Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

作者要感谢 NIAID VRC 流式细胞术核心和 MHRP 流式细胞仪核心设施, 以维护和操作的外地仪器和分拣设备;玛丽亚蒙特罗, Vishakha 夏尔马, 凯美歌曲为专家技术协助;迈克尔 Piatak (已故) 协助与 SIV qPCR 化验设计;布兰登上基尔和马修 Scarlotta 为 SIV 隔离序列。所表达的观点是作者的意见, 不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。根据《动物福利法》和与动物有关的动物和实验的其他联邦法规和条例, 在 AAALAC 认可的设施中进行了一项经批准的动物使用议定书的研究, 并遵守原则《实验室动物护理和使用指南》 (NRC) 发表, 2011 版。

注意: 协议工作流的示意图如图 1所示。它由三个主要步骤组成: qPCR、RT 和 cDNA 预扩, 同时可同时为多达96种基因提供。在步骤5和步骤6中, 分别详细描述了两个版本的协议, 对单元格进行限制稀释和对单个单元格进行排序。这些策略针对不同的研究问题, 但遵循类似的程序。
1. 先决条件或以前的分析
<ol><li>验证所有的基因表达化验, 如前所述...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. 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这里描述的协议, 称为 tSCEPTRE, 集成单细胞表面蛋白定量的多参数流式细胞仪与数量单一细胞 mRNA 表达的高复用 RT qPCR。这两种技术的结合使高容量的单细胞转录和蛋白质剖面快照具有高通量格式。我们使用该方法来识别在体内感染 SIV 的迄今难以捉摸的细胞, 并描述差异表达的宿主基因和蛋白质。该协议可用于研究任何感兴趣的细胞群体, 其表达的表面蛋白, mRNA, 或其组合。采用流式细胞仪?...

许多胞内病原体依赖宿主细胞机械进行复制, 经常改变宿主细胞生物学, 或针对宿主细胞的非常特定的亚群, 以最大限度地提高它们的传播几率。因此, 细胞生物学过程通常被打乱, 对宿主的整体健康造成有害影响。了解病毒与它们复制的宿主细胞之间的相互作用将阐明可能有助于发展改进的治疗方法和预防感染的策略的疾病机制。能够研究寄主-病原体相互作用的直接分析工具对这一目的至关重要。单细胞分析提供了唯一的方法, 明确地将细胞表型归因于特定基因型, 或感染状态1。例如, 病原体感染经常引起宿主细胞的直接和间接变化。因此, 区分受感染细胞与未感染的对应者是必要的, 将宿主细胞的变化归因于直接感染或次生效应, 如广泛性炎症。此外, 对许多病原体, 如 SIV 和人体免疫机能丧失病毒 (HIV), 宿主细胞感染通过多个阶段, 如早期, 晚期, 或潜伏, 其中每一个可能的特点是不同的基因和蛋白表达谱2,3,4,5. 对细胞混合物的大量分析将无法捕获这种异质性6。相比之下, 高度复用的单细胞分析能够量化病毒和宿主基因的表达, 提供了一种方法来解决感染特定的细胞扰动, 包括跨感染阶段的变化。此外, 分析宿主-病原体在生理相关设置中的相互作用对于鉴定发生在受感染生物体中的事件至关重要。因此, 可以直接应用于体内的方法很可能在体内过程中获得最佳的捕获。
SIV 和 HIV 靶 CD4+ T 细胞, 他们抵消宿主抗病毒 "限制" 因素和 downregulate 抗原提出分子, 以建立生产性感染和避免免疫监测7,8, 9,10,11。如果没有治疗, 感染会导致 CD4 和 T 细胞的大量损失, 最终达到后天免疫机能丧失综合症 (艾滋病)12的高潮。在抗逆转录病毒治疗的设置中, 潜伏感染的细胞库持续了数十年, 给治疗策略带来了巨大的障碍。了解体内艾滋病毒/SIV 感染细胞的性质, 有可能揭示宿主细胞的功能在发病机制和持久性。然而, 这是非常有挑战性的, 主要是由于感染细胞的频率低和缺乏试剂能够轻易辨认出来。转录病毒 RNA 的细胞, 估计是存在于血液和淋巴组织的 CD4+ T 细胞的 0.01–1%13,14,15。在压制疗法下, 潜伏感染细胞在 10-3–10-7 16,17,18, 更不频繁。用于研究体外感染的病毒蛋白染色方法, 例如胞内封堵, 由于0.01–0.1% 的背景染色, 类似或大于感染细胞13的频率, 是次优, 14。使用具有良好特征的 SIV/HIV 病毒特定单克隆抗体的表面染色也被证明是困难的, 可能是出于类似的原因。最近, 新的工具的目的是改善检测的细胞表达的插科打诨, 要么纳入特定的化验方法, 或使用替代成像技术14,15,19。然而, 这些方法在对每个细胞进行的定量测量数量上仍然有限。
在这里, 我们描述了 (1) 通过敏感和特异的病毒基因定量 qPCR 识别单个病毒感染细胞的方法, (2) 量化了多达18种表面蛋白和96个基因的表达, 每个感染者 (和未感染) 细胞。这种方法结合了单细胞表面蛋白的测量, 其次是立即细胞裂解和基因表达分析使用多路定向 qPCR Biomark 系统。集成的射流电路 (IFC) 技术允许96个基因的多重定量从96个样品同时, 完成由9216个室的矩阵, 其中个体 qPCR 反应被执行。活细胞转录的分类记录高含量的蛋白质丰度测量, 同时保留整个进行分析后立即进行下游。为了识别受病毒感染的细胞, 在 qPCR 分析中包括了用于交替拼接和 unspliced 病毒 rna (vRNA) 的特定化验, 连同一组用户定义的化验, 总计多达96个基因, 目前所容纳的最大化验数量国际金融公司。为每个细胞收集的基因表达和蛋白质信息是由良好的位置联系在一起的。我们以前在别处报告了这一分析结果20。在这里, 我们提供更详细的方法学指导和进一步描述分型的 SIV 感染 CD4+ T 细胞。
这种方法, 我们的期限 tSCEPTRE, 可以适用于任何可行的细胞群体的悬浮反应荧光标记抗体和表达转录兼容可用 qPCR 化验。例如, 它可以用来表征在稀有细胞中的差异基因和蛋白质表达, 而不容易与表面蛋白标记区分的细胞。样品准备依赖于标准染色协议使用商业上可用的抗体。具有单细胞分拣能力的 Cytometers 也可以在商业上获得, 但是处理传染性活细胞需要额外的生物安全预防措施。通过井位记录每个单元格的单细胞蛋白表达谱, 此处称为索引排序, 是商业上可使用的流式程序排序软件的一个常见特征。在感兴趣的细胞群中差异表达宿主基因的计算分析这里没有描述, 但参考被提供给以前发布的方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

单细胞分析是解剖细胞异质种群的重要工具。稀有细胞的鉴别和分离可能是困难的。为克服这一挑战, 开发了一种结合指数流式细胞仪和高通量多路聚合酶链反应 (qPCR) 的方法。目的是确定和鉴定猕猴体内存在的猿猴免疫机能丧失病毒 (SIV) 感染细胞。通过荧光活化细胞分选 (qPCR) 和 mRNA 对表面蛋白进行定量测定, 通过病毒基因表达识别病毒感染细胞, 并与宿主基因和蛋白质测量相结合, 创建多维剖面图。.我们的方法, 目标单细胞 Proteo 转录评价, 或 tSCEPTRE。为了执行该方法, 活细胞被染色的荧光抗体特定的表面标记用于外地的细胞子集和/或下游表型分析隔离。单细胞排序后, 立即裂解, 多重反转转录 (RT), PCR 预扩, 高通量 qPCR 高达96成绩单。在分类时记录了这些测量结果, 然后通过良好的位置与基因表达数据联系在一起, 形成了蛋白质和转录剖面的组合。通过对多种病毒 RNA 种类的qPCR 检测, 对细胞进行直接的体外研究。病毒转录和数量的结合提供了一个框架, 将细胞划分为病毒生命周期的不同阶段 (例如, 生产性与非生产性)。此外, 将 SIV+细胞的 tSCEPTRE 与同标本分离的未感染细胞进行比较, 以评估差异表达的宿主基因和蛋白质。分析表明, 以前不赏识病毒 RNA 表达的异质性之间的感染细胞, 以及体内SIV 介导的转录后基因调节与单细胞分辨率。tSCEPTRE 方法适用于通过表达表面蛋白标记, 宿主或病原体基因, 或其组合, 对任何能够识别的细胞群体进行分析。

图 1描述了整个协议的工作流。它由被排序的单元数定义的两个变体: 限制稀释或作为单个单元格, 如文本中所述。如图 2所示, 2 倍串行 RNA 稀释的引物探针鉴定分析的例子。图 3显示了用于识别潜在的 SIV+单元格的浇口策略。如图 4所示, 一个成功的、次优和失败的质量控制 qPC...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

猕猴免疫缺陷病毒感染 CD4+ T 细胞单细胞定量的 mRNA 和表面蛋白的表达

描述的方法, 以定量的表达96基因和18表面蛋白的单细胞前体, 允许鉴定差异表达基因和蛋白质的病毒感染细胞相对未感染的细胞。我们采用这种方法来研究与恒河猴分离的 SIV 感染的 CD4+ T 细胞。

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

此方法可以帮助回答宿主-病原体相互作用领域的关键问题，例如，高效感染细胞的独特特征是什么，宿主辅助因子允许病毒建立生产性感染，以及如何在治疗干预中针对这些细胞。该技术的主要优点是，它为单细胞内的蛋白质和mRNA提供定量测量，而且大多数试剂都是市售的。演示细胞分拣程序将是马修·克里根，一个高级技术员从流动细胞学核心在医生迈克尔·埃勒的实验室。首先，在指定的PCR前分子生物学工作站中，通过将96个基因表达检测组合成RNase、DNase自由管来准备检测组合，确保将每个测定添加到180纳米摩尔的正向和反向底转的最终浓度中。添加DNA悬浮液缓冲液，实现测定混合物的适当稀释。对于每个预期的 96 由 96 芯片阵列，移液器每个检测的 6 微升到 96 井 PCR 板的指定井中，然后用粘合剂密封板。要开始表面染色可行的细胞，在组织培养生物安全柜中，首先准备补偿样品和荧光抗体鸡尾酒的主混合物，如文本协议中所述。在37摄氏度的水浴中解冻冷冻细胞两分钟。在此之后，将5至2毫升的细胞悬浮液加入含有12毫升PBS的15毫升管中。在 500 G 下在 25 摄氏度下离心 3 分钟，然后吸气 PBS，然后用三毫升新鲜 PBS 将颗粒重新暂停。将这种混合物转移到五毫升聚苯乙烯管中。在25摄氏度下再次在500G下离心3分钟。吸升液，留下约10微升残余PBS。接下来，在80微升抗体鸡尾酒中重新增殖多达2000万个洗涤细胞。在25摄氏度下孵育20分钟，同时防止光线。在此之后，添加三毫升的 PBS。在500G下离心3分钟，吸上一代。在 300 到 500 微升 PBS 中彻底重新暂停细胞。通过 35 微米尼龙电池过滤器盖进行移液过滤此溶液。然后把细胞放在冰上， 防止光线， 直到排序。回到 PCR 前工作站，首先在单个 RNase、无 DNase 无菌管中准备 RT 预置反应混合物，如文本协议中所述。使用多通道移液器，将 10 微升这种反应混合到所需的 96 孔 PCR 排序收集板中。用胶粘膜密封板，然后将板放在预冷却的 96 井铝块上。在此之后，建立细胞分拣门控方案，并准备文本协议中概述的流动细胞计量细胞分拣器。输入适当的仪器设置，指定要排序到每个井中的单元格的数量和子集。拆下胶粘剂密封，然后 FACS 将电池分拣到准备好的 96 孔 PCR 收集板中。用新鲜的胶粘膜重新密封板。立即旋转重新密封的板，然后在2000 G下在4摄氏度下离心1分钟。在 PCR 机器中热循环板，在 50 摄氏度下预热盖子 15 分钟，然后加热 95 摄氏度 2 分钟。最后，热循环18个周期95摄氏度，15秒60摄氏度4分钟，然后在PCR后工作站，将5微升cDNA转移到20微升DNA悬浮缓冲液中，在一个新的96井PCR板中。首先，通过在每一井中移液四微升的测定加载试剂来准备 qPCR 检测板。接下来，将每个测定的四微升从 2X 检测板转移到 qPCR 板。将 qPCR 检测板保持在 4 摄氏度。将控制管路液体从吸油注射器分配到芯片的两个进气阀中。从板下取下保护塑料。将芯片放在 IFC 控制器上，将刻口侧放在 A1 位置，然后选择并运行主脚本。对于每个微流体芯片，将样品加载试剂的 50 微升与 500 微升的 PCR 主混合混合，以准备实时反应组合。这种反应的移液器 4.4 微升混合到新的 96 井 PCR 板的每个井中，现在指定为样品板。接下来，移液器3.6微升的先前稀释的cDNA进入样品板的每个井。在此之后，将五微升从检测板转移到芯片的切头侧的相应井。将样品板中的五微升转移到芯片另一侧的相应井中。将加载的芯片插入 IFC 控制器并运行负载混合脚本。接下来，将芯片传输到 BioMark 平台，并设置文本协议中概述的仪器，然后将芯片运行文件保存在指定的文件夹中。芯片运行完成后，打开实时PCR分析软件，然后选择文件，打开，打开芯片运行。bml 文件。在软件窗口的左上角，定位芯片资源管理器和芯片运行摘要。在芯片运行摘要下，单击探测器设置。在"任务"下，单击"新"并选择容器类型 SBS 板和容器格式 SBS 96。单击映射旁边的省略号按钮，然后选择 M96-Assay-SBS96.dsp。单击分析视图。在任务下的 qPCR 选项卡中，为用户探测器选择线性导数和 CT 阈值方法的基线校正。在 CT 阈值选项卡中，使用自动框检查初始化，然后单击分析按钮。在分析视图的右上象限中，单击第二个选项卡结果表。从下拉菜单中，选择热图视图，将显示包含数据的热图。在热图下，单击阈值和日志图。通过单击由热图上的列表示的测定，并根据需要拖动阈值以与指数相中的放大曲线相交，手动调整每个检测器的 CT 阈值。完成后，单击"分析"。接下来，将 qPCR 数据导出为 csv 文件。将 qPCR 数据从 BioMark 计算机传输到桌面。将数据导入电子表格或统计分析软件，并按芯片上的样本和分析位置绘制结果图。创建一个新列，并使用条件公式根据病毒基因的表达将细胞组织成组。在分析下，选择适合Y X 和绘制基因表达与组。在此之后，使用 FlowJo 版本 9 打开来自 FACS 的 FCS 文件，这些文件排序对应于 96 井板。突出显示文件名后，选择平台、事件编号门，并创建索引排序门。单个单元格将显示为行。突出显示所有 96 个单元格，然后选择工作区、导出、选择所有补偿楼层。在"数据"下，选择 FCS 文件，单击"导出"，然后选择指定文件夹。将单个单元格的新 FCS 文件拖入新的 FlowJo 工作区。突出显示所有单元格并单击添加统计信息，由西格玛按钮、均值和所有荧光参数表示。打开表编辑器，然后突出显示第一个单元格的所有楼层，并将其拖动到表编辑器窗口中。在此窗口中，单击"创建和查看表"。在此之后，通过复制粘贴或单击保存和启动应用程序按钮，复制并输出到统计软件中。将单单元 FACS 数据与 JMP 中的 qPCR 数据（按板号和井位置）合并。最后，对组合数据进行图形化和统计分析。本研究通过多参数流式细胞学进行单细胞表面蛋白质定量，通过高多路复用RTqPCR与定量单细胞mRNA表达进行整合。这里显示的是单细胞定量病毒基因表达从FACS排序的Rhus猴CD4阳性T细胞。阴性细胞的Tat/rev阳性N比深绿色阳性细胞的N份少，这与稳定前的早期感染和部分拼接病毒RNA的核出口一致。在阳性细胞的tat/rev阳性N中，大量未复制的Gag-RNA与晚期生产性感染一致，在此期间，丰富的基因组RNA被表达并包装成萌芽的病毒。显示单细胞病毒基因、宿主基因和宿主表面蛋白表达的三变量图显示，即使CD4和CD3转录保持，表面CD4和CD3蛋白表达在绿色显示的tat/rev阳性细胞中也减少。一旦掌握了，这项技术可以在两到三天内完成。看完这段视频后，您应该对如何进行有针对性的单细胞原体评估有一个良好的理解，以解决与病毒感染细胞中的不同表达基因和蛋白质有关的问题。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

多色流流式细胞仪分析细胞在恒河猴的免疫应答

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

科研

免疫与感染

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T细胞受体在小鼠T细胞的逆转录病毒转导

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

制备和使用艾滋病毒感染主的CD4 + T细胞作为靶细胞，自然杀伤细胞的细胞毒性检测

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

定量高通量单细胞的细胞毒性T细胞的测定

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

加速1型糖尿病感应在小鼠体内的过继转移致糖尿病的CD4 + T细胞

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

腺病毒转导朴素的CD4 T细胞调节性T细胞分化研究

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

隔离和幼稚的CD4 T细胞的Th17细胞分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高</sup&gt; T细胞免疫缺陷小鼠

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

鼠标朴素CD4<sup&gt; +</sup&gt; T细胞分离和<em&gt;在体外</em&gt;分化为T细胞亚群

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

表型和慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠中分离激活调节性T细胞的功能分析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...