Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Die Autoren möchten NIAID VRC Flow Cytometry Kern und die MHRP Flow Cytometry Kern Einrichtungen für Wartung und Betrieb von FACS Instrumenten und Sortieranlagen danken; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song für kompetente technische Unterstützung; Michael Piatak, Jr. (verstorben), für die Unterstützung mit SIV qPCR Assay Design; und Brandon Keele und Matthew Scarlotta für SIV isolieren Sequenzen. Geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und sind nicht zur Darstellung der Positionen von der US-Armee oder das Department of Defense auszulegen. Forschung wurde durchgeführt unter einem genehmigten Tierversuche-Protokoll in einer AAALAC akkreditierten Einrichtung im Einklang mit dem Tierschutzgesetz und andere Bundesgesetze und Verordnungen in Bezug auf Tiere und Experimente mit Tieren und hält sich an Prinzipien in der Anleitung für die Pflege und Verwendung der Versuchstiere, NRC Publikation, Ausgabe 2011 angegeben.

Hinweis: Eine schematische Darstellung des Protokoll-Workflow ist in Abbildung 1dargestellt. Es besteht aus drei wesentlichen Schritten: FACS, RT und cDNA Vorverstärkung und qPCR für bis zu 96 Gene gleichzeitig. Zwei Versionen des Protokolls, Zellen in Verdünnungen zu begrenzen und einzelne Zellen Sortieren Sortierung werden bzw. in Schritt 5 und 6, ausführlicher beschrieben. Diese Strategien befassen sich verschiedene Forschungsfragen doch ähnliche Verfahren zu folgen.
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Das Protokoll hier beschriebenen, genannt tSCEPTRE, einzellige Oberfläche Protein Quantifizierung von multiparameter Durchflusszytometrie mit quantitativen einzellige mRNA Expression von hoch Multiplex RT-qPCR integriert. Die Vereinigung dieser beiden Technologien ermöglicht High-Content Momentaufnahmen des kombinierten transkriptionelle und Protein Profil einzelner Zellen in einem Hochdurchsatz-Format. Wir verwenden die Methode bisher schwer mit SIV in Vivoinfizierte Zellen identifizieren und beschreiben Host...

Viele intrazelluläre Erreger abhängig von Host Cell Maschinen zu replizieren, oft Host Zellbiologie zu verändern oder gezielt ganz bestimmte Subpopulationen von Wirtszellen zu maximieren Sie ihre Chancen auf Fortpflanzung. Infolgedessen sind biologischer Zellprozesse häufig gestört, mit schädlichen Folgen für die allgemeine Gesundheit des Wirts. Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Viren und den Wirtszellen, in denen sie replizieren, wird Krankheitsmechanismen aufzuklären, die in die Entwicklung von verbesserten Therapien und Strategien helfen kann, um Infektionen zu vermeiden. Direkte Analyse Tools, mit denen das Studium der Wirt-Pathogen Interaktionen sind zu diesem Zweck unerlässlich. Einzellige Analyse bietet die einzige Möglichkeit, eindeutig einen zellulären Phänotyp einer bestimmten Genotyp oder einer Infektion Wartestatus1zuzuschreiben. Beispielsweise bedeuten pathogene Infektionen häufig sowohl direkte als auch indirekte Änderungen in Wirtszellen. Daher unterscheiden infizierte Zellen von nicht infizierten Gegenstücke ist notwendig, um Host Zelle Attributänderungen entweder direkte Infektion oder Nebenwirkungen, wie z. B. generalisierte Entzündung. Darüber hinaus für viele Krankheitserreger wie SIV und Human-Immundefizienz-Viren (HIV), Host Zelle Infektion durchläuft mehrere Phasen, wie früh, spät oder latent, von denen jedes kann durch verschiedene Gene und Protein-Expression profile2 gekennzeichnet werden , 3 , 4 , 5. Bulk Analysen der Zelle Mischungen fehl, diese Heterogenität6zu erfassen. Dagegen sehr gemultiplext einzellige Analysen den Ausdruck beider Viren quantifizieren und Host Gene bieten ein Mittel zur Infektion-spezifische zelluläre Störungen, einschließlich Variationen über Stadien der Infektion zu beheben. Darüber hinaus analysieren Wirt-Pathogen Interaktionen in physiologisch relevante Einstellungen ist entscheidend für die Identifizierung der Ereignisse, die in infizierten Organismen auftreten. Also Methoden, die angewendet werden können, direkt ex Vivo sind wahrscheinlich beste Aufnahme in Vivo verarbeitet.
SIV und HIV Ziel CD4+ T-Zellen, in denen sie Host antivirale "Einschränkung" Faktoren und Downregulate antigenpräsentierende Moleküle, um produktive Infektion zu etablieren und zu vermeiden immunüberwachung7,8, entgegenwirken, 9,10,11. Ohne Behandlung führt die Infektion zu massiven Verlust von CD4+ T Zellen letztlich gipfelte in erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS)12. In der Einstellung der antiretroviralen Therapie bestehen bleiben latent infizierten Zelle Stauseen jahrzehntelang posiert eine beeindruckende Sperre zu kurativen Strategien. Verständnis der Eigenschaften von in Vivo HIV/SIV-infizierten Zellen hat das Potenzial, Host Zelle Funktionen in der Pathogenese und Beharrlichkeit zu offenbaren. Allerdings ist dies sehr, vor allem aufgrund der Low frequency der infizierten Zellen und Reagenzien in der Lage, sie leicht zu identifizieren eine Herausforderung gewesen. Zellen, die virale RNA transkribiert werden voraussichtlich bei 0,01-1 % der CD4-Zellen im Blut und Lymphgewebe13,14,15+ T. Unter suppressive Therapie sind latent infizierte Zellen sogar seltener um 10-3– 10-7 16,17,18. Virale Protein Beflecken assays, dass Arbeit auch für ein Studium in Vitro Infektionen, wie z. B. intrazellulären Gag sind suboptimale aufgrund Hintergrundfärbung von 0,01-0,1 %, ähnlich wie oder größer als die Häufigkeit der infizierten Zellen13, 14. Oberfläche Beflecken für Env Protein mit gut charakterisierten SIV von HIV/AIDS Env-spezifischen monoklonalen Antikörpern ist auch nachgewiesen worden, wahrscheinlich aus ähnlichen Gründen schwierig sein. Vor kurzem, neuartige Werkzeuge wollen die Erkennung von Zellen Gag zu äußern, indem entweder verbessern Integration Tests speziell für Gag RNA oder durch die Verwendung alternativer bildgebender Technologien14,15,19. Solche Ansätze bleiben jedoch beschränkt auf jede Zelle die Anzahl der quantitativen Messungen durchgeführt.
Wir beschreiben hier, Methodik, die (1) einzige Virus-infizierten Zellen identifiziert direkt ex Vivo von empfindlichen und spezifischen viralen Gens quantitative qPCR und (2) den Ausdruck von bis zu 18 Oberflächenproteine und 96 Gene für jeden infizierten quantifiziert (und nicht infizierte) Zelle. Diese Methode kombiniert einzelne Zelle Oberfläche Protein Messung durch FACS gefolgt von unmittelbaren Zelle Lysis und Gen-Ausdruck Analyse mit gezielten qPCR auf dem Biomark System gemultiplext. Die integrierte fluidische Schaltung (IFC) Technologie ermöglicht Multiplex Quantifizierung 96 Gene von 96 Proben gleichzeitig erreicht, indem eine Matrix von 9.216 Kammern, in denen die einzelnen qPCR Reaktionen durchgeführt werden. Die live FACS Zellsortierung zeichnet High-Content Protein Fülle Messungen während Erhaltung der gesamten transkriptoms für Analyse sofort durchgeführt stromabwärts. Um Virus-infizierten Zellen zu identifizieren, sind Tests speziell für Alternativ gespleißt und unspliced viralen RNAs (vRNA) enthalten in der qPCR-Analyse, zusammen mit einer Gruppe von benutzerdefinierten Assays in Höhe von bis zu 96 Gene, die Höchstzahl Assays, die derzeit untergebracht die IFC. Die Genexpression und Protein erfassten Daten für die einzelnen Zellen sind durch gut Position verbunden. Wir berichteten bereits Ergebnisse aus dieser Analyse an anderer Stelle20. Hier bieten wir detaillierte methodische Richtlinien sowie weitere beschreibende Phänotypisierung von SIV-infizierten CD4+ T Zellen.
Dieser Ansatz, den wir tSCEPTRE nennen, kann an den Aufhängungen lebensfähigen Zellpopulation reaktiv, eindringmittel beschriftete Antikörper und mit dem Ausdruck einer Transkriptom kompatibel zur Verfügung qPCR Tests angewendet werden. Beispielsweise kann es für die Charakterisierung von differenziellen gen- und Proteinexpression in seltenen Zellen oder Zellen, die nicht leicht zu unterscheiden durch Oberfläche Protein-Marker verwendet werden. Die Probenvorbereitung stützt sich auf einen Standard Färbeprotokoll mit handelsüblichen Antikörpern. Cytometers mit einzelligen Sortier-Funktion sind auch im Handel erhältlich, aber zusätzliche biologische Sicherheit Vorsichtsmaßnahmen sind erforderlich für die Bearbeitung von infektiöser lebenden Zellen. Aufnahme der Single – Cell Protein Expressionsprofil für jede Zelle durch gut Lage, hierin ist als indiziert, Sortierung, ein gemeinsames Merkmal der im Handel erhältlichen FACS sortieren Software. Computergestützte Analyse von Host differentiell exprimierten Gene zwischen Zell-Populationen von Interesse ist hier nicht beschrieben, sondern Verweise werden bereitgestellt, um zuvor veröffentlichten Methoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Einzellige Analyse ist ein wichtiges Instrument für heterogene Populationen von Zellen zu sezieren. Die Identifizierung und Isolierung von seltenen Zellen können schwierig sein. Um diese Herausforderung zu meistern, eine Methodik kombinieren indiziert Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Multiplex quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) entwickelt wurde. Ziel war es, zu identifizieren und zu charakterisieren, simian immunodeficiencyvirus (SIV)-infizierten Zellen in Rhesus-Makaken. Durch Quantifizierung der Oberfläche Protein durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und mRNA von qPCR sind Virus-infizierten Zellen durch virale Genexpression identifiziert, kombiniert mit Host-gen und Protein Messungen ein mehrdimensionales Profil erstellen . Wir bezeichnen den Ansatz, gezielte einzellige Proteo-transcriptional Bewertung oder tSCEPTRE. Um die Methode auszuführen, sind vitaler Zellen spezifisch für oberflächenmarker verwendet für FACS Isolierung einer Zelle Teilmenge und/oder nachgeschalteten phänotypische Analyse mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt. Einzelne Zellen werden gefolgt von sofortige Lyse, Multiplex-reverse Transkription (RT), PCR Vorverstärkung und hohem Durchsatz qPCR bis zu 96 Transkripte sortiert. FACS-Messungen sind aufgenommen in die Zeit des Aussortierens und anschließend mit Genexpressionsdaten von gut Lage, einem kombinierten Protein und transkriptionellen Profil zu schaffen. Zur Untersuchung der SIV-infizierten Zellen direkt Ex Vivo, Zellen wurden von qPCR Erkennung von mehrere virale RNA-Spezies identifiziert. Die Kombination von viralen Transkripte und die Menge der einzelnen bilden den Rahmen für die Klassifizierung von Zellen in verschiedene Phasen des viralen Lebenszyklus (z.B.im Vergleich zu nicht-produktiven produktiv). Darüber hinaus wurden tSCEPTRE von SIV+ Zellen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen isoliert von der gleichen Probe Host differentiell exprimierten Genen und Proteinen zu beurteilen. Die Analyse ergab bisher verkannte virale RNA Ausdruck Heterogenität unter den infizierten Zellen als auch in Vivo SIV-vermittelten posttranskriptionelle Genregulation mit einzelligen Auflösung. Die tSCEPTRE Methode ist relevant für die Analyse einer Zellpopulation Identifizierung durch Ausdruck der Oberfläche Protein Marker(s), Host oder Erreger ursächlich oder Kombinationen davon zugänglich.

Der Workflow für das gesamte Protokoll wird in Abbildung 1dargestellt. Es besteht aus zwei Varianten definiert durch die Anzahl der Zellen sortiert: entweder begrenzende Verdünnung oder als einzelne Zellen, wie im Text beschrieben. Beispiele für Primer-Sonden Qualifikation Analysen auf 2-fold RNA Verdünnungsreihen sind in Abbildung 2dargestellt. Die gating Strategie identifizieren potenzielle SIV+ -Zellen ist in <s...

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Beschrieben ist eine Methodik, die Expression von Genen 96 quantitate und 18 Oberflächenproteine von einzelnen Zellen Ex Vivo, ermöglicht die Identifizierung von differenziell ausgedrückt, Genen und Proteinen in Virus-infizierten Zellen im Verhältnis zu nicht infizierten Zellen. Wir wenden das Konzept Studie SIV-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu beantworten, wie die einzigartigen Eigenschaften der produktiv infizierten Zellen, welche Wirtskofaktoren es Viren ermöglichen, eine produktive Infektion zu etablieren, und wie diese Zellen in therapeutischen Interventionen gezielt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie quantitative Maßnahmen sowohl für Proteine als auch für mRNA in einzelnen Zellen bereitstellt und die meisten Reagenzien im Handel erhältlich sind. Demonstriert wird das Verfahren zur Zellsortierung von Matthew Creegan, einem leitenden Techniker aus dem Flow-Zytometrie-Kern im Labor von Doktor Michael Eller.Zunächst bereiten Sie in einer bestimmten Prä-PCR-Molekularbiologie-Workstation den Assay-Mix vor, indem Sie 96 Genexpressions-Assays in einer RNase, DNase-Freirohr, kombinieren, die sicherstellen, dass jeder Assay zu einer Endkonzentration von 180 Nanomolaren von Vorwärts- und Rückwärtsprimern hinzugefügt wird. Fügen Sie einen DNA-Suspensionspuffer hinzu, um die entsprechende Verdünnung des Assay-Mixzus zu erreichen. Für jedes erwartete 96 mal 96 Chip-Array pipette sechs Mikroliter pro Assay in einen bestimmten Brunnen einer 96 well PCR Platte, dann versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff.Um mit der Oberflächenfärbung lebensfähiger Zellen zu beginnen, bereiten Sie zunächst in einem Biosicherheitsschrank der Gewebekultur zunächst die Kompensationsproben und einen Master-Mix aus fluoreszierendem Antikörpercocktail vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die kryokonservierten Zellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad zwei Minuten lang auftauen. Danach zwischen 5 und zwei Milliliter der Zellsuspension zu einer 15-Milliliter-Röhre mit 12 Milliliter PBS hinzufügen.Zentrifugieren Sie bei 500 G für drei Minuten bei 25 Grad Celsius, dann aspirieren Sie die PBS und setzen Sie das Pellet in drei Milliliter frischen PBS wieder auf. Diese Mischung in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr geben. Zentrifuge wieder bei 500 G für drei Minuten bei 25 Grad Celsius.Aspirieren Sie den Überstand, so dass etwa 10 Mikroliter Rest PBS. Als nächstes setzen Sie bis zu 20 Millionen gewaschene Zellen in 80 Mikroliter Antikörper-Cocktail aus. 20 Minuten bei 25 Grad Celsius bebrüten, während sie vor Licht geschützt sind.Fügen Sie danach drei Milliliter PBS hinzu. Zentrifugieren Sie bei 500 G für drei Minuten und aspirieren Sie den Überstand. Die Zellen in 300 bis 500 Mikroliter PBS gründlich wieder aussetzen.Filtern Sie diese Lösung, indem Sie sie durch eine 35 Mikrometer Nylon-Zell-Siebkappe pipetieren. dann halten Sie die Zellen auf Eis und vor Licht geschützt, bis die Art. Zurück in der Pre-PCR-Workstation, bereiten Sie zuerst den RT-PreAMP-Reaktionsmix in einer einzigen RNase, DNase freie sterile Röhre, wie im Textprotokoll beschrieben.Mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter dieser Reaktionsmischung in die gewünschte Anzahl von 96 well PCR-Sortierungs-Sammelplatten geben. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und legen Sie die Platte dann auf einen vorgekühlten 96 gut Aluminiumblock. Legen Sie anschließend das Zellensortierungsschema fest, und bereiten Sie den zytometrischen Zellsortierer des Flusses wie im Textprotokoll beschrieben vor.Geben Sie die entsprechenden Instrumenteneinstellungen ein, um die Anzahl und Teilmenge der Zellen anzugeben, die in jeden Brunnen sortiert werden sollen. Entfernen Sie die Klebedichtung, dann sortieren FACS die Zellen in die vorbereiteten 96 gut PCR-Sammelplatten. Die Platte mit frischer Klebefolie wieder versiegeln.Sofort wirbeln die neu versiegelte Platte und dann Zentrifuge bei 2000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Thermocycle die Platte in einer PCR-Maschine mit einem vorgeheizten Deckel bei 50 Grad Celsius für 15 Minuten gefolgt von 95 Grad Celsius für zwei Minuten. Schließlich Thermozyklus für 18 Zyklen von 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und 60 Grad Celsius für vier Minuten, dann in einem Post-PCR-Arbeitsplatz, übertragen fünf Mikroliter cDNA in 20 Mikroliter DNA Suspension Puffer in einer neuen 96 well PCR Platte.Zunächst bereiten Sie die qPCR-Assayplatte vor, indem Sie in jedem Brunnen vier Mikroliter Assay-Ladereagenz pipetieren. Als nächstes übertragen Sie vier Mikroliter jedes Assays von der 2X-Assayplatte auf die qPCR-Platte. Halten Sie die qPCR-Assayplatte bei vier Grad Celsius.Geben Sie die Steuerleitungsflüssigkeiten aus den Grundierspritzen in die beiden Ansaugventile des Chips. Entfernen Sie den Schützenkunststoff unter der Platte. Platzieren Sie den Chip auf einem IFC-Controller mit der Gekerbtenseite an der A1-Position, und wählen Sie dann das Prime-Skript aus und führen Sie es aus.Mischen Sie für jeden mikrofluidischen Chip 50 Mikroliter des Probenladereagenzes mit 500 MikroliterPCR-Master-Mix, um den Echtzeit-Reaktionsmix vorzubereiten. Pipette 4,4 Mikroliter dieser Reaktion mischen sich in jeden Brunnen einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die jetzt als Probenplatte bezeichnet wird. Als nächstes Pipette 3,6 Mikroliter der zuvor verdünnten cDNA in jeden Brunnen der Probenplatte.Danach fünf Mikroliter von der Assayplatte auf den entsprechenden Brunnen auf der Gekertalerseite des Chips übertragen. Fünf Mikroliter von der Probenplatte in den entsprechenden Brunnen auf der anderen Seite des Chips übertragen. Legen Sie den geladenen Chip in den IFC-Controller ein, und führen Sie das Load-Mix-Skript aus.Übertragen Sie den Chip anschließend auf die BioMark-Plattform, und richten Sie das Im Textprotokoll beschriebene Instrument ein, und speichern Sie dann die Chiprun-Datei in einem bestimmten Ordner. Wenn der Chiplauf abgeschlossen ist, öffnen Sie die Echtzeit-PCR-Analysesoftware und wählen Sie dann Datei aus, öffnen Sie, um den Chiprun zu öffnen. bml-Datei.In der oberen linken Ecke des Softwarefensters, finden Chip Explorer und Chip Run Zusammenfassung. Klicken Sie unter Chiprun Summary auf detektor setup. Klicken Sie unter Aufgabe auf Neu, und wählen Sie den Behältertyp SBS-Platte und das Containerformat SBS 96 aus.Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Auslassung neben der Zuordnung, und wählen Sie dann M96-Assay-SBS96.dsp. Klicken Sie auf Analyseansichten. Wählen Sie auf der Registerkarte qPCR unter Aufgabe die Baseline-Korrektur für die lineare Ableitung und die CT-Schwellenwertmethode für Benutzerdetektoren aus.Aktivieren Sie auf der Registerkarte CT-Schwellenwerte das Kontrollkästchen Initialisieren mit auto, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analysieren. Klicken Sie im oberen rechten Quadranten der Analyseansichten auf die zweite Registerkarte, die Ergebnistabelle. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Heatmap-Ansicht aus und die Heatmap mit den Daten wird angezeigt.Klicken Sie unter der Heatmap auf Schwellenwert und Protokolldiagramm. Passen Sie die CT-Schwellenwerte manuell für jeden Detektor an, indem Sie auf Assays klicken, die durch Spalten auf der Heatmap dargestellt werden, und ziehen Sie den Schwellenwert nach Bedarf, um die Verstärkungskurven in der Exponentialphase zu schneiden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren.Exportieren Sie als Nächstes die qPCR-Daten als csv-Datei. Übertragen Sie qPCR-Daten vom BioMark-Computer auf Ihren Desktop. Importieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle oder eine statistische Analysesoftware und ordnen Sie die Ergebnisse nach Stichproben und Assaypositionen auf dem Chip zu.Erstellen Sie eine neue Spalte, und verwenden Sie eine bedingte Formel, um die Zellen basierend auf der Expression viraler Gene in Gruppen zu organisieren. Wählen Sie unter Analysieren Y nach X aus und zeichnen Sie die Genexpression im Vergleich zur Gruppe. Danach verwenden Sie FlowJo Version 9, um FCS-Dateien aus FACS-Sort zu öffnen, die einer 96-Well-Platte entsprechen.Wenn der Dateiname hervorgehoben ist, wählen Sie Plattform, Ereignisnummerngate aus, und erstellen Sie indizierte Sortiergates. Einzelne Zellen werden nach Zeile angezeigt. Markieren Sie alle 96 Zellen, und wählen Sie dann Arbeitsbereich, Exportieren, Auswählen aller kompensierten Etagen aus.Wählen Sie unter Daten die FCS-Datei aus, klicken Sie auf Exportieren, und wählen Sie einen bestimmten Ordner aus. Ziehen Sie die neuen FCS-Dateien für einzelne Zellen in einen neuen FlowJo-Arbeitsbereich. Markieren Sie alle Zellen, und klicken Sie auf Statistiken hinzufügen, die durch die Sigma-Schaltfläche, den Mittelwert und alle Fluoreszenzparameter dargestellt werden.Öffnen Sie den Tabelleneditor, markieren Sie dann alle Etagen der ersten Zelle, und ziehen Sie sie in das Tabelleneditorfenster. Klicken Sie in diesem Fenster auf Tabelle erstellen und anzeigen. Kopieren und ausgeben Sie anschließend in eine statistische Software, indem Sie entweder kopieren oder auf die Schaltfläche "Anwendung speichern und starten" klicken.Führen Sie die einzelzelligen FACS-Daten mit den qPCR-Daten in JMP durch die Plattennummer und die Well-Position zusammen. Führen Sie schließlich grafische und statistische Analysen der kombinierten Daten durch. In dieser Studie wird die quantitierte Proteinquantitation mit einzelligem Oberflächenprotein durch Multiparameter-Flow-Zytometrie mit der quantitativen einzelzelligen mRNA-Expression durch hochmultiplexed RTqPCR integriert.Hier ist die einzellige quantitative virale Genexpression aus FACS sortierten Rhesus-Makaken-CD4-positiven T-Zellen zu sehen. Tat/rev-positives N von negativen Zellen exprimieren weniger Kopien von Tat/Rev-RNA als das N positiver Zellen in dunkelgrün, was mit einem frühen Infektionsstadium vor der Stabilisierung und einem nuklearen Export von teilweise gespleißter viraler RNA übereinstimmt. Eine hohe Fülle an ungepliced Gag-RNA in tat/rev positiveM N positiver Zellen ist konsistent mit einer produktiven Infektion im spätstadium, bei der reichlich genomische RNA exprimiert und in aufkeimende Virionen verpackt wird.Dieses trivariate Diagramm, das das einzellige virale Gen, das Wirtsgen und die Proteinexpression der Wirtsoberfläche anzeigt, zeigt, dass die Oberflächen-CD4- und CD3-Proteinexpression in tat/rev-positiven Zellen, die in Grün dargestellt werden, verringert wird, obwohl CD4- und CD3-Transkripte erhalten sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine gezielte prototranskriptielle Einzelzellbewertung durchführen können, um Fragen zu differenziell exprimierten Genen und Proteinen in viral infizierten Zellen zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...