Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

ونحن نشكر دودسون Anne وستيفاني هاينريش لإسداء المشورة بشأن كيفية تحسين بروتوكول سمفيش، دارزاكق كزافييه للمساعدة في تحليل منهاج العمل، هوانغ هاي لاقتراحات بشأن التحليل الإحصائي. هذا العمل كان تدعمها الأموال من مارس الدايمات (5-FY15-99) والخيرية بيو (00027344)، مؤسسة أبحاث السرطان رونين ديمون (35-15) وغلين مؤسسة EÜ، وجبهة الخلاص الوطني الدراسات العليا البحوث زمالة منحة رقم 1106400 تأيين لجيمي كارتر.

ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. يتم سرد معلومات المورد الكواشف في الجدول للمواد.
يوم 1/1-2 يوم:
ملاحظة: للثقافة الخضري، تنمو خلايا ل التطوير التنظيمي600 من 0.4 إلى 0.6 في متوسط مفضل. للثقافة، وهو يحفز الخلايا على الخضوع للانقسام باستخدام أسلوب مفضل (استزراع عادة في التطوير التنظيمي600 من 1.85).
1-عينة من التثبيت والهضم
<ol><li>إصلاح ما مجموعة ~3.5 OD600 من الخلايا في 3% فورمالدهايد.<ol>
<li>لثقافة الخضري، إضافة مل 5.52 الثقافة إلى 480 ميليلتر من 37% فورمالدهيد في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.</li>
		<li>للثقافة، وهو إضافة 1840 ميليلتر للثقافة إلى 160 ميليلتر من 37% فورمالدهيد في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل. عكس 5 مرات ~ إلى المزيج. تنبيه: فورمالدهايد السامة. التعامل معها والتصرف فيها وفقا للوائح المؤسسية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>وضع أنابيب على طبل اسطوانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. للعينات هو، بعد تحديد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، مواصلة إصلاح بين عشية وضحاها في 4 ˚C، بالتناوب. ملاحظة: التثبيت بين عشية وضحاها يزيد من إمكانية تكرار نتائج ونوعية البيانات سمفيش التي تم الحصول عليها للعينات هو. وينبغي أن يكون الأمثل وقت التثبيت.</li>
	<li>بينما يتم تحديد العينات، ذوبان الجليد 200 ملم فاناديل ريبونوكليوسيدي المجمعات (فكتوريا) في 65 ˚C لمدة 10 دقيقة على الأقل.</li>
	<li>إعداد مزيج الهضم الرئيسي في أنبوب 15 مل: للعينة 1، مزيج ميليلتر 425 من "المخزن المؤقت ب" مع ميليلتر 40 مم 200 فكتوريا (استعد 65 ˚C)؛ لعينات 5، يخلط 2125 ميليلتر من "المخزن المؤقت ب" 200 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C). دوامة ~ 5 s ريسوسبيند في فكتوريا تماما قبل إضافة إلى مزيج الرئيسي، الذي سوف يظهر الضوء الأخضر البنى بعد إضافة فكتوريا. ملاحظة: يحسن إضافة فكتوريا خلال الهضم اتساق النتائج سمفيش، ويحتمل أن تكون عن طريق تثبيط الملوث نوكلاس عرضته الخليط زيمولياسي، الذي هو تنقيته من استخراج النفط الخام. ينبغي أن يكون الأمثل مقدار فكتوريا المطلوب في هذه الخطوة.</li>
	<li>لعينات الخضري، الطرد المركزي هذه الأنابيب في x ~ 1057 ز لمدة 3 دقائق. للحصول على عينات هو (بعد التثبيت بين عشية وضحاها)، الطرد المركزي في 21,000 ز x 1.5 دقيقة صب أو نضح المادة طافية للنفايات فورمالدهايد. ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب" بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو عكس الأنابيب والتحريك إلى المزيج. نقل عينات الخضري لأنابيب 2 مل بعد استثارة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي في 21,000 س ز للحد الأدنى 1.5 إزالة الجزء الأكبر السائل بالشفط بالتخلية أو بيبيتينج، تاركة وراءها ~ 100 ميليلتر.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب"</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي في 21,000 س ز للحد الأدنى 1.5 إزالة الجزء الأكبر السائل بالشفط بالتخلية أو بيبيتينج، تاركة وراءها ~ 100 ميليلتر.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من البرد "المخزن المؤقت ب أجهزة الطرد المركزي" في 21,000 س ز لمقدار 1.5 Aspirate السائل تماما بفراغ أو بواسطة بيبيتينج.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا في 425 ميليلتر من مزيج الرئيسي الهضم، وإيجاز دوامة ريسوسبيند. إضافة 5 ميليلتر من 100T 10 ملغ/مل زيمولياسي لكل أنبوبة. ملاحظة: دوامة زيمولياسي في كل مرة من قبل إضافة إلى الأنابيب. إضافة زيمولياسي إلى كل أنبوب على حدة، بدلاً من إضافة إلى مزيج الرئيسي. كل الخطوات المساعدة في الحفاظ على اتساق الهضم بين أنابيب لأن رواسب زيمولياسي بسرعة.</li>
	<li>دوامة 2-3 s المزيج. وضع الأنابيب على طبل اسطوانة، وهضم في ˚C 30 لمدة 15-30 دقيقة. للخلايا النباتية والمراحل المبكرة هو، عادة ما يستغرق ~ 15 دقيقة، وهو الطور الأول وهو الشعب، وعادة ما يستغرق ~ 30 دقيقة. ملاحظة: التحقق في المجهر كل 5 دقائق بعد 15 دقيقة، ووقف عملية الهضم عندما تظهر ~ 80% خلايا غير الشفافة وغير الانكسار. من هذه النقطة، خلايا هشة جداً. التعامل مع الخلايا بلطف وتجنب استخدام الشفط بالتخلية أو فورتيكسينج-
</li>
	<li>الطرد المركزي هذه الأنابيب في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة السائل تماما من بيبيتينج.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من "المخزن المؤقت ب" بلطف من بيبيتينج 1-2 مرات صعودا ونزولاً إلى المزيج.</li>
	<li>الطرد المركزي هذه الأنابيب في ز x ~ 376 للحد الأدنى 3 سائل "إزالة المخزن المؤقت ب" من بيبيتينج. بلطف ريسوسبيند الخلايا في 1 مل إيثانول 70% (المخفف بالماء رناسي خالية).</li>
	<li>احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3.5-4 ساعات.</li>
</ol>2-التهجين
<ol><li>جلب ميثلامين إلى درجة حرارة الغرفة (قاسمة 50 مل، فإنه يأخذ ~ 30 دقيقة في حوض ماء). ملاحظة: لا تفتح زجاجة ميثلامين حتى الزجاجة يصل إلى درجة حرارة الغرفة لتجنب أكسدة ميثلامين. تنبيه: ميثلامين السامة. التعامل معها والتصرف فيها وفقا للوائح المؤسسية.</li>
	<li>إعداد 10% ميثلامين أغسل المخزن المؤقت في أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
	<li>الطرد المركزي هذه الأنابيب في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة 500 ميليلتر من الإيثانول 70% من بيبيتينج. بلطف بيبيت صعودا ونزولاً ريسوسبيند الخلايا المتبقية، ومن ثم نقل الخلايا إلى أنابيب التصاق منخفضة. ملاحظة: استخدام أنابيب التصاق منخفضة إلى حد كبير يقلل من فقدان الخلية أثناء يغسل اللاحقة.</li>
	<li>الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في ز x ~ 376 للحد الأدنى 3 إزالة جميع الإيثانول واسطة بيبيتينج.</li>
	<li>أضف 1 مل 10% ميثلامين أغسل المخزن المؤقت، ولطف بيبيت صعودا وهبوطاً 2-3 مرات على ريسوسبيند الخلايا.</li>
	<li>السماح للخلايا للجلوس في درجة حرارة الغرفة ل ~ 20 دقيقة أثناء إعداد "الحل التهجين". لنموذج 1، مزيج 50 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" (غرفة temp.) و 5 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C) 1 ميليلتر من كل مسبار (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي). لعينات 5، مزيج 250 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" (غرفة temp.) و 25 ميليلتر من 200 ملم فكتوريا (استعد 65 ˚C) 5 ميليلتر من كل مسبار (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي).<ol>
<li>ذوبان الجليد "التهجين المخزن المؤقت" (المجمدة في ˚C-20) إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح أنبوب لمنع أكسدة ميثلامين.</li>
		<li>بعد إضافة 200 ملم من فكتوريا، دوامة ل 5-10 s قبل إضافة التحقيقات، التي صممت وشراؤها تجارياً، وأعيد تشكيلها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>إذا اشتركت المحتضنة المسابير اثنين، أضف 1 ميليلتر من 01:10 إضعاف المخزون مسبار #1، فضلا عن 1 ميليلتر من 01:10 إضعاف المخزون مسبار #2، جعل إضعاف نهائي ~ 1: 500 للتحقيق أما. التركيز اللازم لاحتياجات أفضل الإشارات إلى الضجيج نسبة لتكون الأمثل (انظر مناقشة للحصول على التفاصيل).</li>
	</ol>
</li>
	<li>الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية في النفايات الخطرة التي بيبيتينج.</li>
	<li>إضافة على الأقل 50 ميليلتر من "التهجين الحل" لكل أنبوبة. نفض الغبار الأنابيب المزيج.</li>
	<li>تبني في 30 ˚C على طبل اسطوانة لمدة 16 ساعة على الأقل في الظلام.</li>
</ol>يوم 2/يوم 3
3-الغسيل والتصوير
<ol><li>جلب ميثلامين إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد 10% ميثلامين غسل العازلة (FWB) في أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
	<li>إزالة الأنابيب من طبل الاسطوانة ووضعها في مربع المغطاة بإحباط لحماية من الضوء.</li>
	<li>الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية في النفايات الخطرة التي بيبيتينج.</li>
	<li>ريسوسبيند في 1 مل 10% FWB بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.</li>
	<li>تبني في 30 ˚C مدة 30 دقيقة (غير الدورية) في المربع المغطاة بإحباط.</li>
	<li>الطرد المركزي هذه العينات في ز x ~ 376 لإزالة الحد الأدنى 3 المادة طافية للنفايات الخطرة عن طريق بيبيتينج واترك ~ 50 ميليلتر.</li>
	<li>ومن ناحية أخرى، تعد DAPI/FWB في أنبوب مخروطي 15 مل: للعينة 1، مزيج 1000 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ميثلامين 10% مع 1 ميليلتر من 5 ملغ/مل DAPI. 10 عينات، مزيج من 10 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ميثلامين 10% مع 10 ميليلتر من 5 ملغ/مل DAPI. ريسوسبيند في 1 مل من DAPI/FWB بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.</li>
	<li>تبني في 30 ˚C مدة 30 دقيقة (غير الدورية) في المربع المغطاة بإحباط.</li>
	<li>ذوبان الجليد الكواشف مكافحة التبييض على الجليد.</li>
	<li>الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية تماما من بيبيتينج. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة كل من المادة طافية.</li>
	<li>للعينات التي لم يتم تصويرها فورا، ريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر من "المخزن المؤقت جلو" دون الإنزيمات. بيبيت صعودا وهبوطاً 3-4 مرات لخلط.<ol>
<li>إبقاء جميع العينات أونيماجيد في المربع المغطاة بإحباط في 4 ˚C حتى جاهزة للصورة. عندما تكون جاهزاً الصورة، الطرد المركزي العينات في ~ 376 س ز لمدة 2 دقيقة وإزالة المادة طافية تماما من بيبيتينج. ريسوسبيند في جلو مع الإنزيمات على النحو المبين أدناه.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لعينات يجري تصويرها على الفور، إضافة 15-20 ميليلتر من المخزن المؤقت جلو مع الإنزيمات. بلطف بيبيت صعودا ونزولاً المزيج. ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم تضاف تبعاً لحجم الخلية بيليه. نوصي ريسوسبيندينج بيليه في 15 ميليلتر جلوكس المخزن المؤقت مع الإنزيمات والتحقق من كثافة الخلية في المجهر. إذا كانت الخلايا كثيفة جداً (الخلايا التثاقل فوق بعضها البعض)، إضافة المخزن المؤقت جلو إضافي مع الإنزيمات. إذا كانت الخلايا ضئيلة جداً، الطرد المركزي العينة وإزالة ~ 5 ميليلتر من المخزن المؤقت.</li>
	<li>بيبيت 5 ميليلتر على ساترة (18 ملم × 18 مم، رقم 1)، ووضعت ساترة على شريحة.</li>
	<li>وضع مسح مختبر على رأس الشريحة حيث يوضع ساترة. اضغط برفق على مسح مختبر لمجموعة الشرائح (يجب أن تشاهد السائل نزوله من كافة الحواف الأربع ساترة).</li>
	<li>نقل الشريحة إلى غرفة المجهر في مربع تغطيها رقائق الألومنيوم.</li>
	<li>صورة باستخدام مجهر الأسفار واسع المجال مع تضخم عالية (60-100 س) وفتحه رقمية عالية. ملاحظة: لجمع أقصى عدد الفوتونات المنبعثة من المسابر سمفيش، مجاهر [كنفوكل] لا ينصح، كما أنها تحد بشكل كبير من كمية الضوء التي سيتم جمعها. هنا، تم جمع البيانات على مجهر مجهزة 100 X، 1.4 نا الهدف، باستخدام مرشحات CY5 (EX632/22، EM679/34) تصويرها في 1.3 ق، 100% T؛ تريتك (EX542/27، EM597/45)، 1.3 ثانية، 100% T؛ و DAPI (EX390/18، EM435/48)، 0.05-0.1 s، ت 32-50%. وينبغي أيضا الحصول على صورة مشرقة حقل مرجع. الحصول على شرائح 15-25 مع حجم خطوة من 0.1-0.2 ميكرومتر، من تماما دون التركيز في مجال الرؤية لما سبق تماما، للتأكد من أن جميع البقع الحمض النووي الريبي تحتسب.</li>
</ol>4. تحليل الصورة
<ol><li>تحليل البيانات سمفيش مع أدوات التحليل سمفيش المنشورة مثل السمك-كوانت17 وستارسيارتش2، أو مع برامج مصنوعة خصيصا، تبعاً للاحتياجات الدقيقة للتجربة. ملاحظة: خط أنابيب تحليل جيد وينبغي السماح للمستخدمين بتحديد عتبة لفصل بقع الحمض النووي الريبي الحقيقية من الخلفية، وإخراج إحصائيات مثل إحداثيات X و Y و Z (اختياري) وكثافة كل نقطة، عدد النقاط في كل خلية ، وربما من المناسب معلمات كوسيلة لتصفية المكتشفة كاذبة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

بروتوكول المعروضة هنا مشتقة من الأخرى سمفيش نشرت البروتوكولات2،3،21،،من2223، وهو على وجه التحديد الأمثل لخلفية سلالة الخميرة SK1. وشملت المعلمات الأمثل عدد الخلايا، ومدة التثبيت، سرعة الطرد المركزي ومدة، ومدة الهضم، الهضم المخزن المؤقت، تركيز التحقيق، والتهجين المخزن المؤقت. كانت ليست الأمثل المعلمات الأخرى مثل درجة الحرارة التهجين ومدتها. في هذا القسم، ونحن نشاطر بعض الملاحظات التي تساعد على التكيف مع هذا البروتوكول لأي خلفية سلالة الخميرة وشروط النمو للفائدة.
جدار خلية الخميرة مهدها هو أحد التحديات الكبرى ضد الحصول على صور عالية الجودة سمفيش في مهدها الخميرة للخلية جدار يمنع اختراق التحقيق. الهضم غير مكتملة للجدار خلية زيمولياسي يؤدي إلى التهجين غير فعالة من تحقيقات وارتفاع خلية إلى تقلب في إشارة. غير أن الهضم الإفراط يمكن جعل الخلايا هشة جداً، المؤدية إلى كبير الخلية الخسارة خلال خطوات الغسيل والخلية في انفجار أثناء إعداد الشرائح للتصوير. ومن ثم، تحسين مدة الهضم أمر حاسم. نوصي بإجراء تجربة رائدة سمفيش بهضم نفس العينة لكميات مختلفة من الوقت. وفي حالتنا، حصلنا على البيانات سمفيش أفضل إذا توقفنا في الهضم عندما أصبح ~ 80% خلايا غير الانكسار. عادة، يمكن هضمها سلالات متحولة وراثية مختلفة لنفس الشرط النمو، مع توقيت مماثلة. ومع ذلك، تختلف مدة الهضم عند المقارنة بين ظروف نمو مختلفة ومراحل مختلفة من الانقسام في مهدها الخميرة. حالما يتم تحديد التوقيت، نوعية سمفيش استنساخه. ملاحظة للحصول على سلالات متحولة مع توليف جدار الخلية المعيبة و/أو تكوين، قد يتسنى إكمال الهضم في أقل من 15 دقيقة استخدام مجموعات مختلفة من زيمولياسي قد أيضا قليلاً تغيير توقيت الهضم.
مطلوب تركيز التحقيق الأمثل لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. نحن تصميم وشراء لدينا تحقيقات سمفيش تجارياً. يجب أن يكون جيد المسابر (غالباً 20-الصرف) نسبة مئوية من GC تتراوح بين 35 في المائة إلى 45 في المائة، الحد أدنى لتباعد 2 قاعدة أزواج بين المجسات ومنخفض ه. كنا مسبار المستندة إلى ويب مصمم من الشركة المصنعة لإنشاء قائمة تحقيقات، وإذا كانت هناك تحقيقات كافية للاختيار من بينها، سوف نستخدم الخوارزمية الانفجار في قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces إلى القضاء التحقيقات مع أكثر من 17 زوج قاعدي يتداخل مع المناطق الأخرى الجينوم. اخترنا أكثر فوتوستابل نيون صبغ (CAL فلور 590) لمجموعة التحقيق التي أنيالس إلى منطقة فريدة من نوعها في NDC80لوتي (CF 590) لأن في هذه المجموعة، كان أقل من عدد المجسات التي تستوفي جميع المعايير المذكورة أعلاه (20 المسابير) الحد الأدنى الذي أوصت به الشركة المصنعة (المسابر ~ 25). بعد إعادة تشكيل الحل مسبار اتباع إرشادات الشركة المصنعة، قدمنا 01:10 إضعاف الحل الأسهم وتخزينها في حل المخفف في مختبرين 5 ميليلتر في ˚C-20. واستخدمت كل قاسمة مرة واحدة فقط. للتحسين، واحدة ينبغي أن تجعل المسلسل تخفيف من 01:10 إضعاف الحل واختبار التركيز التي تعطي أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ونحن نوصي بجعل سلسلة تمييع 1: 250، 1: 500، 1: 1000، و 1:2000 من المخزون الأصلي. وفي حالتنا، أدى عامل تخفيف 1: 500 أفضل نسبة الإشارة إلى الضجيج، لمجموعات التحقيق كل CF 590 و 670 ف.
وقت التثبيت الأمثل أيضا أهمية حاسمة لنجاح سمفيش في مهدها الخميرة. نحن العثور على هذا التثبيت بين عشية وضحاها في 4 ˚C بدلاً من إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، تحسنت بشكل ملحوظ الاتساق والجودة من نتائج العينات هو سمفيش. على الرغم من أننا لم تختبر كيف بين عشية وضحاها قد تؤثر على التثبيت عينات الخضري، عملت التثبيت في درجة حرارة الغرفة جيدا لهذا الشرط النمو. وهكذا، على النحو الأمثل في بروتوكول سمفيش لسلالات جديدة أو ظروف النمو، نوصي بدءاً من وقت التثبيت قصيرة في درجة حرارة الغرفة وزيادة فترة التثبيت إذا تم مصادفة تقلب عالية لإشارة.
مقارنة مع أخرى البروتوكولات المنشورة3،،من2223، لدينا بروتوكول يستخدم مثبط رناسي فكتوريا خلال الهضم وأعلى تركيز لفكتوريا خلال التهجين. إضافة فكتوريا في هاتين الخطوتين تحسين اتساق النتائج سمفيش، وربما من الأفضل الحفاظ على جزيئات الحمض النووي الريبي ضد نوكلاس النشاط الذي يمكن الأخذ بمزيج زيمولياسي (الإنزيم هو تنقيته من مستخلصات النفط الخام وقد تحتوي على رناسي الملوثات). وبالتالي، نوصي باستخدام مبلغ فكتوريا كما وردت في البروتوكول أو تركيزات أعلى حتى من فكتوريا للتحسين.
يمكن أن يكون جزء كبير من الخلايا فقدت خلال خطوات الغسيل في "المخزن المؤقت ب" واغسل ميثلامين المخزن المؤقت. لتقليل الخسائر في الخلية، واحد يمكن أن تزيد من سرعة الطرد المركزي. وفي حالتنا، باستخدام سرعة عالية (21,000 س ز) إلى بيليه لدينا عينات خلال "ب المخزن المؤقت" يغسل فقدان الخلية انخفاضا كبيرا. ومع ذلك، تصبح الخلايا هشة للغاية بعد الهضم زيمولياسي، ولذلك لا يوصي بتغيير سرعة الطرد المركزي. بدلاً من ذلك، فإننا نقترح استخدام أنابيب التصاق منخفضة من "الولايات المتحدة الأمريكية العلمية"، التي تساعد إلى حد كبير بيليه الخلايا أثناء يغسل في المخزن المؤقت للغسيل ميثلامين. عموما، يمكن استمرار تولد لدينا بروتوكول أحادي الطبقة الكثيفة ما يكفي لتصوير كفاءة الخلايا. بشكل عام، ينبغي أن تسفر عن 7 الحقول لعرض > 130 الخلايا مناسبة للقياس الكمي.
وأخيراً، من المهم تحديد بارامترات الأمثل والنواتج المطلوبة من تحليل الصور. عادة للكشف عن بقع سمفيش، برامج تحليل المنشورة تصفية صور raw باستخدام نواة الضبابي لإزالة الإشارات الخلفية، وأطلب من المستخدمين لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء لاستخدام لكل مجموعة من الصور2،17. ولسوء الحظ، لا توجد حاليا معيار واحد الذي يتم تحديد المعلمات الصحيحة، وحتى بعض الاختبارات التجريبية لهذه الإعدادات المختلفة ضروري. لتعيين معلمات اللازمة لكل خطوة من هذه الخطوات، يحتاج المرء تكراري مجموعات مختلفة من معلمات الإدخال والتحقق من مدى يطابق النتائج التي تم الحصول عليها من كل مجموعة من العد اليدوي في بعض الخلايا الممثل. حالما يتم العثور على مجموعة واحدة من المعلمات، يمكن استخدامه بالنسبة للصور التي تم الحصول عليها على الرغم من ظروف النمو المختلفة والخلفيات الوراثية.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار واحد إذا كان الإسقاط كحد أقصى-كثافة الصور سمفيش يمكن أن يؤديها قبل القياس الكمي22. هذه الخطوة يبسط خوارزمية الكشف الموضعي، ويقلل كثيرا من وقت التصوير، ولو على حساب بعض المعلومات يمكن أن تكون مفيدة حول النقاط الفردية، مثل التعريب سوبسيلولار بهم. وفي حالتنا، كان عدد مرناً الجزيئات التي تنتجها الجينات NDC80 منخفضة بما يكفي أن البقع جيدا تم فصل بعد هذا التجهيز (ليس من غير المألوف للنصوص في مهدها الخميرة3،7). في الحالات التي يكون فيها تحليل كولوكاليزيشن الحرجة، يحتاج خط الأنابيب التحليل تحديد موقع كل بقعة سمفيش في كل قناة لتقييم كولوكاليزيشن. اعتماداً على الأسئلة المحددة التي يجري طلب، معلومات أخرى مثل الكثافة من كل بقعة قد تحتاج أيضا إلى أن تستخلص من خط الأنابيب لمزيد من التحليل. أمثلية المفتاح خطوات في البروتوكول وأنابيب تحليل الصورة أمر حاسم في الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش لدراسة مسألة الفائدة.

التنظيم الديناميكي للتعبير الجيني محركات تنمية الكائن حي، فضلا عن استجابتها للإجهاد البيئي، والعدوى، والتغيرات في التمثيل الغذائي. الدراسات التي تركز على تنظيم النسخي تعتمد على التكنولوجيات التي تقيس وفرة الجيش الملكي النيبالي. يتم استخدام أحد هذه الأساليب، ووصف الأسفار جزيء واحد في الموقع التهجين (سمفيش)، للكشف عن كل جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا المفردة1،2. هذا الأسلوب يتيح قياس التغير خلية إلى خلية في التعبير الجيني وتصميم تعريب الجيش الملكي النيبالي داخل الخلايا.
في الأسلوب سمفيش الأكثر استخداماً، يتطلب الكشف جزيء الحمض النووي الريبي الفردية المسابير الحمض النووي قصيرة متعددة (غالباً ~ 48 20-مير المسابير) التي تعتبر مكملة لهدف الجيش الملكي النيبالي وهي مترافق بصبغة الفلورسنت نفس. نتائج ملزمة للتحقيق الفلورسنت واحدة في إشارة ضعيفة، ولكن الإشارة من فرقة تحقيقات جميع قوية. هذه الميزة بتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير لأنه على الرغم من أن تحقيق واحد يمكن أن يحمل ملزم خارج الهدف، مثل هذه الإشارات من المتوقع أن تكون ضعيفة للغاية مقارنة بالهدف جزيء الحمض النووي الريبي3. ضمن خطأ الكشف، يمكن عد عدد جزيئات الحمض النووي الريبي والمقارنة عبر مختلف ظروف النمو وبين طفرات مختلفة.
منذ تطورها الأولى، تم تكييف سمفيش لدراسة الجوانب المختلفة للجينات التعبير4، مثل النسخ استطالة1،2،5،6، النسخي انفجار7 الربط , 8 , 9والتعبير الجينية داخل الخلايا10،،من1112، والجيش الملكي النيبالي التعريب13،،من1415. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لدراسة التعبير عن isoforms نسخة اثنين من الجينات نفسها، التي isoform محاضر جلسات قصيرة (NDC80ORF) قد التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة (NDC80لوتي )16. بشكل فريد isoforms مرناً اثنين، استخدمنا مسبار مجموعتين: مجموعة واحدة محددة لتسلسل فريد NDC80لوتي، ومجموعة أخرى، مترافق بصبغة الفلورسنت آخر، يربط منطقة مشتركة من isoforms اثنين. NDC80لوتي الجيش الملكي النيبالي هو تحديد كبقعة كولوكاليزيد مع كلا إشارات مضيئة، بينما NDC80ORF الجيش الملكي النيبالي هو الذي يحتوي على إشارة فقط من مجموعة التحقيق المشتركة. نظراً لأن عدد من NDC80ORF النصوص ويحسب باستخدام أسلوب "طرح"، كفاءة عالية من التهجين المسبار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية ضرورية لتحديد البقع سمفيش ثقة وتقليل الخطأ نشر.
وتصف هذه الورقة على بروتوكول أمثل لأداء سمفيش في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. في هذا البروتوكول وعدد الخلايا، ووقت التثبيت، وقت الهضم، والهضم المخزن المؤقت، وتركيز التحقيق والتهجين المخزن المؤقت المستخدم للتجارب سمفيش كانت الأمثل ل SK1 سلالة خلفية S. cerevisiae تمر الخضري النمو أو الانقسام. ومع ذلك، نلاحظ أيضا في هذه المخطوطة: (1) الطريقة التحقق من جودة البيانات سمفيش بعد الحصول على الصور، والخطوات (2) الواردة في البروتوكول التي قد تتطلب التحسين الإضافي للخلفيات سلالة مختلفة وظروف نمو.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

جزيء واحد الأسفار في الموقع التهجين (سمفيش) تقنية قوية لدراسة التعبير الجيني في الخلايا المفردة بسبب قدرتها على كشف والعد الفردي من جزيئات الحمض النووي الريبي. مكملة لأساليب العميق القائم على التسلسل، سمفيش يوفر معلومات حول خلية إلى الاختلاف في وفرة نسخة وإضفاء الطابع المحلي على سوبسيلولار الحمض النووي الريبي معين. في الآونة الأخيرة، استخدمنا سمفيش لدراسة التعبير عن الجين NDC80 أثناء الانقسام الاختزالي في مهدها الخميرة وفي أي محضر اثنين isoforms موجودة و isoform نسخة قصيرة له التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة. تحديد isoform محضر كل ثقة، الأمثل البروتوكولات المعروفة سمفيش وحصل على اتساق عالية ونوعية البيانات سمفيش للعينات التي اكتسبت خلال مهدها الخميرة الانقسام الاختزالي. هنا، يمكننا وصف هذا البروتوكول الأمثل، المعايير التي نستخدمها لتحديد ما إذا كان يتم الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش، وبعض النصائح لتنفيذ هذا البروتوكول في سلالات الخميرة وظروف النمو الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

هذه الأسفار جزيء واحد في الموقع بروتوكول التهجين هو الأمثل لتقدير عدد جزيئات الحمض النووي الريبي في مهدها الخميرة أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي.

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...