Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Vi tacka Anne Dodson och Stephanie Heinrich för råd om hur du optimerar smFISH protokollet, Xavier Darzacq för hjälp med analys-plattformen, Haiyan Huang för förslag på den statistiska analysen. Detta arbete stöds av medel från den March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) och Glenn Foundation till EÜ och en NSF Graduate Research Fellowship Grant nr DGE-1106400 till JC.

Obs: Alla buffertar och media som används i detta protokoll listas i tabell 1. Leverantörsinformationen för reagenserna är listade i Tabell för material.
Dag 1/dag 1-2:
Obs: För vegetativt kultur, odla cellerna till en OD600 av 0,4 – 0,6 i en rekommenderad medium. För meiotiska kultur, framkalla celler genomgår meios med en rekommenderad metod (vanligtvis odling i en OD600 av 1,85).
1. prova fixering och matsmältning
<ol><li>Fixa en totalt ~3.5 OD600 av celler i 3% formaldehyd.<ol>
<li>För vegetativt kultur, tillsätt 5,52 mL kultur till 480 µL av 37% formaldehyd i 15 mL koniska rör.</li>
		<li>För meiotiska kultur, tillsätt 1840 µL av kultur till 160 µL av 37% formaldehyd i 2 mL mikrocentrifugrör. Invertera ~ 5 gånger att blanda. Varning: Formaldehyd är giftiga. Hanteras och kasseras enligt institutionella föreskrifter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placera rören på en rulle trumma i rumstemperatur i 20 min. För meiotiska prover, efter fastställande i rumstemperatur i 20 min, fortsätta fastställande över natten vid 4 ˚C, roterande. Obs: Övernattning fixering ökar reproducerbarhet och kvaliteten på smFISH data som erhållits för meiotiska prover. Fixering tid bör optimeras.</li>
	<li>Även om proverna fastställande, Tina 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplex (VRC) på 65 ° c i minst 10 min.</li>
	<li>Förbereda matsmältningen master mix i en 15 mL tub: för 1 prov, blanda 425 µL buffert B med 40 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c); för 5 prover, blanda 2125 µL buffert B med 200 µL 200 mM VRC (värmas till 65 ° c). Vortex ~ 5 s att fullt resuspendera VRC innan du lägger till huvudmixen, som kommer att visas ljus brunaktig grön efter VRC tillägg. Obs: Tillägg av VRC under matsmältningen förbättrar konsistensen av smFISH resultat, eventuellt genom att hämma det främmande ämnet nuclease som infördes genom den zymolyase blandningen, som renas från råa extrakt. Mängden VRC krävs vid detta steg bör optimeras.</li>
	<li>För vegetativt prover, Centrifugera rören vid ~ 1057 x g i 3 min. För meiotiska prover (efter övernattning fixering), Centrifugera 21 000 x g för 1,5 min. Dekantera eller Aspirera supernatanten till formaldehyd avfall. Obs: Alla centrifugering steg utförs i rumstemperatur.</li>
	<li>Att resuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B genom pipettering upp och ner eller invertera rören och snärta för att blanda. Överföra vegetativt prover till 2 mL rör efter resuspension.</li>
	<li>Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. bort huvuddelen av vätskan genom vakuum aspiration eller pipettering, lämnar bakom ~ 100 µL.</li>
	<li>Att resuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B.</li>
	<li>Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. bort huvuddelen av vätskan genom vakuum aspiration eller pipettering, lämnar bakom ~ 100 µL.</li>
	<li>Återsuspendera cellerna i 1,5 mL kall buffert B. Centrifugera vid 21 000 x g för 1,5 min. Aspirera vätska helt genom vakuum eller genom pipettering.</li>
	<li>Att resuspendera cellerna i 425 µL av matsmältningen huvudmixen och kort vortex att resuspendera. Tillsätt 5 µL 100T 10 mg/mL zymolyase i varje rör. Obs: Vortex zymolyase varje gång innan du lägger till rören. Lägga till zymolyase i varje rör individuellt, istället för att lägga till huvudmixen. Båda stegen att upprätthålla matsmältning enhetlighet bland rör eftersom zymolyase fällningar snabbt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s att blanda. Placera rören på en rulle trumma och smälta vid 30 ˚C för 15-30 min. Det tar oftast ~ 15 min för vegetativa celler och tidiga meiotiska stadierna, och för meiotiska profas och meiotiska divisioner, det tar oftast ~ 30 min. Obs: Kontrollera på mikroskopet varje 5 min efter 15 min och stoppa matsmältningen när ~ 80% av cellerna visas icke-transparenta och icke-brytningsfel. Från denna punkt på, celler är mycket bräcklig. Hantera celler försiktigt och Undvik att använda vakuum aspiration eller vortexa.
</li>
	<li>Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort vätskan helt genom pipettering.</li>
	<li>Försiktigt Omsuspendera cellerna med 1 mL buffert B genom pipettering upp och ner 1 - 2 gånger att blanda.</li>
	<li>Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort buffert B vätska genom pipettering. Försiktigt resuspendera cellerna i 1 mL 70% etanol (utspädd med RNase-fritt vatten).</li>
	<li>Inkubera 3,5-4 timmar i rumstemperatur.</li>
</ol>2. hybridisering
<ol><li>Låt formamid rumstemperatur (för 50 mL alikvot, det tar ~ 30 min i vattenbad). Obs: Öppna inte formamid flaskan tills flaskan når rumstemperatur för att undvika oxidation av formamid. Varning: Formamid är giftiga. Hanteras och kasseras enligt institutionella föreskrifter.</li>
	<li>Förbereda 10% formamid tvättbuffert i en 15 mL koniska rör.</li>
	<li>Centrifugera rören vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort 500 µL av 70% etanol av pipettering. Pipettera försiktigt upp och ner för att resuspendera återstående cellerna, och sedan överföra cellerna till låg friktion rör. Obs: Använda låg friktion rör kraftigt minskar cellförlust under efterföljande tvättar.</li>
	<li>Centrifugera rören igen vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort alla etanol av pipettering.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL 10% formamid tvättbuffert och försiktigt Pipettera upp och ner 2 - 3 gånger till Omsuspendera cellerna.</li>
	<li>Att cellerna att sitta vid rumstemperatur för ~ 20 min medan du förbereder hybridisering lösningen. För 1 prov, blanda 50 µL av hybridisering buffert (rum temp.), 5 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c) och 1 µL av varje sond (200 nM slutlig). För 5 prover, blanda 250 µL av hybridisering buffert (rum temp.), 25 µL av 200 mM VRC (värmas till 65 ° c) och 5 µL av varje sond (200 nM slutlig).<ol>
<li>Tina hybridisering buffert (fryst vid-20 ° c) till rumstemperatur innan du öppnar tuben för att förhindra formamid oxidation.</li>
		<li>Efter tillägger den 200 mM VRC, virvel för 5-10 s innan du lägger sonderna, som är utformad för köpt kommersiellt och rekonstitueras enligt tillverkarens anvisningar.</li>
		<li>Om två sonder är samtidig ruvade, tillsätt 1 µL av 1:10 utspädning av sonden #1 beståndet, liksom 1 µL av 1:10 utspädning av sonden #2 beståndet, att göra en slutspädning av ~ 1: 500 för antingen sonden. Den koncentration som behövs för bästa signal-brus-förhållande behöver vara optimerad (se diskussion för detaljer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten i farligt avfall genom pipettering.</li>
	<li>Tillsätt minst 50 µL av hybridisering lösning till varje rör. Snärta rören för att blanda.</li>
	<li>Inkubera vid 30 ° c på en trumma som rullen i minst 16 timmar i mörker.</li>
</ol>Dag 2/dag 3
3. tvätt och imaging
<ol><li>Ta formamid till rumstemperatur.</li>
	<li>Förbereda 10% formamid tvättbuffert (FWB) i en 15 mL koniska rör.</li>
	<li>Ta bort rören från rullen trumman och placera dem i en folie-täckt låda ljuskänsligt.</li>
	<li>Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten i farligt avfall genom pipettering.</li>
	<li>Återsuspendera i 1 mL 10% FWB genom att försiktigt upp och ner med 2 - 3 gånger.</li>
	<li>Inkubera vid 30 ° c i 30 min (inte roterar) i rutan folie-täckt.</li>
	<li>Centrifugera proverna vid ~ 376 x g för 3 min. ta bort supernatanten farligt avfall genom pipettering och lämna ~ 50 µL.</li>
	<li>Under tiden förbereder DAPI/FWB i en 15 mL koniska rör: för 1 prov, blanda 1000 µL 10% formamid tvättbuffert med 1 µL 5 mg/mL DAPI. För 10 prover, blanda 10 mL 10% formamid tvättbuffert med 10 µL av 5 mg/mL DAPI. Återsuspendera i 1 mL av DAPI/FWB genom att försiktigt upp och ner med 2 - 3 gånger.</li>
	<li>Inkubera vid 30 ° c i 30 min (inte roterar) i rutan folie-täckt.</li>
	<li>Tina anti blekmedel reagens på is.</li>
	<li>Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 3 min. ta bort supernatanten helt genom pipettering. Om det behövs, Centrifugera igen för att ta bort alla av supernatanten.</li>
	<li>För prover som inte är avbildade omedelbart, återsuspendera pelleten i 50 µL av GLOX buffert utan enzymer. Pipettera upp och ner 3 - 4 gånger att blanda.<ol>
<li>Hålla alla unimaged prover i rutan folie-omfattas vid 4 ° c tills det att bilden. När redo att bild, Centrifugera proverna vid ~ 376 x g i 2 min och ta bort supernatanten helt pipettering. Återsuspendera i GLOX med enzymer som nedan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För prover som avbildas omedelbart, tillsätt 15-20 µL av GLOX buffert med enzymer. Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda. Obs: Volymen lagt till kan variera beroende på storleken på cellpelleten. Vi rekommenderar omblandning pelleten i 15 µL GLOX buffert med enzymer och kontrollera cell densiteten på Mikroskop. Om cellerna är alltför tät (cellerna klumpar ovanpå varandra), lägga till extra GLOX buffert med enzymer. Om cellerna är alltför gles, Centrifugera provet och ta bort ~ 5 µL buffert.</li>
	<li>Pipettera 5 µL på ett täckglas (18 mm x 18 mm, nr 1), och sätta täckglaset på en bild.</li>
	<li>Sätta en laboratorium torka ovanpå bilden där täckglaset placeras. Tryck försiktigt på det laboratorium torka att ställa in bilden (bör se flytande kommer bort från alla fyra kanter på täckglaset).</li>
	<li>Överför bilden till Mikroskop rummet i en låda som täcks av aluminiumfolie.</li>
	<li>Bild med wide-fältet fluorescens Mikroskop med hög förstoring (60-100 X) och hög numerisk bländare. Obs: För att samla in det maximala antalet fotoner som avges av de smFISH sonderna, confocal Mikroskop rekommenderas inte, eftersom de avsevärt begränsa mängden ljus som samlas in. Här uppgifterna samlades på ett mikroskop som är utrustat med en 100 X, 1,4 NA mål, använda filter CY5 (EX632/22, EM679/34) avbildas på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; och DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32-50% T. En ljus-fältet referensavbildning bör också förvärvas. Förvärva 15-25 skivor med ett stegstorlek av 0,1-0,2 µm, från helt nedanför fokus i synfältet helt ovan, för att säkerställa att alla RNA fläckarna redovisas.</li>
</ol>4. bildanalys
<ol><li>Analysera smFISH data med publicerade smFISH analysverktyg såsom fisk-quant17 och StarSearch2eller med skräddarsydda program, beroende på de exakta kraven för experimentet. Obs: En bra analys pipeline bör tillåta användarna att fastställa en tröskel för att skilja de sanna RNA-platserna från bakgrunden och matar ut statistik som (valfritt) koordinaterna X, Y och Z och intensiteten i varje plats, antalet ställen i varje cell , och eventuellt passande parametrar som ett sätt att filtrera bort falska detektioner.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Det protokoll som presenteras här härstammar från andra publicerade smFISH protokoll2,3,21,22,23, och är särskilt optimerat för jäst stam bakgrunden SK1. Parametrarna för optimerad ingår antalet celler, fixering varaktighet, centrifugeringsvarvtal och varaktighet, matsmältningen varaktighet, matsmältningen buffert, sond koncentration och hybridisering buffert. Andra parametrar såsom hybridiseringstemperatur och varaktighet var inte optimerad. I detta avsnitt delar vi några anteckningar som skulle hjälpa till att anpassa detta protokoll till någon jäst stam bakgrund och tillväxten villkorar av intresse.
Cellväggen av spirande jäst är en stor utmaning mot att få hög kvalitet smFISH bilder i spirande jäst eftersom cellväggen hindrar sonden penetration. Ofullständig nedbrytning av cellväggen av zymolyase leder till ineffektiva hybridisering av sonder och hög cell till cell variation i signalen. Dock kan alltför matsmältningen göra celler alltför bräcklig, leder till betydande cell förlust under tvätt stegen och cell spricker under bild förberedelse för imaging. Således är det avgörande att optimera matsmältningen varaktighet. Vi rekommenderar att genomföra ett pilotprojekt smFISH experiment genom att smälta samma prov för olika mängder av tid. I vårt fall fick vi bästa smFISH data om vi slutade matsmältningen när ~ 80% av cellerna blev icke-brytningsfel. Vanligtvis för samma tillväxt tillstånd, kan olika genetiska mutant stammar smältas med liknande timing. Varaktigheten av matsmältningen skiljer sig dock jämfört bland olika odlingsbetingelser och olika stadier i meios i spirande jäst. När tidpunkten bestäms, är kvaliteten på smFISH reproducerbara. Observera kan att för mutant stammar med defekta cellväggsyntes och sammansättningen, matsmältning får fyllas i på mindre än 15 min. användning av olika partier av zymolyase också något ändra matsmältningen timing.
Optimal sonden koncentration som behövs för att uppnå en hög signal-brus-förhållande. Vi designade och köpt vår smFISH sonder kommersiellt. Bra sonder (ofta 20-mers) bör ha en procentandel av GC, från 35% till 45%, ett minsta avstånd av 2 baspar mellan sonder och låg korsreaktivitet. Vi använde en webbaserad sonden designer från tillverkaren för att generera en lista av sonder, och om det fanns tillräckligt sonder att välja mellan, vi skulle använda BLAST algoritmen i databasen Saccharomyces genomet för att eliminera sonderna med mer än 17 baspar överlappas med andra genomisk regioner. Vi valde den mer fotostabilt fluorescerande färgämnen (CAL Fluor 590) för sonden som anneals till den unika regionen NDC80luti (CF 590) eftersom i denna uppsättning, antalet sonder som uppfyllt alla ovanstående kriterier (20 sonder) var lägre än den minimiantal som rekommenderas av tillverkaren (~ 25 sonder). Efter beredning av sonden lösningen efter tillverkarens instruktioner, gjorde vi en 1:10 utspädning av en stamlösning och lagras den utspädda lösningen i 5-µL alikvoter vid-20 ˚C. Varje alikvot användes bara en gång. För optimering, bör man göra seriella utspädningar från 1:10 utspädd lösning och test vilken koncentration ger det bästa signal-brus-förhållandet. Vi rekommenderar att göra en utspädning serie 1: 250, 1: 500, 1: 1000 och 1: 2000 från det ursprungliga beståndet. I vårt fall resulterade en 1: 500 utspädningsfaktorn i bästa signal-brus-förhållandet, för både CF 590 och Q 670 probe set.
Optimal fixering tid är också avgörande för framgångsrika smFISH i spirande jäst. Vi hittade den övernattning fixeringen vid 4 ˚C, snarare än fastställande i rumstemperatur i 20 min, betydligt bättre konsekvens och kvalitet av smFISH resultat för meiotiska prover. Även om vi inte har testat hur natten fixering kan påverka vegetativt prover, fixering vid rumstemperatur fungerat bra för detta tillväxt villkor. Således, för att optimera smFISH protokollet för nya stammar eller tillväxt villkorar, rekommenderar vi börjar med kort fixering tid vid rumstemperatur och ökar fixering tiden om hög variabilitet av signal påträffas.
Jämfört med andra publicerade protokoll3,22,23, använder vår protokollet den RNase inhibitor VRC under matsmältningen och en högre koncentration av VRC under hybridisering. Tillägg av VRC i dessa två steg förbättrats konsekvensen av smFISH resultat, eventuellt genom att bättre bevara RNA-molekyler mot nuclease verksamhet, som kan införas genom zymolyase mixen (enzymet renas från rå extrakt och kan innehålla RNase föroreningar). Således rekommenderar vi använder mängden VRC enligt förteckningen i våra protokoll eller ännu högre koncentrationer av VRC för optimering.
En betydande del av cellerna kan förloras under tvätt stegen i både buffert B och formamid tvättbuffert. För att minska cellförlust, kunde man öka hastigheten med centrifugering. I vårt fall tvättar med en hög hastighet (21 000 x g) till pellet våra prover under buffert B betydligt reducerad cellförlust. Dock bli celler mycket bräcklig efter zymolyase matsmältningen, så du inte bör ändra centrifugeringsvarvtal. I stället föreslår vi att använda låg friktion rören från vetenskaplig USA, som kraftigt bidra till att pressa samman cellerna under tvättarna i formamid tvättbuffert. Våra protokoll kan sammantaget konsekvent generera en enskiktslager av celler tät nog för effektiv bildbehandling. Normalt 7 synfält bör ge > 130 celler lämplig för kvantifiering.
Avslutningsvis är det viktigt att fastställa de optimala parametrarna för och de utgångar som krävs från bildanalys. För att upptäcka smFISH ställen, publicerade analysprogram vanligen filtrera raw-bilder med Gaussisk kärna ta bort bakgrund signal och be användarna att fastställa signal-brus-förhållandet att använda för varje uppsättning bilder2,17. Tyvärr finns det inte för närvarande en enda standard genom vilken rätt parametrar bestäms, och så några empiriska tester av dessa olika inställningar krävs. Om du vill ange parametrar som behövs för varje av dessa steg, behöver man iterativt ingång olika uppsättningar av parametrar och kolla hur väl de resultat som erhålls från varje uppsättning matchar från manuell räknar i några representativa celler. När en uppsättning parametrar finns, kan det användas för de flesta av bilderna erhålls trots olika odlingsbetingelser och genetiska bakgrunder.
Dessutom kan man testa om maximal intensitet projektionen av smFISH bilder kan utföras före kvantifiering22. Detta steg förenklar plats upptäckt algoritm och avsevärt minskar tänkbar tid, men på bekostnad av vissa potentiellt användbar information om enskilda ställen, såsom deras subcellulär lokalisering. I vårt fall var antalet mRNA-molekyler som produceras av den NDC80 genen tillräckligt låg för att fläckarna var väl separerade efter denna behandling (inte ovanligt för avskrifter i spirande jäst3,7). I fall där colocalization analys är kritiska, behöver rörledningen analys bestämma placeringen av varje smFISH plats i varje kanal att bedöma colocalization. Beroende på de specifika frågorna uppmanas, annan information såsom intensiteten av varje plats kan också behöva extraheras från rörledningen för vidare analys. Optimera nyckeln steg i protokollet och rörledningen bild analys är avgörande att få hög kvalitet av smFISH data för att studera frågan av intresse.

Dynamisk reglering av genuttryck driver utvecklingen av en organism, liksom dess svar på miljömässig stress, infektion och förändringar i ämnesomsättningen. Studier som fokuserar på Transkriptionsreglering förlita dig på teknik som mäter RNA överflöd. En sådan metod, kallas enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH), används för identifiering av enskilda RNA-molekyler i enstaka celler1,2. Denna metod tillåter mätning av cell-till-cell variabiliteten i genuttryck och bestämning av intracellulära RNA lokalisering.
I den vanligaste smFISH tekniken kräver upptäckt av en enskild RNA-molekyl flera korta DNA sonder (ofta ~ 48 20-mer sonder) som kompletterar målet RNA och konjugeras till den samma fluorescerande färgen. Bindningen av en enda fluorescerande sond resulterar i svag signal, men signalen från ensemblen av alla sonderna är robust. Denna funktion förbättrar avsevärt det signal-brus-förhållandet eftersom även om en enda sond kan uppvisar off-target bindande, sådan signal är väntat till vara mycket svag jämfört med målet RNA molekylen3. Inom fel upptäckt, kan antalet RNA molekyler räknas och jämfört över olika odlingsbetingelser och bland olika mutanter.
Sedan dess första utveckling, har smFISH anpassats för att studera olika aspekter av gene expression4, såsom transkription töjning1,2, skarvning5,6, transkriptionell spricker7 , 8 , 9, intracellulära alleliska uttryck10,11,12och RNA lokalisering13,14,15. Nyligen, vi har använt denna metod för att studera uttrycket av två avskrift isoformer av samma gen, där den korta avskrift isoformen (NDC80ORF) har dess hela sekvensen som delas med den långa isoformen (NDC80luti )16. För att unikt identifiera de två mRNA-isoformerna, vi använde två sonden uppsättningar: en uppsättning är specifika för den unika sekvensen av NDC80luti, och den andra uppsättningen, konjugerat till en annan fluorescerande färgämne, binder till regionen gemensamma i de två isoformerna. Den NDC80luti RNA identifieras som en colocalized plats med båda fluorescerande signaler, medan de NDC80ORF RNA är en som innehåller bara signalen från den gemensamma probsats. Eftersom antalet den NDC80ORF avskrifter beräknas genom en ”subtraktion” metod, hög effektivitet av sonden hybridisering och en hög signal-brus-förhållande är nödvändiga för att säkert identifiera smFISH ställen och minska fel förökning.
Detta dokument beskriver en optimerad protokollet för att utföra smFISH i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. I detta protokoll, mobilnummer, fixering tid, koktiden, matsmältningen buffert, sond koncentration och hybridisering buffert som används för smFISH experiment var optimerad för SK1 stam bakgrund av S. cerevisiae som genomgår vegetativt tillväxt eller meios. Men vi noterar också i detta manuskript: (1) metod för att kontrollera kvaliteten på smFISH data efter bild förvärv och (2) stegen i det protokoll som kan kräva ytterligare optimering för annan stam bakgrunder och tillväxt villkorar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) är en kraftfull teknik för att studera genuttryck i enstaka celler på grund av dess förmåga att upptäcka och räkna enskilda RNA-molekyler. Komplement till djupa sekvensering-baserade metoder, smFISH ger information om cell till cell variationen i avskrift överflöd och subcellulär lokalisering av en given RNA. Nyligen har vi använt smFISH att studera uttrycket av genen NDC80 vid meios i spirande jäst, i vilken två avskrift isoformer finns och den korta avskrift isoformen har dess hela sekvensen som delas med den långa isoformen. För att säkert identifiera varje avskrift isoform, vi optimerade kända smFISH protokoll och erhålls hög konsekvens och kvalitet av smFISH data för de prover som förvärvats under spirande jäst meios. Här beskriver vi detta optimerade protokoll, de kriterier som vi använder för att avgöra om hög kvalitet av smFISH uppgifter har erhållits, och några tips för att genomföra detta protokoll i andra jäststammar och tillväxt villkorar.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detta enda molekyl fluorescens i situ hybridisering protokoll är optimerad för att kvantifiera antalet RNA-molekyler i spirande jäst under vegetativ tillväxt och meios.

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) och Spectral karyotypering (SKY) i bestrålade möss

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målinriktad<em&gt; In situ</em&gt; mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karaktärisera Histon posttranslationella modifieringen förändringar i jäst neurodegenerativa Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...