki mix: 3 μg genomik DNA eklemek için nerede 15 μL örnek tampon 3, 3 μL BamHI ve su ilâ 150 μL...

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

Burada, biz mtDNA metilasyonu sorguya çekmek için özel olarak tasarlanmış bir bisülfit-sıralama iletişim kuralı sağlar. Genomik DNA örneği almak için kullanılan bisülfit-sıralama iletişim kuralları ile farklılıklar bir önceki Restriksiyon enzimi sindirim adım ve bioinformatic analiz kullanımı dışarı yanlış pozitif NUMT dizileri kaynaklanan iktidar yatıyor.
MtDNA metilasyonu soruşturma bisülfit-sıralama yapıları önlemek için bir protokol sağlar. Yanlış-mu...

Mitokondrial genom yaklaşık 16,5-kilo Bankası (kb) dairesel, Çift iplikçikli yapısını uzun, bir ağır ve hafif bir tel adıyla aynıdır. Mitokondrial genom her hücresi olarak maternally-miras, birden çok kopya mevcut ve solunum zinciri kompleksleri1temel bileşenlerine kodlar. Benzer bakteriyel genom ve nükleer genom aksine, mitokondriyal genom sayısız ikincil ve üçüncül yapılarını gibi sarmal ve supercoiled yapıları2erişim sırasında sıralama zor hale getirebilir, düzenlenmiştir deneyler3.
Çekirdeğinde, DNA metilasyonu Gen ifadesinin düzenlenmesinde başta olmak üzere çok sayıda süreçlerde bir rol oynayan bir kapsamlı okudu epigenetik işaretidir. Memeli genleri içinde DNA metilasyonu öncelikle deoxycytidines, CG dinucleotides (ya da KSY) üzerinde çoğunlukla pirimidin halka 5 konumunu oluşuyor. Sitozin metilasyonu tüm CpG % 70'i somatik hücreler ve hesapları için toplam % ~ 1 genomu DNA4üsleri bulunur. DNA methylations da EBM, CpT ve TBM gibi sigara CpG bağlamlarda tarif edilmiştir ve embriyonik kök hücre5,6,7tüm metillenmiş cytosines % 25'e kadar değerler ile nükleer DNA çeşitli miktarlarda bulunmaktadır.
Sitozin metilasyonu nükleer genom kopyası yaygın olarak kabul ederken, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyonu varlığını hala tartışmalıdır. İlk çalışma araştıran mtDNA metilasyonu nerede mtDNA metilasyonu kolayca tespit edildi, kültürlü hücrelerde nükleer DNA8' e göre daha alt düzeylerde rağmen gerçekleştirildi. İnsan ve fare hücrelerinde mtDNA metilasyonu de düşük düzeyde (% 2-5) tespit edilmiştir. 5 metilsitozin yakalama tarafından kantitatif PCR takip metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) gibi güvenerek deneyleri kullanarak, mtDNA metilasyonu ayrıca çeşitli fare ve insan algılandı ve çizgiler9,10, hücre 11,12. 5-metilsitozin ELISA tahlil veya kütle spektrometresi karşı antikor kullanarak, DNA metilasyonu önemli düzeyde saf mitokondriyal kesirler13,14,15, tespit edildi 16. ancak, yukarıda belirtilen çalışmalar deneyleri tek Bankası çözünürlükte DNA metilasyon mutlak miktar sağlamak için tasarlanmamıştır teknikleri kullanılır.
Nicel ve resolutive DNA metilasyonu Analizi urasil tek iplikçikli DNA bağlam17 bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır "bisülfit sıralama", adlı bir teknik elde edilebilir . Bisülfit sıralama kullanarak, bir takımyıldızı yönünde çalışmaların sitozin metilasyonu çeşitli düzeylerde varlığı tespit etti. D-loop bölgesi, 12'leri veya 16S bölge metilasyonu mtDNA kolayca insan18,19,20,21,22,23 ve fare24 ' te algılandı doku ve hücreler, ancak, ilginç bir değişkenliği çalışmalar genelinde toplam cytosines % 1-20'si ile.
Bu çok sayıda çalışmalar ile karşılaştırıldığında sadece birkaç çalışmalar bizim gruptan da dahil olmak üzere, mtDNA metilasyonu3,25,26,27 varlığı tartışmalı veya biyolojik alaka sorguladı mtDNA düzeyleri (% 2) aşağıda28çok az düzeyde. Son zamanlarda, biz bütün mitokondrial bisülfit sıralama3potansiyel bir bisülfit-sıralama artifakı gözlenmesi bildirdi. Biz böylece metilasyonu düzeyleri overestimating mitokondrial DNA'ın ikincil yapısı bisülfit sıralama, yanlış pozitif neden olabilir kanıt sağladı. Biz burada bir obje bisülfit-dönüşüm mtDNA önlemek için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı bir basit enzimatik sindirim DNA'ın mtDNA ikincil yapılar bozmaya ve bisülfit sıralama protokol sonrası bisülfit tam erişime izin kullanır. Buna ek olarak, biz bisülfit sıralama analizi için bir eşlik eden bioinformatic boru hattı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Miktar DNA metilasyon kullanan glikozilasyonu sonunda, bir tek iplikçikli DNA bağlamda bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır bisülfit sıralama elde edilebilir. Bisülfit sıralama olabilir (PCR kullanarak) hedef veya tüm genom üzerinde gerçekleştirilen ve sitozin metilasyonu tek Bankası çözünürlükte mutlak miktar sağlar. Nükleer ve mitokondrial DNA, farklı doğası özellikle ikincil yapısında göz önüne alındığında, adaptasyonlar bisülfit sıralama yöntemleri için mtDNA sitozin metilasyonu soruşturma yapılması gerekir. MtDNA ikincil ve üçüncül yapısı gerçekten yanlış-mutlak bisülfit tek iplikçikli DNA'için tamamlanmamış denatürasyon zavallı erişim nedeniyle önde gelen eserler sıralama bisülfit yol açabilir. Burada, DNA'ın bir enzimatik sindirim BamHI bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile doğru miktar sitozin metilasyonu seviyelerinde mtDNA izin vermek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Buna ek olarak, biz yönergeleri bisülfit sıralama astar için mtDNA belirli tasarlamak için istenmeyen nükleer mitokondrial bölümlerini hedeflemek önlemek için (NUMTs) nükleer genom eklenmiş.

Bu protokol iki adımda mtDNA metilasyonu soruşturma zaman önemlidir. 1) 2) mitokondriyal DNA özgü astar tasarım ve ikincil yapı açılmasına.
İnsan genomik DNA Restriksiyon enzimi BamHI (Şekil 1) ile sindirerek, mitokondriyal DNA yapısı nükleotit konumda 14,258 kesilir ve ikincil yapı açılacak.
Bisülfit dönüşüm bir boz...

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation at JoVE.com

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...