Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Nous remercions Anne Dodson et Stephanie Heinrich pour obtenir des conseils sur la façon d’optimiser le protocole smFISH, Xavier Darzacq pour aider avec la plateforme d’analyse, Haiyan Huang pour obtenir des suggestions sur l’analyse statistique. Ce travail a été soutenu par des fonds de la March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) et Glenn Foundation à EÜ et un NSF Graduate Research Fellowship Grant n DGE-1106400 à JC.

Remarque : Tous les tampons et les supports utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Les informations sur le fournisseur pour les réactifs sont répertoriées dans la Table des matières.
Jour 1/jour 1-2 :
Remarque : Pour la culture végétative, la croissance de cellules à une OD600 de 0,4 à 0,6 dans un milieu privilégié. Pour la culture méiotique, induire des cellules subissent la méiose à l’aide d’une méthode préférée (généralement mise en culture dans un OD600 de 1,85).
1. la Fixation et la Digestion de l’échantillon
<ol><li>Fixer un total de ~3.5 OD600 des cellules à 3 % de formaldéhyde.<ol>
<li>Pour la culture végétale, ajouter 5,52 mL de culture à 480 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes coniques 15 mL.</li>
		<li>Pour la culture méiotique, ajouter 1840 µL de culture à 160 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes de microcentrifuge de 2 mL. Inverser ~ 5 fois pour mélanger. ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les tubes sur un tambour de rouleau à température ambiante pendant 20 min. Pour échantillons méiotiques, après fixation à température ambiante pendant 20 min, continuent de fixation durant la nuit à 4 ° c, tournant. Remarque : La fixation d’une nuit ou plus augmente la reproductibilité et la qualité des données smFISH obtenues pour les échantillons de la méiose. Temps de fixation doit être optimisé.</li>
	<li>Alors que les échantillons sont fixation, décongelez 200 mM vanadyle ribonucléosides Complexes (RVC) à 65 ° c pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Préparer le mélange maître digestion dans un tube de 15 mL : pour 1 échantillon, mélanger 425 µL de tampon B 40 µl de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) ; pour 5 échantillons, mélanger 2125 µL de tampon B avec 200 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c). Vortex ~ 5 s pour tout remettre en suspension le VRC avant d’ajouter au mélange maître, qui apparaîtra vert brunâtre clair après addition de VRC. NOTE : Ajout de VRC durant la digestion améliore la cohérence des résultats smFISH, potentiellement en inhibant le contaminant nucléase introduit par le mélange de zymolyase, qui est purifié à partir d’extrait brut. Le montant nécessaire à cette étape de VRC doit être optimisé.</li>
	<li>Pour les échantillons végétatives, centrifuger les tubes à ~ 1057 x g pendant 3 min. Pour les échantillons méiotiques (après fixation au jour le jour), centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. décanter ou aspirer le surnageant pour déchets de formaldéhyde. Remarque : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B par pipetage de haut en bas ou en inversant les tubes et pichenette pour mélanger. Transférer les échantillons végétatives aux tubes de 2 mL après remise en suspension.</li>
	<li>Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 1,5 mL de froid tampon B.</li>
	<li>Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B. Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. aspirer le liquide complètement par le vide ou en pipettant également.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules en 425 µL du mélange principal de la digestion et brièvement vortex pour remettre en suspension. Ajouter 5 µL de 100 t zymolyase de 10 mg/mL dans chaque tube. NOTE : Vortex le zymolyase chaque fois avant d’ajouter aux tubes. Ajouter zymolyase dans chaque tube individuellement, plutôt que d’ajouter au mélange maître. Les deux étapes aident à maintenir la cohérence de la digestion chez les tubes parce que zymolyase précipite rapidement.</li>
	<li>Vortex 2-3 s pour mélanger. Placer les tubes sur un tambour de rouleau et digérer à 30 ° c pendant 15 à 30 min. Pour les cellules végétatives et les premiers stades de la méiose, cela prend habituellement environ 15 min, et pour la prophase méiotique et divisions méiotiques, cela prend habituellement environ 30 min. Remarque : Vérifiez le microscope toutes les 5 min après 15 min et arrêter la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules apparaissent opaques et non réfraction. Partir de ce moment, les cellules sont très fragiles. Gérer les cellules doucement et évitez d’utiliser aspiration intra-utérine ou Vortex.
</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide complètement en pipettant également.</li>
	<li>Resuspendre doucement les cellules avec 1 mL de tampon B en pipettant également monter et descendre 1 ou 2 fois pour mélanger.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer tampon B liquide de pipetage. Doucement remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’éthanol à 70 % (dilué avec de l’eau exempte de RNase).</li>
	<li>Incuber 3,5 à 4 heures à température ambiante.</li>
</ol>2. l’hybridation
<ol><li>Ramener la formamide à température ambiante (pour 50 mL partie aliquote, il faut environ 30 min au bain-marie). Remarque : Ne pas ouvrir la bouteille de formamide jusqu'à ce que la bouteille atteigne la température de la pièce pour éviter l’oxydation du formamide. ATTENTION : Le Formamide est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.</li>
	<li>Préparer le tampon de lavage 10 % formamide dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer 500 µL d’éthanol à 70 % de pipetage. Doucement pipette up et down pour remettre en suspension les cellules restantes et ensuite transférer les cellules des tubes de faible adhérence. NOTE : Utilisant des tubes à basse adhérence grandement réduit la perte de cellules pendant les lavages ultérieurs.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. retirer tout l’éthanol par pipetage.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage 10 % formamide et doucement pipette haut et en bas 2 ou 3 fois pour remettre les cellules en suspension.</li>
	<li>Laissez les cellules de s’asseoir à la température ambiante pendant environ 20 min pendant la préparation de la Solution d’hybridation. Pour 1 échantillon, mélanger 50 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 5 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 1 µL de chaque sonde (200 nM final). Pour 5 échantillons, mélangez 250 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 25 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 5 µL de chaque sonde (200 nM final).<ol>
<li>Décongeler le tampon d’hybridation (congelés à-20 ° c) à température ambiante avant d’ouvrir le tube pour éviter l’oxydation du formamide.</li>
		<li>Après avoir ajouté le 200 mM RVC, Vortexer pendant 5-10 s avant d’ajouter les sondes, qui sont conçus et achetés dans le commerce et reconstitués selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Si les deux sondes sont conjointement mis en incubation, ajouter 1 µL de la 01:10 dilution de la sonde #1, ainsi que 1 µL de la 01:10 dilution du stock sonde #2, faire une dilution finale de ~ 1/500 pour chaque sonde. La concentration nécessaire pour le meilleur rapport de signal-bruit doit être optimisé (voir Discussion pour plus de détails).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.</li>
	<li>Ajouter au moins 50 µL de Solution d’hybridation dans chaque tube. Feuilleter les tubes à mélanger.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c sur un tambour de rouleau au moins 16 heures dans l’obscurité.</li>
</ol>2/jour 3
3. laver et imagerie
<ol><li>Ramener la formamide à température ambiante.</li>
	<li>Préparer 10 % formamide tampon de lavage (FWB) dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Retirer les tubes de l’enrouleur de rouleau et rangez-les dans une boîte recouvert de papier pour protéger de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 1 mL de 10 % FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pour 3 min. Retirez le surnageant de déchets dangereux en pipettant également et de laisser ~ 50 µL.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparer DAPI/FWB dans un tube conique de 15 mL : pour 1 échantillon, se mêlent 1000 µL de tampon de lavage 10 % formamide 1 µL de 5 mg/mL DAPI. Pour 10 échantillons, mélanger 10 mL de tampon de lavage 10 % formamide avec 10 µL de 5 mg/mL DAPI. Remettre en suspension dans 1 mL de DAPI/FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.</li>
	<li>Décongeler les réactifs anti-eau de Javel sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant complètement en pipettant également. Le cas échéant, centrifuger à nouveau pour retirer tout le liquide surnageant.</li>
	<li>Pour les échantillons qui ne sont pas immédiatement imagés, resuspendre le culot dans 50 µL de tampon de GLOX sans enzymes. Pipette de haut en bas 3 ou 4 fois pour mélanger.<ol>
<li>Conserver tous les échantillons unimaged dans la zone couvertes de papier à 4 ° c jusqu’au moment d’image. Lorsque vous êtes prêt pour l’image, centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 2 min et retirez le surnageant complètement en pipettant également. Resuspendre dans GLOX avec enzymes comme ci-dessous.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les échantillons étant imagés immédiatement, ajouter 15 à 20 µL de tampon GLOX avec des enzymes. Doucement pipette de haut en bas pour mélanger. Remarque : Le volume ajouté peut varier selon la taille du culot cellulaire. Nous vous recommandons resuspendant le culot dans 15 µL de tampon GLOX avec des enzymes et vérifier la densité cellulaire sur le microscope. Si les cellules sont trop denses (cellules agglutinées les unes sur les autres), ajoute le tampon GLOX supplémentaire avec des enzymes. Si les cellules sont trop rares, centrifuger l’échantillon et supprimer ~ 5 µL de tampon.</li>
	<li>Pipette 5 µL sur une lamelle couvre-objet (18 mm x 18 mm, n ° 1) et de mettre la lamelle couvre-objet sur une diapositive.</li>
	<li>Mettre une lingette de laboratoire sur le dessus de la diapositive où se trouve la lamelle. Appuyez doucement sur la lingette de laboratoire pour définir la diapositive (voir liquide se détacher de ses quatre bords de la lamelle).</li>
	<li>Transférer la lame à la salle du microscope dans une boîte recouverte de papier d’aluminium.</li>
	<li>Image en utilisant un microscope à fluorescence de grand champ à fort grossissement (X 60-100) et de forte ouverture numérique. Remarque : Afin de recueillir le nombre maximal de photons émis par les sondes smFISH, microscopes confocaux sont déconseillées, car elles limitent considérablement la quantité de lumière à collecter. Ici, les données ont été recueillies sur un microscope équipé d’une 100 X, objectif 1.4 de NA, à l’aide de filtres CY5 (EX632/22, EM679/34) photographié à 1,3 s, 100 % T ; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100 % T ; et DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05 à 0,1 s, T. 32-50 % Une image de référence de champ lumineux devrait également être acquise. Acquérir des tranches de 15 à 25 avec une taille d’étape de 0,1 à 0,2 µm, d’entièrement au-dessous de la mise au point du champ de vision tout à fait indiqué ci-dessus, afin de vous assurer que toutes les taches de RNA sont prises en compte.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Analyser les données de smFISH avec smFISH publié des outils d’analyse tels que poissons-quant17 et StarSearch2, ou avec des programmes sur mesure, selon les besoins de l’expérience. Remarque : Un pipeline bonne analyse devrait permettre aux utilisateurs de déterminer un seuil pour séparer les taches de RNA vrais de l’arrière-plan et statistiques telles que les coordonnées X, Y et Z de (facultatives) et l’intensité de chaque tache, le nombre de places dans chaque cellule de sortie et éventuellement des paramètres d’ajustement comme un moyen de filtrer les fausses détections.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Le protocole présenté ici est dérivé d’autres protocoles de smFISH publié2,3,21,22,23et a été spécifiquement optimisé pour le fond de la souche de levure SK1. Les paramètres optimisés inclus le nombre de cellules, durée de fixation, vitesse de centrifugation et durée, durée de la digestion, tampon de digestion, concentration de sonde et tampon d’hybridation. D’autres paramètres comme la température d’hybridation et de la durée n’étaient pas optimisés. Dans cette section, nous partageons quelques notes qui permettraient d’adapter ce protocole à n’importe quel fond de souche de levure et les conditions de croissance d’intérêt.
La paroi cellulaire de la levure de bière est un des défis majeurs contre l’obtention d’images de haute qualité smFISH dans la levure de bière parce que la paroi cellulaire empêche la pénétration de la sonde. Une digestion incomplète de la paroi cellulaire par zymolyase mène à inefficace hybridation des sondes et forte variabilité de cellule-à signal. Cependant, digestion excessive peut rendent les cellules trop fragile, conduisant à l’importante perte de cellules au cours des étapes de lavage et éclatement au cours de la préparation pour l’imagerie de cellules. Ainsi, il est essentiel d’optimiser la durée de la digestion. Il est recommandé de mener une expérience pilote smFISH de digérer l’échantillon même pour des quantités différentes de temps. Dans notre cas, nous avons obtenu les meilleures données smFISH si nous nous sommes arrêtés la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules sont devenus non réfraction. En général, pour les mêmes conditions de croissance, différentes souches mutantes génétiques peuvent être digérées avec un timing similaire. Toutefois, la durée de la digestion se distingue par comparaison entre les différentes conditions de croissance et les différentes étapes de la méiose chez la levure de bière. Une fois que le calendrier est déterminé, la qualité de smFISH est reproductible. Remarque que pour les souches mutantes avec la synthèse de la paroi de cellules défectueuses et/ou la composition, la digestion peut être complétée en moins de 15 min. utilisation des différents lots de zymolyase peut aussi légèrement changer le moment de la digestion.
Concentration optimale de sonde est nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit élevé. Nous avons conçu et acheté nos sondes de smFISH dans le commerce. Bonnes sondes (souvent 20-mers) devraient avoir un pourcentage de GC allant de 35 % à 45 %, un espacement minimum de 2 paires de bases entre les sondes et faible réactivité croisée. Nous avons utilisé un concepteur de sonde sur le web du fabricant pour générer une liste de sondes, et s’il y avait assez de sondes au choix, nous utiliserions l’algorithme BLAST dans la base de données du génome Saccharomyces pour éliminer les sondes avec plus de 17 paires de bases que se chevauchés avec d’autres régions génomiques. Nous avons choisi le plus PhotoStation colorant fluorescent (CAL Fluor 590) pour l’ensemble de la sonde qui recuits à la région unique de NDC80luti (CF 590) parce que dans cette série, le nombre de sondes qui satisfait tous les critères ci-dessus (20 sondes) était inférieur à la nombre minimum recommandé par le fabricant (~ 25 sondes). Après reconstitution de la solution de sonde suivant les instructions du fabricant, nous avons fait un 01:10 dilution de la solution mère et stocké de la solution diluée en aliquotes de 5 µL à-20 ° c. Chaque aliquote a été utilisé qu’une seule fois. Pour l’optimisation, on devrait faire série dilutions à partir du 01:10 dilué de solution et test dont la concentration donne le meilleur rapport signal sur bruit. Nous recommandons de faire une série de dilution de 1/250, 1/500, 1/1000 et 1 : 2000 de la souche originale. Dans notre cas, un facteur de dilution de 1/500 a entraîné le meilleur rapport signal-bruit, pour les ensembles de sondes CF 590 tant Q 670.
Temps de fixation optimale est également critique pour le succès smFISH dans la levure de bière. Nous trouvé que la fixation pendant la nuit à 4 ° c, plutôt que fixation à température ambiante pendant 20 min, nettement amélioré la cohérence et la qualité des résultats smFISH pour les échantillons de la méiose. Bien que nous n’avons pas testé comment du jour au lendemain la fixation peut influer sur les échantillons végétatives, fixation à la température ambiante a bien fonctionné pour cette condition de croissance. Ainsi, pour optimiser le protocole smFISH de nouvelles souches ou de conditions de croissance, nous vous recommandons commençant par temps de fixation courte à température ambiante et en augmentant le temps de fixation si forte variabilité du signal est rencontrée.
Par rapport aux autres protocoles publiés3,22,23, notre protocole utilise l’inhibiteur de RNase VRC au cours de la digestion et une concentration plus élevée de VRC au cours de l’hybridation. Ajout de VRC dans ces deux étapes a amélioré la cohérence des résultats smFISH, peut-être de mieux préserver les molécules d’ARN contre activité nucléasique, qui peuvent être apportés par le mélange de zymolyase (l’enzyme est purifié à partir des extraits bruts et peut contenir la RNase contaminants). Ainsi, nous recommandons d’utiliser la quantité de VRC énumérés dans notre protocole ou encore des concentrations plus élevées de VRC pour l’optimisation.
Une partie importante des cellules peut être perdue au cours des étapes de lavage en tampon B et le tampon de lavage de formamide. Pour réduire la perte de cellules, on pourrait augmenter la vitesse de centrifugation. Dans notre cas, en utilisant une vitesse élevée (21 000 x g) pour granuler nos échantillons au cours de la mémoire tampon B lave la perte de cellules sensiblement réduite. Cependant, les cellules deviennent très fragiles après digestion zymolyase, changement de vitesse de centrifugation n’est donc pas recommandé. Au lieu de cela, nous vous suggérons d’utiliser les tubes de faible adhérence des scientifiques aux USA, qui grandement aident les cellules à pellets pendant les lavages dans le tampon de lavage de formamide. Dans l’ensemble, notre protocole peut générer systématiquement une monocouche de cellules suffisamment denses pour l’imagerie efficace. En règle générale, les 7 champs de vue devrait produire > 130 cellules appropriés pour la quantification.
Enfin, il est important de déterminer les paramètres optimaux pour et les sorties nécessaires d’analyse d’images. Pour détecter les points de smFISH, analyse publiée programmes couramment filtrent les images raw avec un noyau gaussien pour supprimer le signal de fond et demandent aux utilisateurs de déterminer le ratio signal-bruit d’utiliser pour chaque ensemble d’images2,17. Malheureusement, il n’y a pas actuellement d’une norme unique par lequel les paramètres sont déterminés, et quelques essais empiriques de ces différents paramètres est donc nécessaire. Pour définir les paramètres nécessaires pour chacune de ces étapes, on a besoin de manière itérative différents jeux de paramètres d’entrée et vérifiez bien les résultats obtenus par chaque jeu correspond à celui de comptage manuel dans quelques cellules représentatives. Une fois un ensemble de paramètres est retrouvé, il peut être utilisé pour la plupart des images obtenues malgré les différentes conditions de croissance et les antécédents génétiques.
En outre, on peut tester si l’intensité maximale de projection des images smFISH peut être effectuée avant quantification22. Cette étape simplifie l’algorithme de détection spot et réduit considérablement les temps d’imagerie, mais au détriment des informations potentiellement utiles sur des spots individuels, tels que leur localisation subcellulaire. Dans notre cas, le nombre de molécules d’ADN messagère produite par le gène NDC80 était assez bas pour que les taches étaient bien distincts après ce traitement (pas rare pour les transcriptions en bourgeonnement levure3,7). Dans le cas où l’analyse de colocalisation est critique, le pipeline de l’analyse doit déterminer l’emplacement de chaque spot de smFISH dans chaque canal pour évaluer la colocalisation. Selon les questions spécifiques posées, autres informations telles que l’intensité de chaque spot peuvent également devoir être extrait à partir du pipeline pour une analyse ultérieure. Optimisation de la clé dans le protocole et le pipeline de l’analyse d’image est crucial dans l’obtention de la qualité des données smFISH pour étudier la question des intérêts.

Régulation dynamique de l’expression des gènes entraîne le développement d’un organisme, ainsi que sa réponse au stress environnemental, l’infection et des changements dans le métabolisme. Les études qui portent sur la régulation transcriptionnelle fondés sur les technologies qui mesurent l’abondance RNA. Une de ces méthodes, appelée seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH), est utilisée pour la détection de molécules d’ARN individuels dans des cellules individuelles1,2. Cette méthode permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule dans l’expression des gènes et de la détermination de la localisation intracellulaire de l’ARN.
Dans la technique de smFISH plus couramment utilisés, détection d’une molécule d’ARN individuelle nécessite plusieurs sondes d’ADN courtes (souvent ~ 48 20-mer sondes) qui sont complémentaires à l’ARN cible et sont conjugués à la même colorant fluorescent. Fixation d’une seule sonde fluorescente résulte en signal faible, mais le signal provenant de l’ensemble de toutes les sondes est robuste. Cette fonctionnalité améliore considérablement le rapport signal-bruit, parce que même si une seule sonde peut exposer la liaison hors cible, tel signal devrait être très faible par rapport à celle de la cible ARN molécule3. Au sein de l’erreur de détection, le nombre de molécules d’ARN peut être compté et comparé entre les différentes conditions de croissance et entre différents mutants.
Depuis son premier développement, smFISH a été adapté pour étudier divers aspects de l' expression génique4, par exemple transcription élongation1,2, épissage5,6, transcription éclatement7 , 8 , 9, expression allélique intracellulaire10,11,12et RNA localization13,14,15. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour étudier l’expression des deux isoformes de la transcription du même gène, dans lequel l’isoforme de transcription court (NDC80ORF) a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue (NDC80luti )16. Pour identifier de façon unique les deux isoformes de l’ARNm, nous avons utilisé deux ensembles de sonde : un jeu est spécifique à la séquence unique de NDC80luti, et l’autre jeu, conjugué à un autre colorant fluorescent, se lie à la région commune des deux isoformes. Le NDC80luti RNA est identifiée comme une tache colocalized avec les deux signaux fluorescents, tandis que le NDC80ORF ARN est celui qui contient seulement le signal provenant de l’ensemble commun de la sonde. Puisque le nombre de la NDC80ORF transcriptions est calculée par une méthode de « soustraction », rendement élevé de l’hybridation de la sonde et un rapport signal sur bruit élevé sont nécessaires d’identifier smFISH taches avec confiance et de réduire les erreurs propagation.
Cet article décrit un protocole optimisé pour effectuer des smFISH dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans ce protocole, le nombre de cellules, de temps de fixation, temps de digestion, digestion tampon, concentration de sonde et hybridation tampon utilisée pour les expériences de smFISH ont été optimisées pour le SK1 souche fond de S. cerevisiae subir végétatif croissance ou la méiose. Cependant, nous notons également dans ce manuscrit : (1) la méthode pour vérifier la qualité des données de smFISH après l’acquisition de l’image et (2) la procédure décrite dans le protocole qui peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire pour les arrière-plans de souche différente et les conditions de croissance.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH) est une technique puissante pour étudier l’expression des gènes dans des cellules individuelles en raison de sa capacité à détecter et compter les différentes molécules d’ARN. Complémentaire à la profondes méthodes basées sur le séquençage, smFISH fournit des informations sur la variation de cellule-cellule dans l’abondance de la transcription et la localisation subcellulaire d’un ARN donné. Récemment, nous avons utilisé smFISH pour étudier l’expression du gène NDC80 au cours de la méiose chez la levure de bière, dans lequel deux transcription isoformes existent et l’isoforme de transcription court a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue. Déterminer en toute confiance chaque isoforme de la transcription, nous avons optimisé des protocoles connus smFISH et obtenu haute consistance et la qualité des données de smFISH pour les échantillons acquis au cours du bourgeonnement levure la méiose. Nous décrivons ici, ce protocole optimisé, les critères que nous utilisons pour déterminer si la qualité des données de smFISH est obtenue et quelques conseils d’application du présent protocole dans d’autres souches de levures et de conditions de croissance.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Cette seule molécule fluorescence in situ hybridation protocole est optimisé afin de quantifier le nombre de molécules d’ARN dans la levure de bière au cours de la méiose et de la croissance végétative.

Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

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Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (mFISH) et Spectral caryotype (SKY) chez des souris irradiées

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