Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

De auteurs bedank de NIAID VRC Stroom Cytometry kern en de MHRP Stroom Cytometry Core voorzieningen voor onderhoud en werking van FACS instrumenten en sorteermachines; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song voor deskundige technische bijstand; Michael Piatak, Jr. (overleden) voor hulp bij SIV ontwerp voor de bepaling van de qPCR; en Brandon Keele en Matthew Scarlotta voor SIV isoleren sequenties. De standpunten zijn die van de auteurs en mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen de standpunten van het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een protocol van de goedgekeurde dierlijke gebruik in een AAALAC geaccrediteerde faciliteit met inachtneming van de Animal Welfare Act, federale statuten en andere voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten waarbij dieren en houdt zich aan de beginselen vermeld in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC publicatie 2011 editie.

Opmerking: Een schematische voorstelling van de protocol-werkstroom wordt weergegeven in Figuur 1. Het bestaat uit drie belangrijkste stappen: FACS, RT en cDNA pre versterking en qPCR voor maximaal 96 genen tegelijk. Twee versies van het protocol, sorteren van cellen in de verdunningen te beperken en sorteren van de afzonderlijke cellen, zijn meer gedetailleerd beschreven in stap 5 en 6, respectievelijk. Deze strategieën richten verschillende onderzoeksvragen maar soortgelijke procedures vo...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

Het protocol hier beschreven, genoemd tSCEPTRE, eencellige oppervlakte-proteïne kwantificatie integreert door multiparameter stroom cytometry met kwantitatieve eencellige mRNA uitdrukking door zeer multiplexed RT-qPCR. De vereniging van deze twee technologieën kunt momentopnamen van hoge-inhoud van de gecombineerde transcriptionele en eiwit Profiel van afzonderlijke cellen in de indeling van een hoge gegevensdoorvoer. Wij gebruiken de methode voorheen ongrijpbare cellen geïnfecteerd met SIV in vivoopsporen, e...

Vele intracellulaire pathogenen rekenen op gastheer cel machines te repliceren, vaak veranderen van de biologie van de cel van de host of gericht op zeer specifieke subpopulaties van cellen van de gastheer te maximaliseren van hun kansen op vermeerdering. Cel biologische processen zijn daardoor vaak verstoord, met schadelijke gevolgen voor de algehele gezondheid van de gastheer. Begrijpen van de interacties tussen virussen en de cellen van de gastheer waarin ze repliceren zal toelichten ziekte mechanismen die bij de ontwikkeling van verbeterde therapieën en strategieën helpen kunnen om infectie te voorkomen. Directe analytische hulpmiddelen waarmee de studie van gastheer-pathogeen interacties zijn essentieel aan dit einde. Eencellige analyse biedt het enige middel ondubbelzinnig een cellulaire fenotype toeschrijven aan een bepaald genotype of infectie status1. Bijvoorbeeld, veroorzaken pathogene infecties vaak zowel directe als indirecte veranderingen in de cellen van de gastheer. Daarom onderscheid te maken geïnfecteerde cellen van hun niet-geïnfecteerde tegenhangers is noodzakelijk om te host cel kenmerkwijzigingen directe infectie of secundaire effecten, zoals veralgemeende ontsteking. Bovendien, voor veel ziekteverwekkers, zoals SIV en human immunodeficiency virus (HIV), host cel infectie verloopt via meerdere fasen, zoals vroeg, laat of latent, elk waarvan kan worden gekenmerkt door verschillende gen- en eiwit expressie profielen2 , 3 , 4 , 5. bulk analyses van cel mengsels te vangen deze heterogeniteit6zal mislukken. Daarentegen zeer multiplexed eencellige analyses kunnen kwantificeren van de expressie van zowel virale en host genen bieden een middel om op te lossen infectie-specifieke cellulaire verstoringen, met inbegrip van variaties in stadia van de infectie. Verder, gastheer-pathogeen interacties in fysiologisch analyseren relevante instellingen is van cruciaal belang voor de identificatie van gebeurtenissen die zich in besmette organismen voordoen. Dus, methoden die kunnen worden toegepast direct ex vivo zijn waarschijnlijk beste vastleggen in vivo verwerkt.
SIV en HIV gericht CD4+ T cellen, waarin ze tegen gastheer antivirale "beperking" factoren en downregulate antigeen presentatie van moleculen te stellen productieve infectie voorkomen immuun toezicht7,8, 9,10,11. Zonder behandeling, de infectie resulteert in massale verlies van CD4+ T-cellen, uiteindelijk culminerend in verworven immunodeficiency syndrome (AIDS)12. In de omgeving van antiretrovirale therapie aanhouden latent geïnfecteerde cel reservoirs voor decennia, een geduchte barrière voor curatieve strategieën poseren. Inzicht in de eigenschappen van in vivo HIV/SIV-geïnfecteerde cellen heeft het potentieel om het onthullen van de ontvangende cel functies instrumentale in de pathogenese en volharding. Echter, dit heeft zijn zeer uitdagend, voornamelijk te wijten aan de low frequency van geïnfecteerde cellen en gebrek aan reagentia kunnen gemakkelijk om ze te identificeren. Cellen die viraal RNA, transcriberen naar schatting aanwezig zijn op 0,01 – 1% van CD4+ T cellen in bloed en lymfoïde weefsel13,14,15. Onder onderdrukkende therapie zijn latent geïnfecteerde cellen zelfs minder frequent op 10-3–10-7 16,17,18. Virale eiwit kleuring testen zijn werk goed voor het bestuderen van in vitro infecties, zoals intracellulaire Gag, suboptimaal is toe te schrijven aan de achtergrondkleuring van 0.01-0,1%, gelijk aan of groter is dan de frequentie van de geïnfecteerde cellen13, 14. Oppervlakte kleuring voor Env eiwit met goed gekarakteriseerd SIV/HIV Env-specifieke monoklonale antilichamen ook bewezen moeilijk te zijn, waarschijnlijk om dezelfde redenen. Onlangs, roman tools willen verbeteren van de opsporing van cellen uiten Gag door hetzij integratie testen specifiek voor gag RNA of met behulp van alternatieve imaging technologieën14,15,19. Een dergelijke aanpak blijven echter beperkt in het aantal kwantitatieve metingen uitgevoerd op elke cel.
Hier beschrijven we een methodologie waarmee (1) enige virus-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo door gevoelige en specifieke virale gen kwantitatieve qPCR en (2) kwantificeert de expressie van maximaal 18 oppervlakte-eiwitten en 96 genen voor elk besmet (en niet-geïnfecteerde) cel. Deze methodologie combineert eencellige oppervlakte-proteïne meting door FACS gevolgd door onmiddellijke cellysis en gebruik van gen expressie analyse multiplexed gerichte qPCR op het Biomark-systeem. De geïntegreerde fluidic circuit (IFC)-technologie kunnen multiplexed kwantificatie van 96 genen van 96 monsters tegelijk, bereikt door een matrix van 9,216 kamers waarin de individuele qPCR reacties worden uitgevoerd. Hoge-inhoud eiwit overvloed metingen de levende cel FACS sortering registreert terwijl het behoud van de volledige transcriptoom p.a. onmiddellijk uitgevoerd stroomafwaarts. Ter identificatie van virus-geïnfecteerde cellen, tests specifiek voor alternatief afgesplitste en unspliced virale RNAs (vRNA) zijn opgenomen in de analyse van de qPCR, samen met een panel van gebruiker gedefinieerde tests tot 96 genen, het maximum aantal testen momenteel ondergebracht in totaal de IFC. De expressie van genen en eiwitten informatie verzameld voor elke cel zijn verbonden door goed standpunt. Eerder berichtten we resultaten van deze analyse elders20. Wij bieden hier, nadere methodologische richtsnoeren, alsmede verdere beschrijvende fenotypering van SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen.
Deze aanpak, die we tSCEPTRE noemen, kan worden toegepast op de schorsingen van een levensvatbare cellen bevolking reactieve fluorescently gelabelde antilichamen en uiten van een transcriptome compatibel met beschikbaar qPCR testen. Bijvoorbeeld kan het worden gebruikt voor het karakteriseren van differentiële gen- en eiwit expressie in zeldzame cellen of cellen niet gemakkelijk kunnen onderscheiden door oppervlakte-proteïne markeringen. De bereiding van de monsters is gebaseerd op een standaard protocol met verkrijgbare antilichamen kleuring. Cytometers met eencellige Sorterende vermogen ook commercieel beschikbaar zijn, maar extra bioveiligheid voorzorgsmaatregelen zijn vereist voor de verwerking van besmettelijke levende cellen. Opnemen van de single - cel eiwit expressie profiel voor elke cel door goed standpunt, aangeduid is als geïndexeerd sorteren, een gemeenschappelijk kenmerk van verkrijgbare FACS sorteren software. Computationele analyse van host differentially uitgedrukte genen onder mobiele bevolkingsgroepen van belang hier niet wordt beschreven, maar verwijzingen naar eerder gepubliceerde methoden worden geleverd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Eencellige analyse is een belangrijk instrument voor het ontleden van heterogene populaties van cellen. De identificatie en de isolatie van zeldzame cellen kunnen moeilijk zijn. Om te overwinnen deze uitdaging, een methodologie combineren geïndexeerd stroom cytometry en high-throughput multiplexed kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) werd ontwikkeld. Het doel was om te identificeren en te karakteriseren simian immunodeficiëntie virus (SIV)-geïnfecteerde cellen aanwezig binnen rhesus makaken. Via de kwantificatie van oppervlakte-proteïne door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en mRNA door qPCR, worden virus-geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door virale genexpressie, die wordt gecombineerd met host gen- en eiwit metingen een multidimensionale profiel maken . We noemen de aanpak, gerichte eencellige Proteo-transcriptionele evaluatie of tSCEPTRE. Voor het uitvoeren van de methode, zijn levensvatbare cellen gekleurd met fluorescerende antilichamen specifiek voor oppervlakte markeringen gebruikt voor FACS isolatie van een deelverzameling van de cel en/of downstream fenotypische analyse. Afzonderlijke cellen worden gevolgd door onmiddellijke lysis, multiplex omgekeerde transcriptie (RT), pre PCR versterking en hoge doorvoer qPCR van maximaal 96 afschriften gesorteerd. FACS metingen worden geregistreerd op het moment van het sorteren en vervolgens gekoppeld aan het gen expressie gegevens door goed positie om een gecombineerde eiwit en transcriptionele profiel te maken. Om te studeren SIV-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo, cellen werden geïdentificeerd door qPCR detectie van meerdere virale RNA-soorten. De combinatie van virale afschriften en de hoeveelheid van elk bieden een kader voor de indeling van cellen in verschillende fasen van de virale levenscyclus (b.v., productieve versus niet-productieve). Bovendien waren de tSCEPTRE van SIV+ cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen geïsoleerd van het zelfde model host differentially uitgedrukte genen en eiwitten te beoordelen. Uit het onderzoek bleek eerder ongewaardeerd virale RNA expressie heterogeniteit onder geïnfecteerde cellen, alsmede in vivo SIV-gemedieerde post-transcriptional genregulatie met eencellige resolutie. De tSCEPTRE methode is relevant voor de analyse van iedere cel bevolking vatbaar voor identificatie door expressie van oppervlakte-proteïne marker(s), host of pathogen gene(s) of combinaties daarvan.

De werkstroom voor het gehele protocol wordt afgebeeld in Figuur 1. Het bestaat uit twee varianten die zijn gedefinieerd door het aantal cellen gesorteerd op: ofwel beperkende verdunning of als single van cellen, zoals beschreven in de tekst. Voorbeelden van primer-sonde kwalificatie analyses op 2-fold seriële verdunningen van het RNA zijn afgebeeld in Figuur 2. De gating strategie potentiële SIV+ cellen opsporen is ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gastheer-pathogen interacties, zoals wat zijn de unieke kenmerken van de productief geïnfecteerde cellen, welke gastheer cofactoren virussen toestaan om productieve infectie vast te stellen, en hoe deze cellen te richten in therapeutische interventies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kwantitatieve maatregelen biedt voor zowel eiwit als mRNA binnen enkele cellen, en de meeste reagentia zijn commercieel beschikbaar. Het aantonen van de cel-sorteerprocedure zal Matthew Creegan, een senior technicus uit de stroom cytometrie kern in het laboratorium van dokter Michael Eller.Om te beginnen, in een aangewezen pre-PCR moleculaire biologie werkstation, de test mix voor te bereiden door het combineren van 96 genexpressie testen in een RNase, DNase vrije buis ervoor te zorgen om elke test toe te voegen aan een laatste concentratie van 180 nanomolar van voorwaartse en omgekeerde primers. Voeg DNA-suspensiebuffer toe om de juiste verdunning van het testmengsel te bereiken. Voor elke verwachte 96 bij 96 chip array, pipette zes microliters van elke test in een aangewezen put van een 96 goed PCR plaat, dan verzegelen de plaat met een lijm.Om te beginnen oppervlak vlekken levensvatbare cellen, in een weefsel cultuur bioveiligheid kabinet, eerst de compensatie monsters en een master mix van fluorescerende antilichaam cocktail zoals beschreven in de tekst protocol. Ontdooi de cryopreserved cellen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten. Voeg hierna tussen de 5 en twee milliliter van de celsuspensie toe aan een buis van 15 milliliter met 12 milliliter PBS.Centrifuge op 500 G gedurende drie minuten bij 25 graden Celsius, dan aspirate de PBS en resuspend de pellet in drie milliliter verse PBS. Breng dit mengsel over op een vijf milliliter polystyreenbuis. Centrifuge opnieuw op 500 G gedurende drie minuten bij 25 graden Celsius.Aspirate de supernatant, waardoor ongeveer 10 microliters resterende PBS. Vervolgens, resuspend tot 20 miljoen gewassen cellen in 80 microliter van antilichaam cocktail. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 graden Celsius, terwijl beschermd tegen licht.Voeg hierna drie milliliter PBS toe. Centrifuge op 500 G gedurende drie minuten en aspirate de supernatant. Grondig resuspend de cellen in 300 tot 500 microliter van PBS.Filter deze oplossing door het door een 35 micrometer nylon cel-zeef dop. dan houden de cellen op ijs en beschermd tegen licht tot het soort. Terug in de pre-PCR werkstation, eerst de RT preAMP reactie mix in een enkele RNase, DNase gratis steriele buis zoals beschreven in het tekstprotocol.Met behulp van een multichannel pipet, afzien van 10 microliters van deze reactie mix in het gewenste aantal van 96 goed PCR sort collection platen. Verzegel de plaat met plakfolie en plaats de plaat op een voorgekoeld aluminiumblok van 96 put. Stel hierna het celsorteergatingsschema in en bereid de cytometrische celsorteerder voor, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voer de juiste instrumentinstellingen in om het aantal en de subset van cellen op te geven die in elke put moeten worden gesorteerd. Verwijder de kleefzegel en sorteer de cellen in de voorbereide 96 put PCR-opvangplaten. Hersllijk de plaat opnieuw af met verse kleeffolie.Onmiddellijk vortex de opnieuw afgenomen plaat en vervolgens centrifugeren op 2000 G voor een minuut op vier graden Celsius. Thermocycle de plaat in een PCR-machine met een voorverwarmd deksel op 50 graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door 95 graden Celsius gedurende twee minuten. Tot slot, thermocycle voor 18 cycli van 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en 60 graden Celsius gedurende vier minuten, dan in een post-PCR werkstation, breng vijf microliters van cDNA in 20 microliter van DNA-suspensie buffer in een nieuwe 96 goed PCR-plaat.Om te beginnen, bereid de qPCR-testplaat door vier microliter van assay-loading reagens in elke put te pipetten. Breng vervolgens vier microliters van elke test van de 2X-testplaat naar de qPCR-plaat. Houd de qPCR-testplaat op vier graden Celsius.Doe de regelvloeistoffen van de primingspuiten in de twee inlaatkleppen van de chip. Verwijder het beschermende plastic onder de plaat. Plaats de chip op een IFC-controller met de inkepinge kant op de A1-positie en selecteer en voer het prime script uit.Voor elke microfluïde chip, meng 50 microliter van het monster laden reagens met 500 microliters van PCR master mix om de real-time reactie mix voor te bereiden. Pipette 4.4 microliters van deze reactie meng in elke put van een nieuwe 96 goed PCR plaat nu aangewezen als de monsterplaat. Vervolgens pipette 3.6 microliter van de eerder verdunde cDNA in elke put van de monsterplaat.Breng hierna vijf microliter van de testplaat naar de overeenkomstige put aan de inkepingenzijde van de chip. Breng vijf microliter van de monsterplaat naar de overeenkomstige put aan de andere kant van de chip. Plaats de geladen chip in de IFC-controller en voer het load mix-script uit.Breng vervolgens de chip over naar het BioMark-platform en stel het instrument in zoals beschreven in het tekstprotocol en sla vervolgens het bestand voor het uitvoeren van chips op in een aangewezen map. Wanneer de chiprun is voltooid, opent u de realtime PCR-analysesoftware en selecteert u bestand, opent u om de chiprun te openen. bml-bestand.Zoek in de linkerbovenhoek van het softwarevenster de samenvatting van chip explorer en chiprun. Klik onder het overzicht van de chiprun op de installatie van de detector. Klik onder taak op nieuw en selecteer de SBS-plaat en containernotatie SBS 96 van het containertype SBS.Klik op de knop met de ellips naast het in kaart brengen en selecteer vervolgens M96-Assay-SBS96.dsp. Klik op analyseweergaven. Selecteer op het tabblad qPCR onder taak basislijncorrectie voor lineaire afgeleide en CT-drempelmethode voor gebruikersdetectoren.Schakel op het tabblad CT-drempelwaarden het selectievakje initialiseren met automatisch in en klik vervolgens op de knop Analyseren. Klik in het kwadrant rechtsboven van analyseweergaven op het tweede tabblad, de resultatentabel. Selecteer in het vervolgkeuzemenu de weergave heatmap en de warmtekaart met de gegevens wordt weergegeven.Klik onder de heatmap op drempelwaarde en logboekgrafiek. Pas de CT-drempelwaarden handmatig aan voor elke detector door op tests te klikken, vertegenwoordigd door kolommen op de warmtekaart, en sleep de drempel zo nodig om de versterkingscurven in de exponentiële fase te kruisen. Klik op analyseren wanneer u klaar bent.Exporteer vervolgens de qPCR-gegevens als een csv-bestand. Breng qPCR-gegevens van de BioMark-computer naar uw bureaublad. Importeer de gegevens in een spreadsheet- of statistische analysesoftware en breng de resultaten in kaart per steekproef en testposities op de chip.Maak een nieuwe kolom en gebruik een voorwaardelijke formule om de cellen in groepen te organiseren op basis van de expressie van virale genen. Selecteer onder analyseren de optie fit Y op X en plot genexpressie versus groep. Gebruik hierna FlowJo versie negen om FCS-bestanden te openen van FACS-sortering die overeenkomt met een 96-putplaat.Als de bestandsnaam is gemarkeerd, selecteert u platform, gebeurtenisnummerpoort en maakt u geïndexeerde sorteerpoorten. Afzonderlijke cellen worden weergegeven per rij. Markeer alle 96 cellen en selecteer werkruimte, export, selecteer alle gecompenseerde vloeren.Selecteer onder gegevens FCS-bestand, klik op exporteren en selecteer een aangewezen map. Sleep de nieuwe FCS-bestanden voor afzonderlijke cellen naar een nieuwe FlowJo-werkruimte. Markeer alle cellen en klik op statistieken toevoegen, vertegenwoordigd door de sigmaknop, gemiddelde en alle fluorescentieparameters.Open de tabeleditor, markeer vervolgens alle verdiepingen van de eerste cel en sleep ze naar het venster van de tabeleditor. Klik in dit venster op tabel maken en weergeven. Kopieer en uitvoer daarna naar een statistische software door het kopiëren van plakken of door op de knop Toepassing opslaan en starten te klikken.Voeg de FACS-gegevens met één cel samen met de qPCR-gegevens in JMP op basis van het kenteken en de putpositie. Ten slotte grafische en statistische analyses uitvoeren op de gecombineerde gegevens. In deze studie wordt eencellige eiwitkwantificering door multi-parameter flow cytometrie geïntegreerd met kwantitatieve eencellige mRNA-expressie door zeer multiplexed RTqPCR.Hier is eencellige kwantitatieve virale genexpressie van FACS gesorteerd Rhesus makaken CD4 positieve T cellen. Tat/rev positieve N van negatieve cellen uiten minder kopieën van tat/rev RNA dan de N van positieve cellen in donkergroen, wat in overeenstemming is met een vroeg stadium van infectie voorafgaand aan stabilisatie en een nucleaire export van gedeeltelijk gespleten viraal RNA. Een grote overvloed aan niet-pliced Gag-RNA in tat / rev positieve N van positieve cellen is in overeenstemming met laat stadium productieve infectie waarin overvloedig genomic RNA wordt uitgedrukt en verpakt in ontluikende virions.Deze trivariate plot met het virale gen met één cel, gastheergen en gastheeroppervlaktewitexpressie toont aan dat de expressie van oppervlakte-CD4 en CD3-eiwit wordt verminderd in tat/rev-positieve cellen die in het groen worden weergegeven, hoewel CD4- en CD3-transcripties worden volgehouden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in twee tot drie dagen. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe gerichte eencellige prototranscriptional evaluatie uit te voeren om vragen met betrekking tot differentieel uitgedrukte genen en eiwitten in viraal geïnfecteerde cellen te pakken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...