Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Vi takker Anne Dodson og Stephanie Heinrich for råd om, hvordan du optimerer smFISH protokol, Xavier Darzacq til hjælp med analyse platform, Haiyan Huang for forslag om den statistiske analyse. Dette arbejde blev støttet af midler fra March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) og Glenn Foundation til EÜ og et NSF Graduate Research Fellowship Grant. DGE-1106400 til JC.

Bemærk: Alle bufferne og de medier, der anvendes i denne protokol er angivet i tabel 1. Kreditoroplysninger til reagenserne, der er opført i Tabel af materialer.
Dag 1/dag 1-2:
Bemærk: For vegetativt kultur, dyrke celler til en OD600 på 0,4 til 0,6 i en foretrukne medie. Meiotiske kultur, fremkalde celler til at gennemgå meiosen ved hjælp af en foretrukne metode (typisk dyrkning i en OD600 af 1,85).
1. prøve fiksering og fordøjelse
<ol><li>Lave en total ~3.5 OD600 af celler i 3% formaldehyd.<ol>
<li>For vegetativt kultur, der tilsættes 5.52 mL kultur til 480 µL af 37% formaldehyd i 15 mL konisk rør.</li>
		<li>Meiotiske kultur, tilføje 1840 µL af kultur til 160 µL af 37% formaldehyd i 2-mL microcentrifuge rør. Invertere ~ 5 gange til mix. Forsigtig: Formaldehyd er giftige. Håndtere og bortskaffe ifølge institutionelle bestemmelser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sted rør på et roller tromle ved stuetemperatur i 20 min. For meiotiske prøver, efter fastsættelse ved stuetemperatur i 20 min., fortsætte fastsættelse natten over ved 4 ˚C, roterende. Bemærk: Den natten fiksering øger reproducerbarhed og kvaliteten af de smFISH data indhentet for meiotiske prøver. Fiksering tid skal optimeres.</li>
	<li>Mens prøverne er fastsættelse, tø 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplekser (VRC) på 65 ˚C i mindst 10 min.</li>
	<li>Forbereder fordøjelsen master mix i en 15 mL tube: for 1 prøve, bland 425 µL af Buffer B med 40 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C); for 5 prøver, bland 2125 µL af Buffer B med 200 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C). Vortex ~ 5 s til fuldt resuspend VRC før du tilføjer til master mix, som vises lys brunlig grønne efter VRC tilsætning. Bemærk: Tilsætning af VRC under fordøjelsen forbedrer sammenhængen i smFISH resultat, potentielt ved at hæmme det nukleasen forurenende stof, der er indført af zymolyase blanding, som er renset fra rå ekstrakt. Mængden af VRC påkrævet på dette trin skal optimeres.</li>
	<li>Vegetative samples, centrifugeres rør ved ~ 1057 x g i 3 min. Meiotiske prøver (efter natten fiksering), centrifugeres ved 21.000 x g for 1,5 min. Decant eller Aspirér supernatanten til formaldehyd affald. Bemærk: Alle centrifugering trin udføres ved stuetemperatur.</li>
	<li>Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B ved pipettering op og ned eller ved invertering af rør og bladre til at blande. Overføre vegetativ prøver 2-mL-rør efter resuspension.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 21.000 x g i 1,5 min. fjerne hovedparten af væsken ved vakuum aspiration eller ved pipettering, efterlod ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 21.000 x g i 1,5 min. fjerne hovedparten af væsken ved vakuum aspiration eller ved pipettering, efterlod ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B. Centrifuge på 21.000 x g for 1,5 min. aspirat væske helt af vakuum eller pipettering.</li>
	<li>Resuspend celler i 425 µL af fordøjelsen master mix, og kortvarigt vortex til resuspend. Tilføj 5 µL af 100T 10 mg/mL zymolyase til hvert rør. Bemærk: Vortex zymolyase hver gang før du tilføjer til rør. Føje zymolyase til hver tube individuelt, i stedet for at tilføje til master mix. Begge trin bidrage til at bevare fordøjelsen overensstemmelse mellem rørene fordi zymolyase udfældes hurtigt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s at blande. Sted rør på et roller tromle, og fordøje ved 30 ˚C til 15-30 min. Vegetative celler og meiotiske vorden, det tager normalt ~ 15 min og meiotiske prophase og meiotiske divisioner, det tager normalt ~ 30 min. Bemærk: Kontroller på mikroskopet hvert 5 min efter 15 min, og stopper fordøjelsen, når ~ 80% af celler vises ikke-transparente og ikke-refraktiv. Fra dette punkt på, celler er meget skrøbelige. Håndtere celler blidt og undgå at bruge vakuum aspiration eller vortexing.
</li>
	<li>Centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern væsken helt af pipettering.</li>
	<li>Forsigtigt resuspend celler med 1 mL Buffer B af pipettering op og ned 1 - 2 gange til mix.</li>
	<li>Der centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern Buffer B væske af pipettering. Forsigtigt resuspend celler i 1 mL af 70% ethanol (fortyndet med RNase-fri vand).</li>
	<li>Inkuber ved stuetemperatur i 3.5-4 timer.</li>
</ol>2. hybridisering
<ol><li>Bringe formamid til stuetemperatur (for 50 mL prøve, det tager ~ 30 min i vandbad). Bemærk: Må ikke åbne formamid flaske, indtil flasken når stuetemperatur for at undgå oxidation af formamid. Forsigtig: Formamid er giftigt. Håndtere og bortskaffe ifølge institutionelle bestemmelser.</li>
	<li>Forberede 10% formamid wash buffer i en 15 mL konisk slange.</li>
	<li>Der centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern 500 µL af 70% ethanol af pipettering. Forsigtigt afpipetteres op og ned til resuspend de resterende celler, og derefter overføre cellerne til lav friktion rør. Bemærk: Ved hjælp af lav friktion rør kraftigt reducerer celletab under efterfølgende vasker.</li>
	<li>Centrifugeres rør igen ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern alle ethanol af pipettering.</li>
	<li>Tilsættes 1 mL 10% formamid wash buffer, og forsigtigt afpipetteres op og ned 2 - 3 gange at resuspend cellerne.</li>
	<li>Tillad cellerne til at sidde ved stuetemperatur for ~ 20 min mens de forbereder hybridisering løsning. 1 prøve, Bland 50 µL af hybridisering Buffer (værelse temp.), 5 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C) og 1 µL af hver probe (200 nM finalen). For 5 prøver, bland 250 µL af hybridisering Buffer (værelse temp.), 25 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C) og 5 µL af hver probe (200 nM finalen).<ol>
<li>Tø hybridisering Buffer (frosne på-20 ˚C) til stuetemperatur før åbning af røret for at forhindre formamid oxidation.</li>
		<li>Efter tilføjer 200 mM VRC, vortex for 5-10 Sørensen før tilføjer sonder, som er designet og købt kommercielt, og rekonstitueres efter producentens anvisninger.</li>
		<li>Hvis to sonder Co rugede, tilføje 1 µL 1:10 fortynding af sonden #1 stock, samt 1 µL 1:10 fortynding af sonden #2 lager, til at gøre en endelige fortynding af ~ 1: 500 for enten sonde. Koncentration behov for bedste signal / støj-forhold skal være optimeret (Se diskussion for detaljer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering.</li>
	<li>Tilføj mindst 50 µL af hybridisering løsning til hvert rør. Svirp rør til at blande.</li>
	<li>Der inkuberes ved 30 ˚C på en roller tromle i mindst 16 timer i mørke.</li>
</ol>Dag 2/3
3. vask og billedbehandling
<ol><li>Bringe formamid til stuetemperatur.</li>
	<li>Forberede 10% formamid wash buffer (FWB) i en 15 mL konisk slange.</li>
	<li>Fjerne rør fra roller tromle og placere dem i en folie-dækket for at beskytte mod lys.</li>
	<li>Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering.</li>
	<li>Resuspend i 1 mL 10% FWB af pipettering forsigtigt op og ned 2 - 3 gange.</li>
	<li>Der inkuberes ved 30 ˚C til 30 min (ikke roterende) i boksen folie-dækket.</li>
	<li>Der centrifugeres prøver på ~ 376 x g til 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering, og forlade ~ 50 µL.</li>
	<li>I mellemtiden forbereder DAPI/FWB i en 15 mL konisk slange: For 1 prøve, bland 1000 µL af 10% formamid wash buffer med 1 µL af 5 mg/mL DAPI. For 10 prøver, 10 mL 10% formamid vaskebuffer blandes med 10 µL af 5 mg/mL DAPI. Resuspend i 1 mL DAPI/FWB af pipettering forsigtigt op og ned 2 - 3 gange.</li>
	<li>Der inkuberes ved 30 ˚C til 30 min (ikke roterende) i boksen folie-dækket.</li>
	<li>Tø anti-blegemiddel reagenser på is.</li>
	<li>Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten helt af pipettering. Hvis det er nødvendigt, centrifugeres igen for at fjerne alle supernatant.</li>
	<li>Hold resuspenderes i 50 µL af GLOX Buffer uden enzymer for prøver, der ikke er afbildet straks. Med pipette overfoeres op og ned 3 - 4 gange at blande.<ol>
<li>Holde alle de unimaged prøver i boksen folie-dækket på 4 ˚C indtil klar til afbildning. Når du er klar til billede, centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 2 min og Fjern supernatanten helt af pipettering. Resuspend i GLOX med enzymer som nedenfor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For prøver at blive afbildet straks, tilføje 15-20 µL af GLOX buffer med enzymer. Forsigtigt afpipetteres op og ned at blande. Bemærk: Lydstyrken tilføjet kan variere afhængigt af størrelsen på den celle pellet. Vi anbefaler resuspending pellet i 15 µL af GLOX buffer med enzymer og kontrollere celle tæthed på mikroskopet. Hvis celler er også tætte (celler sammenklumpning oven på hinanden), tilføjer ekstra GLOX buffer med enzymer. Hvis celler er alt for sparsomme, centrifugeres prøven og fjerne ~ 5 µL af buffer.</li>
	<li>Med pipette overfoeres 5 µL ind på en coverslip (18 mm x 18 mm, nr. 1), og læg coverslip på et dias.</li>
	<li>Sætte en laboratorium tørre oven på diaset, hvor coverslip er placeret. Tryk forsigtigt på laboratoriet tør at sætte dias (bør se flydende kommer fra alle fire kanter af coverslip).</li>
	<li>Overføre diaset til mikroskop værelse i en boks, der er omfattet af aluminiumsfolie.</li>
	<li>Billedet ved hjælp af wide-felt fluorescens mikroskop med høj forstørrelse (60-100 X) og høj numerisk blænde. Bemærk: For at indsamle det maksimale antal fotoner, der udsendes af smFISH sonder, Konfokal mikroskoper er ikke anbefales, da de i betydelig grad begrænse mængden af lys der skal indsamles. Her, de indsamles på et mikroskop udstyret med en 100 X, 1.4 NA mål, ved hjælp af filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) afbildet på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; og DAPI (EX390/18 EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% T. En lysfelt referenceafbildning bør også erhverves. Erhverve 15-25 skiver med et trin størrelse på 0,1-0,2 µm, fra helt under fokus for synsfelt helt ovenfor, for at sikre, at alle af RNA steder er tegnede sig for.</li>
</ol>4. billedanalyse
<ol><li>Analysere smFISH data med publicerede smFISH analyseværktøjer såsom fisk-quant17 og StarSearch2eller med skræddersyede programmer, afhængigt af de nøjagtige krav af eksperimentet. Bemærk: En god analyse rørledningen bør tillade brugere at bestemme en tærskel til at adskille de sande RNA steder fra baggrunden, og output statistikker som X, Y og Z (valgfri) koordinater og intensitet af hver plet, antallet af Steder i hver celle , og eventuelt passende parametre som en måde at bortfiltrere falsk opdagelse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Protokollen præsenteres her er afledt af andre udgivne smFISH protokoller2,3,21,22,23, og er specielt optimeret til gær stamme baggrund SK1. Parametrene optimeret inkluderet celle nummer, fiksering varighed, centrifugering hastighed og varighed, fordøjelsen varighed, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer. Andre parametre såsom hybridisering temperatur og varighed var ikke optimeret. I dette afsnit deler vi et par noter, der ville hjælpe med at tilpasse denne protokol til enhver gær stamme baggrund og interesse vækstbetingelser.
Cellevæggen af spirende gær er en stor udfordring mod at opnå høj kvalitet smFISH billeder i spirende gær, fordi cellevæggen forhindrer sonde penetration. Ufuldstændig fordøjelse af cellevæggen af zymolyase fører til ineffektive hybridisering af sonder og høj celle til celle variabilitet i signal. Men over fordøjelsen kan gøre celler for skrøbelige, fører til betydelige celle tab under vask trin og celle brister under dias forberedelse til billedbehandling. Således er optimere fordøjelsen varighed afgørende. Vi anbefaler, at gennemføre en pilot smFISH eksperiment ved at fordøje den samme prøve for forskellige mængder af tid. I vores tilfælde opnået vi de bedste smFISH data hvis vi stoppede fordøjelsen når ~ 80% af celler blev ikke-brydningsindeks. Typisk, for den samme vækst betingelse, forskellige genetiske mutantstammen kan fordøjes med lignende timing. Varigheden af fordøjelsen adskiller sig dog sammenlignet blandt forskellige vækstbetingelser og forskellige stadier af meiose i spirende gær. Når timingen er fastslået, er at kvaliteten af smFISH reproducerbare. Bemærk kan at for mutantstammen med defekte cellevæg syntese og/eller sammensætning, fordøjelsen kan udfyldes på mindre end 15 min. brug af forskellige batches af zymolyase også lidt ændre fordøjelsen timing.
Optimal sonde koncentration er nødvendig for at opnå et højt signal / støj-forhold. Vi designet og købt vores smFISH sonder kommercielt. God sonder (ofte 20-mers) bør have en procentdel af GC spænder fra 35% til 45%, en minimumafstand af 2 basepar mellem sonder og lav krydsreaktivitet. Vi brugte en web-baseret sonde designer fra producenten til at generere en liste af sonder, og hvis der var nok sonder at vælge imellem, vi ville bruge BLAST algoritme i Saccharomyces genom Database hen til eliminere sonderne med mere end 17 basepar overlappede med andre genomisk regioner. Vi valgte den mere photostable fluorescerende farvestof (CAL Fluor 590) for de sonde der anneals til den unikke region NDC80luti (CF 590) fordi i dette sæt, antallet af sonder, der opfyldte alle de ovenstående kriterier (20 sonder) var lavere end den minimumsantal, der anbefales af producenten (~ 25 sonder). Efter erstatningsgodtgørelse sonde løsning efter producentens anvisninger, vi gjorde en 1:10 fortynding af stamopløsningen og gemt den fortyndede opløsning i 5-µL alikvoter ved-20 ˚C. Hver delprøve blev brugt kun en gang. For optimering, bør man gøre serielle fortyndinger fra 1:10 fortyndet løsning og test hvilken koncentration giver det bedste signal / støj-forhold. Vi anbefaler, at gøre en fortyndingsrække af 1:250, 1: 500, 1:1000 og 1: 2000 fra det oprindelige lager. I vores tilfælde resulterede en 1: 500 fortyndingsfaktoren i det bedste signal-støj-forholdet for både CF 590 og Q 670 sonde sæt.
Optimal fiksering tid er også afgørende for vellykket smFISH i spirende gær. Vi fandt at natten fiksering på 4 ˚C, snarere end fastsættelse ved stuetemperatur i 20 min., væsentligt forbedret sammenhæng og kvalitet af smFISH resultaterne meiotiske prøver. Men vi ikke har testet, hvordan natten fiksering kan påvirke vegetativ prøver, fiksering ved stuetemperatur fungeret godt for denne vækst tilstand. Således, for at optimere smFISH protokol for nye stammer eller vækstbetingelser, anbefaler vi starter med korte fiksering tid ved stuetemperatur og øge fiksering tid hvis høj variation af signal er stødt.
Sammenlignet med andre publicerede protokoller3,22,23, bruger vores protokol RNase-hæmmer VRC under fordøjelsen og en højere koncentration af VRC under hybridisering. Tilsætning af VRC i disse to trin forbedret sammenhængen i smFISH resultaterne, eventuelt ved bedre bevare RNA molekyler mod nukleasen aktivitet, som kan indføres ved zymolyase mix (enzymet er renset fra rå ekstrakter og kan indeholde RNase forurenende stoffer). Dermed, vi anbefaler at bruge mængden af VRC som anført i vores protokol eller endnu højere koncentrationer af VRC for optimering.
En betydelig del af cellerne kan gå tabt under vask skridt i både Buffer B og formamid wash buffer. For at reducere celletab, kunne man øge centrifugering hastighed. I vores tilfælde vasker ved hjælp af en høj hastighed (21.000 x g) for at sammenpresse vores prøver under Buffer B betydeligt reduceret celletab. Dog bliver celler meget skrøbelig efter zymolyase fordøjelse, så ændre centrifugering hastighed ikke anbefales. I stedet, vi foreslår at bruge lav friktion rør fra USA videnskabelige, som i høj grad hjælper sammenpresse cellerne under vasker i formamid wash buffer. Samlet set kan vores protokol konsekvent generere en éncellelag af cellerne tætte nok til effektiv billeddannelse. Typisk, 7 felter synspunkt bør give > 130 celler egnet til kvantificering.
Endelig er det vigtigt at fastslå de optimale parametre til og udgange fra billedanalyse. For at registrere smFISH steder, offentliggjorte analyse programmer almindeligt filtrere for raw-billeder ved hjælp af Gaussisk kerne fjerne baggrunden signal, og beder brugerne til at bestemme signal-støj-forholdet til brug for hvert sæt af billeder2,17. Desværre, der er i øjeblikket ikke en fælles standard, de korrekte parametre bestemmes, og så nogle empiriske test af disse forskellige indstillinger er nødvendige. Hvis du vil angive de parametre, der er nødvendige for hvert af disse trin, skal man iterativt input forskellige sæt af parametre og tjekke hvor godt resultaterne fra hvert sæt kampe, fra manuel optælling i et par repræsentative celler. Når et sæt af parametre, der er fundet, kan det bruges til de fleste af billederne opnået trods forskellige vækstbetingelser og genetiske baggrunde.
Derudover kan man teste hvis maksimal intensitet projektion af smFISH billeder kan udføres før kvantificering22. Dette trin forenkler spot opdagelse algoritme og reducerer billeddannelse tid, selv på bekostning af nogle potentielt nyttige oplysninger om enkelte steder, såsom deres subcellulært lokalisering. I vores tilfælde var antallet af mRNA molekyler produceret af NDC80 -gen lav nok, at steder var godt adskilt efter denne behandling (ikke ualmindeligt for udskrifter i spirende gær3,7). I tilfælde hvor colocalization analyse er kritisk skal analyse rørledningen bestemme placeringen af hver smFISH plet i hver kanal til at vurdere colocalization. Afhængigt af de specifikke spørgsmål bliver bedt, andre oplysninger såsom intensiteten af hver plet skal muligvis også udvindes fra pipeline for yderligere analyse. Optimere nøglen trin i protokollen og billede analyse rørledningen er afgørende for at opnå høj kvalitet af smFISH data til at undersøge spørgsmålet om interesse.

Dynamisk regulering af genekspression driver udviklingen af en organisme, samt dens reaktion på miljømæssige stress, infektion og ændringer i stofskiftet. Undersøgelser, der fokuserer på transkriptionel regulering afhængige teknologier, der måler RNA overflod. En sådan metode, betegnes enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH), der bruges til påvisning af individuelle RNA molekyler i enkelt celler1,2. Denne metode giver mulighed for måling af celle til celle variabiliteten i genekspression og bestemmelse af intracellulære RNA lokalisering.
I den mest almindeligt anvendte smFISH teknik kræver påvisning af en individuel RNA-molekyle flere korte DNA-sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder), som supplerer målet RNA og er konjugeret til den samme fluorescerende farvestof. Bindingen af en enkelt fluorescerende probe resulterer i svagt signal, men signalet fra ensemble af alle sonder er robust. Denne funktion i høj grad forbedrer signal-støj-forholdet fordi selv om en enkelt sonde kan udstille off mål bindende, sådant signal forventes at blive meget svag sammenlignet med target RNA-molekyle3. Inden for fejl af registrering, kan antallet af RNA molekyler tælles og sammenlignes på tværs af forskellige vækstbetingelser og blandt forskellige mutanter.
Siden sin første udvikling, er smFISH blevet tilpasset for at studere forskellige aspekter af gen expression4, såsom transskription brudforlængelse1,2, splejsning5,6, transcriptional sprængfyldt7 , 8 , 9, intracellulære allel udtryk10,11,12, og RNA lokalisering13,14,15. For nylig, vi har brugt denne metode til at studere udtryk for to udskrift isoformer af det samme gen, hvor kort udskrift isoform (NDC80ORF) har sin hele sekvensen delt med den lange isoform (NDC80luti )16. Til entydigt for at identificere de to mRNA isoformer, vi brugte to sonde sæt: ét sæt er specifikke for den unikke sekvens af NDC80luti, og det andet sæt, konjugeret med et andet fluorescerende farvestof, binder til det fælles område af de to isoformer. NDC80luti RNA er identificeret som en colocalized spot med begge fluorescerende signaler, der henviser til den NDC80ORF RNA er den, der indeholder kun signalet fra den fælles sonde sæt. Da antallet af de NDC80ORF afskrifter beregnes efter en metode, "subtraktion", høj effektivitet af sonden hybridisering og et højt signal / støj-forhold er nødvendige for at selvsikkert identificere smFISH steder og reducere fejl formering.
Dette papir beskriver en optimeret protokol for at udføre smFISH i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokol, den celle nummer, fiksering tid, fordøjelsestid, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer, der bruges til smFISH forsøgene blev optimeret SK1 stamme baggrund for S. cerevisiae gennemgår vegetativ vækst eller meiose. Vi bemærker imidlertid også i dette håndskrift: (1) metoden til at kontrollere kvaliteten af smFISH data efter billede erhvervelse og (2) trinnene i protokollen, som kan kræve yderligere optimering for forskellige stamme baggrunde og vækstbetingelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfuld teknik til at studere genekspression i enkelte celler på grund af dens evne til at opdage og tæller enkelte RNA molekyler. Supplement til dyb sekventering-baserede metoder, smFISH indeholder oplysninger om den celle-til-celle variation i afskriften overflod og subcellulært lokalisering af en given RNA. For nylig, vi har brugt smFISH til at studere udtryk af genet NDC80 under meiose i spirende gær, i hvilke to udskrift isoformer eksisterer og kort udskrift isoform har sin hele sekvensen delt med den lange isoform. Du kan trygt identificere hver udskrift isoform, vi optimeret kendte smFISH protokoller og opnået høj konsistens og kvalitet af smFISH data for prøver erhvervet under spirende gær meiose. Her beskriver vi denne optimerede protokol, de kriterier, som vi bruger til at afgøre, om høj kvalitet af smFISH data er indhentet, og nogle tips for at gennemføre denne protokol i andre gærstammer og vækstbetingelser.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Denne enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering protokol er optimeret til at opgøre antallet af RNA molekyler i spirende gær under vegetativ vækst og meiose.

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; Mutagenese af histon-gener i knopskydende gær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...