Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

المؤلف يود أن يشكر نييد فكتوريا التدفق الخلوي الأساسية والمرافق مهرب التدفق الخلوي الأساسية لصيانة وتشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية أدوات ومعدات الفرز؛ ماريا مونتيرو، هرشيني شارما، أغنية كيمي لخبراء المساعدة التقنية؛ مايكل بيتك، الابن (متوفى) للحصول على المساعدة مع سيف qPCR المقايسة التصميم؛ وكيلي براندون، وماثيو سكارلوتا لسيف عزل تسلسل. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاك المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.

ملاحظة: تخطيطي لسير العمل البروتوكول ويرد في الشكل 1. وهو يتألف من ثلاث خطوات رئيسية: نظام مراقبة الأصول الميدانية، الرايت وكدنا قبل التضخيم، و qPCR ليصل إلى 96 من الجينات في وقت واحد. يتم وصف إصدارين من البروتوكول، وفرز الخلايا في الحد من تخفيف وفرز الخلايا المفردة، بمزيد من ا...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

البروتوكول هو موضح هنا، يسمى تسسيبتري، يدمج كوانتيتيشن البروتين وحيد الخلية السطحية بتدفق مولتيباراميتير الخلوي مع خلية واحدة مرناً التعبير الكمي ب qPCR RT كبير متعدد. تمكن الاتحاد من هذه التقنيات اثنين لقطات عالية المحتوى لمجموع النسخي والشخصية البروتين من الخلايا المفردة في شكل الفائق. ?...

العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا تعتمد على إليه الخلية المضيفة للنسخ المتماثل، غالباً ما تغيير بيولوجيا الخلية المضيف أو استهداف الفئات السكانية الفرعية محددة جداً للخلايا المضيفة تحقيق أقصى قدر من الفرص لنشر. نتيجة لذلك خلية العمليات البيولوجية تعطلت عادة، مع عواقب ضارة على الصحة العامة للبلد المضيف. فهم التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة التي النسخ المتماثل سيتم توضيح آليات المرض يمكن أن يساعد في تطوير علاجات محسنة واستراتيجيات للوقاية من العدوى. الأدوات التحليلية المباشرة التي تمكن من دراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ضرورية نحو تحقيق هذه الغاية. تحليل خلية واحدة يوفر الوسيلة الوحيدة للسمة لا لبس فيه النمط الظاهري خلوية الوراثي خاصة، أو الإصابة بالحالة1. على سبيل المثال، الإصابات المسببة للأمراض كثيرا ما حمل التغييرات المباشرة وغير المباشرة على حد سواء في الخلايا المضيفة. ولذلك، التمييز بين الخلايا المصابة من نظرائهم غير مصاب ضروري لسمة التغييرات الخلية المضيفة للإصابة المباشرة أو الآثار الثانوية، مثل المعمم التهاب. وعلاوة على ذلك، للعديد من مسببات الأمراض، مثل سيف وفيروسات نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)، العدوى الخلية المضيفة العائدات من خلال مراحل متعددة، مثل مبكرة أو متأخرة، أو الكامنة، كل منها قد تتسم بالجينات متميزة والبروتين التعبير التشكيلات الجانبية2 , 3 , 4 , 5-سوف تفشل معظم التحليلات المخاليط خلية لالتقاط هذا التغاير6. على النقيض من ذلك، الغاية متعدد تحليلات خلية واحدة قادرة على التحديد الكمي للتعبير على حد سواء الفيروسية والجينات المضيفة توفر وسيلة لحل الاضطرابات الخلوية الخاصة بالعدوى، بما في ذلك الاختلافات عبر مراحل الإصابة. علاوة على ذلك، تحليل التفاعلات المضيف الممرض في الناحية الفسيولوجية الإعدادات ذات الصلة أمر بالغ الأهمية للتعرف على الأحداث التي تحدث في الكائنات الحية المصابة. وهكذا، الأساليب التي يمكن تطبيقها مباشرة السابقين فيفو يتم القبض على الأرجح أفضل في فيفو العمليات.
سيف، وفيروس نقص المناعة البشرية المستهدفة CD4+ تي الخلايا، التي هي التصدي للعوامل المضادة للفيروسات "تقييد" المضيف ومستضد downregulate تقديم جزيئات إثبات الإصابة بالإنتاجية وتجنب مراقبة محصنة ضد7،8، 9،،من1011. بدون علاج، نتائج العدوى في خسائر فادحة في خلايا CD4 الخلايا+ تي، وفي نهاية المطاف توجت حصل نقص المناعة المكتسب (الإيدز)12. في الإعداد للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية، تستمر الخلايا المصابة خفية الخزانات لعدة عقود، مما يشكل حاجزاً هائلا للاستراتيجيات العلاجية. فهم الخصائص في فيفو خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية/سيف لديه القدرة على الكشف عن ميزات الخلية المضيفة دوراً هاما في نشوء المرض واستمرار. ومع ذلك، هذا قد تم شديدة التحدي، أساسا بسبب low frequency للخلايا المصابة وعدم توفر والكواشف قادراً على سهولة التعرف عليها. الخلايا التي نسخ الرنا الفيروسي، يقدر أن يكون حاضرا عند 0.01 – 1% من خلايا CD4 خلايا+ تي في الدم والأنسجة اللمفاوية13،،من1415. تحت العلاج القمعية، الخلايا المصابة خفية حتى أقل تواترا في 10-3–10-7 16،،من1718. تلوين البروتينات الفيروسية فحوصات أن عمل جيدا لدراسة التهابات في المختبر ، مثل هفوة داخل الخلايا، دون المستوى الأمثل بسبب تلوين الخلفية من 0.01-0.1%، مماثلة أو أكبر من تواتر الخلايا المصابة13، 14. تلطيخ السطحية للبروتين الحياة الفطرية تتسم جيدا [مونوكلونل] الخاصة بالحياة الفطرية سيف، فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام أيضا ثبت أن تكون صعبة، المحتمل لأسباب مماثلة. في الآونة الأخيرة، أدوات مبتكرة تهدف إلى تحسين الكشف عن خلايا معربا عن هفوة أما عن طريق إدراج فحوصات محددة لهفوة الجيش الملكي النيبالي أو باستخدام بديل التصوير التكنولوجيات14،،من1519. بيد أن مثل هذا النهج لا تزال محدودة في عدد القياسات الكمية التي يؤديها في كل خلية.
هنا، يمكننا وصف المنهجية (1) يعرف واحدة من الخلايا المصابة بالفيروس مباشرة السابقين فيفو بالمورثات الفيروسية حساسة ومحددة الكمية قبكر و (2) يوضحها تعبير البروتينات السطحية تصل إلى 18 والجينات 96 لكل المصابين (و خلية غير مصاب). يجمع هذا المنهجية قياس البروتين وحيد الخلية السطحية بنظام مراقبة الأصول الميدانية متبوعاً بتحلل الخلية فورا واستخدام تحليل التعبير الجيني متعدد qPCR المستهدفة في النظام بيومارك. تكنولوجيا الدوائر المتكاملة فلويديك (IFC) يسمح كوانتيتيشن متعدد الجينات 96 من 96 عينة في وقت واحد، أنجزه مصفوفة دوائر 9,216 التي تتم ردود فعل qPCR الفردية. فرز الخلايا الحية نظام مراقبة الأصول الميدانية سجلات قياسات وفرة المحتوى عالي البروتين في حين الحفاظ على الترنسكربيتوم كامل لتحليل أداء فورا المصب. لتحديد الخلايا المصابة بالفيروسات، يتم تضمين فحوصات محددة للكشف الفيروسية المقسمة، وبدلاً من ذلك وأونسبليسيد (فرنا) في التحليل قبكر، جنبا إلى جنب مع فريق فحوصات المعرفة من قبل المستخدم التي بلغ مجموعها يصل إلى 96 الجينات، الحد الأقصى لعدد فحوصات يقيمون حاليا في المؤسسة المالية الدولية. تعبير الجينات والبروتين من المعلومات التي تم جمعها لكل خلية مرتبطة بالموقف جيدا. ونحن سابقا أفادت النتائج من هذا التحليل في مكان آخر20. هنا، نحن نقدم أكثر تفصيلاً المبادئ التوجيهية المنهجية، فضلا عن المزيد phenotyping وصفية لخلايا CD4 المصابة بسيف+ تي الخلايا.
يمكن تطبيق هذا النهج، الذي نحن على المدى تسسيبتري، لأن الإيقاف أي سكان خلية قابلة للتطبيق التفاعلي للأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي والتعبير عن الترنسكربيتوم متوافقة مع فحوصات qPCR المتاحة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لوصف الجينات التفاضلية والتعبير البروتين في خلايا نادرة أو خلايا لا يسهل تمييزها بعلامات البروتين السطحي. إعداد نموذج يعتمد على معيار تلطيخ بروتوكول استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً. سيتوميتيرس مع إمكانية فرز الخلايا المفردة أيضا متوفرة تجارياً، ولكن احتياطات السلامة الأحيائية إضافية مطلوبة من أجل معالجة الخلايا الحية المعدية. تسجيل ملف التعريف التعبير البروتين وحيد الخلية لكل خلية بالموقف جيدا، المشار إليها هنا كما فهرسة الفرز، سمة مشتركة لنظام مراقبة الأصول الميدانية المتاحة تجارياً فرز البرامج. التحليل الحسابي الجينات المضيف الأثران أعرب السكان خلية للفائدة ولا يرد هنا، ولكن ترد إحالات إلى أساليب نشرها مسبقاً.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

تحليل خلية واحدة أداة هامة لتشريح السكان غير متجانسة من الخلايا. تحديد وعزل خلايا نادرة يمكن أن يكون صعباً. للتغلب على هذا التحدي، الجمع بين منهجية فهرسة التدفق الخلوي والفائق متعدد الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). يهدف إلى تحديد وتوصيف فيروس نقص المناعة القردي (سيف)-إصابة خلايا موجودة داخل macaques الريسوسي. الخلايا المصابة بالفيروس من خلال كوانتيتيشن من البروتين السطحي بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ومرناً ب qPCR، يتم تحديدها بواسطة التعبير الجيني الفيروسي، الذي هو جنبا إلى جنب مع قياسات مضيف الجينات والبروتين لإنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد . نحن مصطلح نهج، وتقييم خلية واحدة بروتو النسخي المستهدفة، أو تسسيبتري. لتنفيذ هذه الطريقة، ملطخة خلايا قابلة للحياة مع الأجسام المضادة الفلورسنت محددة للعلامات السطحية المستخدمة لعزل نظام مراقبة الأصول الميدانية خلية فرعية و/أو تحليل المظهرية المتلقين للمعلومات. يتم فرز الخلايا المفردة تليها متعدد النسخ العكسي (RT) وبكر قبل التضخيم، تحلل فورا و qPCR إنتاجية عالية تصل إلى 96 من النصوص. سجلت في وقت الفرز قياسات نظام مراقبة الأصول الميدانية وبعد ذلك ترتبط بالبيانات التعبير الجيني بالموقف جيدا لخلق البروتين مجتمعة والنسخي الشخصية. دراسة المصابين بسيف الخلايا مباشرة فيفو السابقين، وحدد الخلايا الكشف qPCR متعددة الأنواع الرنا الفيروسي. الجمع بين النصوص الفيروسية وكمية كل منها توفير إطار لتصنيف الخلايا في مراحل متميزة من دورة الحياة الفيروسية (مثلالإنتاجية مقابل غير منتجة). وعلاوة على ذلك، كانت تسسيبتري سيف+ الخلايا مصابة بالمقارنة خلايا معزولة من العينة نفسها لتقييم المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. وكشف التحليل مقدر سابقا الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التعبير عدم التجانس بين الخلايا المصابة، وكذلك في فيفو تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال سيف بوساطة مع القرار خلية واحدة. طريقة تسسيبتري ذات الصلة لتحليل أي السكان خلية قابلة لتحديد الهوية بواسطة التعبير marker(s) البروتين السطحية، gene(s) المضيف أو الممرض، أو مزيج منها.

سير العمل للبروتوكول بأكمله هو مبين في الشكل 1. وهو يتألف من الاختلافات بين تعريف عدد من الخلايا التي تم فرزها: أما تمييع الحد أو كواحدة من الخلايا، كما هو موضح في النص. وترد أمثلة للتحقيق التمهيدي المؤهل التحليلات على إضعاف تخفيف الحمض النووي الريبي المسل...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس

وصف منهجية كوانتيتاتي الجينات 96 وأعرب 18 البروتينات السطحية من خلايا مفردة فيفو السابقين، مما يسمح للتعرف على خلطات الجينات والبروتينات في الخلايا المصابة بالفيروس بالنسبة للخلايا مصابة. نقوم بتطبيق نهج لدراسة CD4 المصابة بسيف+ تي الخلايا المعزولة من macaques الريسوسي.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعلات التي تتم بين المضيفين والأمراض مثل ما هي الخصائص الفريدة للخلايا المصابة بشكل منتج، وما تسمح العوامل المساعدة المضيفة للفيروسات بإنشاء عدوى منتجة، وكيفية استهداف هذه الخلايا في التدخلات العلاجية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر مقاييس كمية لكل من البروتين والميرنا داخل الخلايا المفردة، ومعظم الكواشف متاحة تجاريا. إثبات إجراء فرز الخلايا سيكون ماثيو كريغان، وهو فني كبير من جوهر تدفق الخلايا في مختبر الطبيب مايكل إيلر.للبدء ، في محطة عمل البيولوجيا الجزيئية قبل PCR المعينة ، وإعداد مزيج من الفحص من خلال الجمع بين 96 مُجراً في 96 مُجرّيات التعبير الجيني في RNase ، أنبوب حر DNase مع التأكد من إضافة كل مقايسة إلى تركيز نهائي من 180 نانوموللار من البهائم الأمامية والالعكسية. إضافة العازلة تعليق الحمض النووي لتحقيق التخفيف المناسب من مزيج المقايسة. لكل من المتوقع 96 من 96 رقاقة مجموعة، ماص ستة ميكرولترات من كل مقايسة في بئر معين من 96 بئر لوحة PCR، ثم ختم لوحة مع لاصقة.لبدء السطح تلطيخ الخلايا القابلة للحياة، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ثقافة الأنسجة، أولا إعداد عينات التعويض ومزيج رئيسي من كوكتيل الأجسام المضادة الفلورية كما هو مبين في بروتوكول النص. اذيب الخلايا المبردة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، إضافة بين 5 واثنين ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.جهاز طرد مركزي في 500 G لمدة ثلاث دقائق في 25 درجة مئوية، ثم الpirate برنامج تلفزيوني وإعادة تثبيت بيليه في ثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني جديد. نقل هذا الخليط إلى أنبوب البوليسترين 5 ملليلتر. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 500 G لمدة ثلاث دقائق في 25 درجة مئوية.استلهمت المُتطّع، تاركةً ما يقرب من 10 ميكروليترز متبقية من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، إعادة تعليق ما يصل إلى 20 مليون خلية مغسولة في 80 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 25 درجة مئوية في حين محمية من الضوء.بعد هذا، إضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي في 500 G لمدة ثلاث دقائق ويتبخر المابير. إعادة اعتماد الخلايا بدقة في 300 إلى 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.تصفية هذا الحل عن طريق الأنابيب من خلال 35 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون. ثم إبقاء الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز. مرة أخرى في محطة العمل قبل PCR، أولاً إعداد مزيج رد فعل PREAMP RT في RNase واحد، DNase أنبوب عقيم الحرة كما هو مبين في بروتوكول النص.باستخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء 10 ميكرولترات من هذا المزيج التفاعل في العدد المطلوب من 96 جيدا لوحات فرز PCR. ختم لوحة مع فيلم لاصق ومن ثم وضع لوحة على كتلة 96 الألومنيوم ما قبل المبردة جيدا. بعد ذلك، تأسيس نظام جسور فرز الخلايا وإعداد تدفق فرز الخلايا الخلوية كما هو موضح في بروتوكول النص.أدخل إعدادات الأداة المناسبة لتحديد عدد الخلايا التي سيتم فرزها في كل بئر وفرزها. إزالة الختم لاصق، ثم FACS فرز الخلايا في لوحات مجموعة PCR 96 جيدا أعدت. إعادة التصاق لوحة مع فيلم لاصقة جديدة.فورًا، دوامة اللوحة التي أعيد طلاؤها، ثم جهاز الطرد المركزي على 2000 جيجا لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. ثيرموسيت لوحة في جهاز PCR مع غطاء محمّى مسبقاً في 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وأخيرا، الحرارية لمدة 18 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، ثم في محطة عمل ما بعد PCR، ونقل خمسة ميكرولترات من cDNA إلى 20 ميكرولترات من الحمض النووي العازلة تعليق في لوحة جديدة 96 جيدا PCR.للبدء، إعداد لوحة المقايسة qPCR عن طريق الأنابيب أربعة microliters من كاشف تحميل المقايسة في كل بئر. بعد ذلك، قم بنقل أربعة ميكروليترات من كل مقايسة من لوحة المقايسة 2X إلى لوحة qPCR. الحفاظ على لوحة المقايسة qPCR عند أربع درجات مئوية.الاستغناء عن سوائل خط التحكم من الحقن فتيلة في صمامات المداهمة اثنين من رقاقة. إزالة البلاستيك واقية من تحت لوحة. ضع الرقاقة على وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية مع الجانب المُرقم في موضع A1، ثم حدد البرنامج النصي الرئيسي وتشغيله.لكل رقاقة microfluidic، مزيج 50 ميكرولترات من كاشف تحميل العينة مع 500 ميكرولترات من مزيج ماجستير PCR لإعداد مزيج رد الفعل في الوقت الحقيقي. Pipette 4.4 ميكرولترات من هذا المزيج رد فعل في كل بئر من جديد 96 جيدا لوحة PCR المعينة الآن كلوحة عينة. المقبل، ماصة 3.6 ميكرولترات من cDNA المخفف سابقا في كل بئر من لوحة العينة.بعد هذا، نقل خمسة ميكرولترات من لوحة المقايسة إلى بئر المقابلة على الجانب من رقاقة. نقل خمسة ميكروليتر من لوحة العينة إلى البئر المقابلة على الجانب الآخر من الشريحة. إدراج رقاقة تحميل في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية وتشغيل البرنامج النصي مزيج تحميل.بعد ذلك ، قم بنقل الشريحة إلى منصة BioMark وقم بإعداد الأداة كما هو موضح في بروتوكول النص ، ثم احفظ ملف تشغيل الشريحة في مجلد معين. عند اكتمال تشغيل رقاقة، فتح في الوقت الحقيقي PCR تحليل البرمجيات ثم حدد الملف، فتح، لفتح chiprun. bml الملف.في الزاوية اليسرى العليا من نافذة البرنامج، حدد موقع مستكشف الرقاقة وملخص تشغيل الشريحة. تحت ملخص تشغيل رقاقة، انقر على إعداد كاشف. ضمن المهمة، انقر فوق جديد وحدد نوع حاوية SBS لوحة و حاوية تنسيق SBS 96.انقر على الزر مع علامة القطع بجانب التعيين، ثم حدد M96-Assay-SBS96.dsp. انقر على طرق عرض التحليل. في علامة التبويب qPCR تحت المهمة، حدد تصحيح خط الأساس للأسلوب المشتق الخطي وعتبة CT للكشف عن المستخدم.في علامة التبويب عتبات CT، تحقق من تهيئة مع تلقائي ثم انقر فوق الزر تحليل. في الربع الأيمن العلوي من طرق عرض التحليل، انقر على علامة التبويب الثانية، جدول النتائج. من القائمة المنسدلة، حدد عرض الخريطة الحرارية وستظهر الخريطة الحرارية مع البيانات.تحت خريطة الحرارة، انقر فوق الرسم البياني العتبة وسجل. اضبط عتبات التصوير المقطعي يدوياً لكل كاشف بالنقر على المقايسات، التي تمثلها الأعمدة على الخريطة الحرارية، وسحب العتبة حسب الضرورة لتتقاطع مع منحنيات التضخيم في المرحلة الأسية. عند الانتهاء، انقر فوق تحليل.بعد ذلك، قم بتصدير بيانات qPCR كملف csv. نقل بيانات qPCR من الكمبيوتر BioMark إلى سطح المكتب الخاص بك. استيراد البيانات إلى جدول بيانات أو برنامج تحليل إحصائي وخريطة النتائج حسب العينة ومواضع الفحص على الشريحة.إنشاء عمود جديد واستخدام صيغة شرطية لتنظيم الخلايا في مجموعات على أساس التعبير عن الجينات الفيروسية. تحت التحليل، حدد احتواء Y بواسطة X و رسم التعبير الجيني مقابل المجموعة. بعد ذلك، استخدم FlowJo الإصدار 9 لفتح FCS الملفات من FACS الفرز المقابلة للوحة 96 جيدا.مع تمييز اسم الملف، حدد النظام الأساسي، بوابة رقم الحدث، وقم بإنشاء بوابات فرز مفهرسة. ستظهر الخلايا الفردية معروضة بالصف. تسليط الضوء على جميع الخلايا 96 ثم حدد مساحة العمل ، والتصدير ، حدد جميع الطوابق التعويض.ضمن البيانات، حدد ملف FCS، وانقر فوق تصدير، وحدد مجلد معين. اسحب ملفات FCS الجديدة للخلايا الفردية إلى مساحة عمل FlowJo جديدة. تمييز كافة الخلايا وانقر فوق إضافة إحصائيات، ممثلة بزر سيجما، ومتوسط، وجميع معلمات الفلوريسنس.افتح محرر الجدول، ثم قم بتمييز كافة طوابق الخلية الأولى واسحبها إلى نافذة محرر الجدول. في هذا الإطار، انقر فوق إنشاء وعرض الجدول. بعد ذلك، نسخ وإخراج في برنامج إحصائي إما عن طريق نسخ اللصق أو عن طريق النقر على زر حفظ وبدء التطبيق.دمج بيانات FACS الخلية الواحدة مع بيانات qPCR في JMP من خلال رقم اللوحة ووضع البئر. وأخيرا، قم بإجراء تحليلات رسومية وإحصائية على البيانات المجمعة. في هذه الدراسة، تتكامل كمية بروتين سطح الخلية المفردة بواسطة قياس تدفق متعدد المعلمة مع تعبير مرنا أحادي الخلية الكمي بواسطة RTqPCR متعدد للغاية.يظهر هنا هو وحيد خلية كمية التعبير الجيني الفيروسي من FACS فرز ريسوس المكاك CD4 الخلايا T إيجابية. تات / rev إيجابية N من الخلايا السلبية التعبير عن نسخ أقل من تات / ريف الجيش الملكي النيبالي من N من الخلايا الإيجابية في الأخضر الداكن الذي يتفق مع مرحلة مبكرة من العدوى قبل تحقيق الاستقرار وتصدير النووية من الحمض النووي الريبي الفيروسية جزئيا. وهناك وفرة عالية من هغ-RNA غير مُبجَّه في تات/ ريف إيجابية N من الخلايا الإيجابية يتسق مع مرحلة متأخرة من العدوى المنتجة التي يتم خلالها التعبير عن الحمض النووي الريبي الجينومي وفيرة وتعبئتها في فيرة في مهدها.هذه المؤامرة ثلاثي المتغيرات عرض الجين الفيروسي خلية واحدة، الجينات المضيفة، ومضيف تعبير البروتين السطح يظهر أن سطح CD4 و CD3 بروتين التعبير انخفض في تات / ريف الخلايا الإيجابية المعروضة باللون الأخضر على الرغم من CD4 وD3 يتم الحفاظ على النصوص. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في يومين إلى ثلاثة أيام. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ تقييم بروتونسكريونيونية خلية واحدة مستهدفة لمعالجة الأسئلة المتعلقة الجينات والبروتينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في الخلايا المصابة بالفيروس.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

المعجل نوع 1 الحث السكري في الفئران عن طريق نقل بالتبني من CD4 + T خلايا سكري

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...