Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

המחברים רוצה להודות NIAID VRC Flow Cytometry הליבה ואת המתקנים MHRP Flow Cytometry הליבה עבור תחזוקה ותפעול של FACS מכשירים וציוד מיון; מריה מונטרו, Vishakha שארמה, שיר Kaimei לסיוע טכני מומחה; מייקל Piatak ג'וניור (נפטר) לקבלת סיוע עם סיב qPCR assay עיצוב; ברנדון בדק, מתיו Scarlotta עבור SIV לבודד רצפים. הדיעות של המחברים, לא יפורש לייצג את העמדות של צבא ארה ב או ההגנה. המחקר נערך תחת פרוטוקול שאושר לשימוש בבעלי חיים במתקן AAALAC מוכר בדרישות חוק רווחת בעלי חיים, אחרים הפדרלי חוקים ותקנות הנוגעים לבעלי חיים, ניסויים בבעלי חיים מעורבים ונדבקת עקרונות נכתב במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, הפרסום NRC, 2011 מהדורה.

הערה: תיאור סכמטי של פרוטוקול זרימת העבודה מוצג באיור1. הוא מורכב משלושה שלבים עיקריים: FACS, RT cDNA קדם הגברה, ו qPCR עבור גנים עד 96 בו זמנית. שתי גרסאות של הפרוטוקול, מיון תאי דילולים ולהרחיב תאים בודדים, מתוארים בפירוט רב יותר בין שלב 5 שלב 6, בהתאמה. אסטרטגיות אלו שאלות מחקריות שונ...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול המתוארים כאן, הנקרא tSCEPTRE, משתלב כימות חלבון משטח תא בודד על-ידי cytometry זרימה multiparameter עם ביטוי mRNA תא בודד כמותיים מאוד מרובבת RT-qPCR. האיחוד של שתי טכנולוגיות אלה מאפשר תמונות בעלת תוכן גבוהה של משולב תעתיק חלבון פרופיל של תאים בודדים בתבנית תפוקה גבוהה. נוכל להשתמש בשיטה כדי לזהות עד ...

פתוגנים תאיים רבים מסתמכים על מכונות התא המארח כדי לשכפל, לעתים קרובות שינוי ביולוגיה של התא המארח או פילוח subpopulations מאוד ספציפי של התאים המארחים כדי להגדיל את סיכוייהם של התפשטות. כתוצאה מכך, תהליכים ביולוגיים תא הם בדרך כלל משובשות, עם השלכות מזיקות על הבריאות הכללית של המחשב המארח. הבנת את האינטראקציות בין וירוסים התאים מארח שבו הם לשכפל לאיפיון מנגנוני המחלה עשוי לסייע בפיתוח של טיפולים משופרים ואסטרטגיות כדי למנוע זיהום. כלים אנליטיים ישירה המאפשרים חקר אינטראקציות פתוגן-פונדקאי חיוניים לצורך כך. ניתוח מתא בודד מספק את האמצעי היחיד לייחס הסלולר פנוטיפ חד משמעית גנוטיפ מסוים או זיהום בסטאטוס1. לדוגמה, זיהומים פתוגניים לגרום לעתים קרובות הן ישירים והן עקיפים שינויים בתוך התאים המארחים. לכן, הבחנה תאים נגועים מהקבצים המקבילים נגוע הכרחי לשינויים התא המארח התכונה זיהום ישירה או השפעות משניות, כגון מוכללת דלקת. יתר על כן, עבור גורמי מחלה רבים, כמו SIV ווירוסים הכשל החיסוני האנושי (HIV), זיהום התא המארח ממשיך דרך שלבים מרובים, כגון מוקדם, מאוחר, או סמויה, שכל אחד מהם עשוי להיות מאופיין על ידי גנים נפרדים פרופילי ביטוי חלבון2 , 3 , 4 , 5. ניתוח בצובר של תערובות תא ייכשל ללכוד זה הטרוגניות6. לעומת זאת, מאוד מרובב תא בודד ניתוחים היכולת לכמת את הביטוי של שניהם ויראלי, מארח את הגנים מציעים אמצעים כדי לפתור לפליטת הסלולר זיהום ספציפיים, כולל וריאציות על פני שלבים זיהום. עוד, ניתוח האינטראקציות פתוגן-פונדקאי פיזיולוגית הגדרות רלבנטיות הינה קריטית לצורך זיהוי אירועים המתרחשים אורגניזמים נגועים. לכן, שיטות שניתן להחיל ישירות שמחוץ הם סביר להניח הטובה ביותר ללכוד ויוו תהליכים.
SIV ו- HIV היעד CD4+ T תאים, שבו הם לנטרל גורמים אנטי-ויראלי "הגבלה" המארח ו downregulate אנטיגן הצגת מולקולות ליצור זיהום פרודוקטיבי ולהימנע מעקב המערכת החיסונית7,8, 9,10,11. ללא טיפול, הזיהום גורמת לאובדן מסיבי CD4+ T תאים, בסופו של דבר לשיאה רכשה כשל חיסוני תסמונת (איידס)12. בהגדרה של טיפול תרופתי, התא הנגוע לחשוף מאגרים להימשך עשרות שנים, מתחזה מחסום אימתני אסטרטגיות המרפא. הבנה של מאפייני ויוו תאים HIV/סיב-הנגועים יש פוטנציאל לחשיפת תכונות התא המארח אינסטרומנטלי פתוגנזה והתמדה. עם זאת, זה מאוד מאתגרת, בעיקר בשל את low frequency של תאים נגועים וחוסר ריאגנטים בקלות להזדהות איתם. תאים לתמלל RNA נגיפי, מוערך להיות נוכח-0.01 – 1% של CD4+ T תאי דם, רקמת הלימפה13,14,15. תחת טיפול מדכא, תאים נגועים לחשוף שכיחים פחות בגיל 10-3–10-7 16,17,18. חלבון נגיפי מכתים assays כי פועלות היטב עבור הלומדים חוץ גופית בתוך זיהומים, כגון איסור פרסום תאיים, הם שיוצרת בשל הרקע מכתים של 0.01 – 0.1%, דומה או גבוה יותר התדירות של תאים נגועים13, 14. צביעת משטח החלבונים Env באמצעות נוגדנים חד-שבטיים סיב/HIV Env ספציפיים מאופיין היטב גם הוכח להיות קשה, ככל הנראה מסיבות דומות. לאחרונה, כלים חדשניים שואפים לשפר את הגילוי של תאים המבטאים את הבדיחה על-ידי שילוב מבחני ספציפי עבור החלטורה RNA או על-ידי שימוש חלופי הדמיה טכנולוגיות14,15,19. עם זאת, גישות כאלה נשארים מוגבל במספר מדידות כמותיים מתבצע על כל תא.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה (1) המזהה תאים הנגועים בנגיף בודדים ישירות שמחוץ מאת ג'ין ויראלי רגיש וספציפי כמותית qPCR ו- (2) מכמת את הביטוי של חלבונים פני שטח עד 18, גנים 96 לכל נגוע ( תא נגוע). מתודולוגיה זו משלב חלבון משטח תא בודד מדידה על ידי FACS ואחריו פירוק התא מיידית, ביטוי גנים באמצעות ניתוח מרובב יישוב qPCR במערכת Biomark. הטכנולוגיה מעגל משולב fluidic (IFC) מאפשר כימות מרובבת של גנים 96 מדגימות 96 בו זמנית, על ידי מטריצה של צ'יימברס 9,216 שבו מתבצעות תגובות qPCR בודדים. המיון תא חי FACS רשומות מדידות שפע חלבון גבוהה-תוכן תוך שמירה על transcriptome כולה לניתוח מתבצעת באופן מיידי במורד הזרם. כדי לזהות תאים הנגועים בנגיף, מבחני ספציפי עבור RNAs ויראלי, לחלופין משולבים, unspliced (vRNA) הינם כלולים בניתוח qPCR, יחד עם פאנל של מבחני על-ידי המשתמש, בהיקף של עד 96 גנים, המספר המרבי של מבחני השוהים כיום על IFC. ביטוי גנים ומידע חלבון שנאספו עבור כל תא מקושרות על-ידי מיקום טוב. אנחנו קודם לכן דיווח תוצאות של ניתוח זה במקום20. כאן, אנו מספקים יותר מפורטות הנחיות מתודולוגי, כמו גם עוד יותר תיאורי phenotyping של CD4 הנגועים סיב+ T תאים.
גישה זו, אשר אנו המונח tSCEPTRE, ניתן ליישם את המתלים של כל האוכלוסייה קיימא תא תגובתי נוגדנים fluorescently שכותרתו, ביטוי של transcriptome תואם עם מבחני qPCR זמין. לדוגמה, זה יכול לשמש עבור אפיון גנים דיפרנציאלית וביטוי חלבונים תאים נדיר או תאים לא ברצון מכובד על ידי הדם שלה. הכנת הדוגמא מסתמכת על תקן מכתים פרוטוקול באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית. Cytometers עם יכולת מיון תא בודד הינם גם זמינים מסחרית, אך אמצעי אבטחה נוספים נדרשים לעיבוד זיהומיות תאים חיים. מקליט את פרופיל ביטוי יחיד – התא חלבון עבור כל תא על-ידי מיקום טוב, התייחס בזאת כפי באינדקס מיון, היא תכונה נפוצה FACS זמינים מסחרית מיון תוכנה. ניתוח חישובית של המארח באופן שונה ביטוי גנים בין אוכלוסיות תאים עניין לא מתואר כאן, אבל הפניות מסופקים לשיטות שפורסמו בעבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

ניתוח מתא בודד הוא כלי חשוב ניקוד אוכלוסיות הטרוגניות של תאים. זיהוי ובידוד של תאים נדיר יכול להיות קשה. כדי להתגבר על האתגר הזה, שילוב מתודולוגיה באינדקס cytometry זרימה, פיתחה תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים מרובבת תפוקה גבוהה (qPCR). המטרה היתה כדי לזהות ולאפיין הקופי הכשל החיסוני (SIV)-נגוע תאים מתנה בתוך קופי מקוק רזוס. באמצעות כימות של חלבונים פני השטח על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), ה-mRNA מאת qPCR, תאים הנגועים בנגיף מזוהים על ידי ביטוי גנים ויראלי, אשר בשילוב עם המידות גנים וחלבונים המארח כדי ליצור פרופיל רב-ממדי . אנו המונח את הגישה, הערכה תא בודד Proteo-תעתיק יישוב או tSCEPTRE. כדי לבצע את השיטה, התאים קיימא מוכתמים פלורסנט נוגדנים ספציפיים עבור סמני פני השטח המשמש לבידוד FACS תא משנה ו/או ניתוח פנוטיפי במורד הזרם. תאים בודדים מסודרים שהופעלו על ידי פירוק מיידי, שעתוק במהופך מולטיפלקס (RT), הגברה קדם PCR qPCR תפוקה גבוהה של עד 96 הפרוטוקולים. מדידות FACS הקליט בזמנו של מיון, ולאחר מכן לקשר את הנתונים ביטוי גנים לפי מיקום טוב כדי ליצור חלבון בשילוב פרופיל תעתיק. ללמוד הנגועים SIV תאים ישירות vivo לשעבר, תאים זוהו על ידי זיהוי qPCR של מספר מינים RNA נגיפי. השילוב של תעתיקים ויראלי את הכמות של כל אחת לספק מסגרת לסיווג תאים לשלבים ברורים של מחזור חיי ויראלי (למשל, היצרני לעומת לא פרודוקטיביים). יתר על כן, tSCEPTRE של תאים סיב+ היו תאים בהשוואה נגוע מבודד מן הדגימה זהה כדי להעריך המארח באופן שונה ביטוי גנים, חלבונים. ניתוח הנתונים גילה הטרוגניות ביטוי RNA נגיפי קודם לכן לא מוערך בין תאים נגועים וכן ויוו בתיווך סיב post-transcriptional הכונה ברזולוציה של תא בודד. שיטת tSCEPTRE רלוונטי לניתוח של כל התושבים תא לבצע זיהוי על ידי ביטוי של חלבונים פני השטח marker(s), מארח או פתוגן gene (s) או צירופם.

זרימת העבודה עבור פרוטוקול כולו מתואר באיור1. הוא מורכב שתי וריאציות שהוגדרו על-ידי מספר התאים מיון: גם דילול המגביל או כמו יחיד תאים, כפי שתוארה בטקסט. דוגמאות פריימר-בדיקה ניתוחים מוקדמות על 2-fold דילולים RNA טורי מוצגות באיור2. האסטרטגיה חס?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

תיאר מתודולוגיה quantitate את הביטוי של גנים 96, 18 פני שטח חלבונים על ידי תאים בודדים לשעבר vivo, המאפשרות הזיהוי באופן שונה באה לידי ביטוי גנים, חלבונים בתאים הנגועים בנגיף ביחס תאים נגוע. אנו מיישמים את הגישה ללימוד CD4 הנגועים סיב+ T תאים מבודד קופי מקוק רזוס.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום של אינטראקציות מארח פתוגן כגון מה הם המאפיינים הייחודיים של תאים נגועים באופן פרודוקטיבי, מה קופקטורים מארחים לאפשר וירוסים להקים זיהום פרודוקטיבי, וכיצד למקד תאים אלה בהתערבויות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת אמצעים כמותיים הן לחלבון והן ל- mRNA בתוך תאים בודדים, ורוב הריוגנטים זמינים מסחרית. הדגמת הליך מיון התאים תהיה מתיו קריגן, טכנאי בכיר מעולם ציטומיית הזרימה במעבדה של ד"ר מייקל אלר.כדי להתחיל, בתחנת עבודה ייעודית לביולוגיה מולקולרית לפני PCR, הכינו את תערובת המבחנה על ידי שילוב של 96 בדיקות ביטוי גנים לתוך RNase, הצינור החופשי DNase הקפד להוסיף כל בדיקה לריכוז סופי של 180 ננומולרים של פריימרים קדימה ואחורי. הוסף מאגר השעיית DNA כדי להשיג את הדילול המתאים של תערובת הבדיקות. עבור כל צפוי 96 על ידי 96 מערך שבבים, פיפטה שישה microliters של כל בדיקה לתוך באר ייעודית של צלחת PCR 96 היטב, ולאחר מכן לאטום את הצלחת עם דבק.כדי להתחיל כתם פני השטח תאים קיימא, ב ארון biosafety תרבות הרקמה, תחילה להכין את דגימות הפיצוי ותערובת הורים של קוקטייל נוגדנים פלואורסצנטי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. להפשיר את התאים cryopreserved באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, להוסיף בין 5 לשני מיליליטר של ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר המכיל 12 מיליליטר של PBS.צנטריפוגה ב 500 G במשך שלוש דקות ב 25 מעלות צלזיוס, ואז שאף PBS ולתלות את גלולה בשלושה מיליליטר של PBS טרי. מעבירים את התערובת לצינור פוליסטירן חמישה מיליליטר. צנטריפוגה שוב ב 500 G במשך שלוש דקות ב 25 מעלות צלזיוס.שאף את העל-טבעי, והותיר כ-10 מיקרוליטרים המתגוררים ב-PBS. לאחר מכן, יש להשתמש מחדש ב-20 מיליון תאים שטופים ב-80 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים. דגירה במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס בעוד מוגן מפני אור.לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה ב 500 G במשך שלוש דקות ושואפים את supernatant. ביסודיות resuspend התאים ב 300 כדי 500 microliters של PBS.סנן פתרון זה על-ידי צינורות אותו דרך כובע 35 מיקרומטר ניילון תא-מסננת. ואז לשמור על התאים על קרח מוגן מפני אור עד למיון. בחזרה בתחנת העבודה שלפני PCR, הכינו תחילה את תערובת התגובות של RT preAMP בצינור סטרילי אחד של RNase, DNase בחינם כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.באמצעות פיפטה רב ערוצית, לוותר על 10 microliters של תגובה זו לערבב לתוך המספר הרצוי של 96 גם PCR מיון צלחות איסוף. לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולאחר מכן למקם את הצלחת על בלוק אלומיניום 96 היטב מקורר מראש. לאחר מכן, צור את ערכת המיון התאים והכן את סדרן התאים הציטומטרי של הזרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט.הזן את הגדרות הכלים המתאימות כדי לציין את המספר ואת קבוצת המשנה של התאים שיש למיין לתוך כל באר. הסר את החותם דבק, ולאחר מכן FACS למיין את התאים לתוך מוכן 96 גם לוחות איסוף PCR. סותמים מחדש את הצלחת עם סרט דבק טרי.מיד מערבולת צלחת חותם מחדש ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. Thermocycle את הצלחת במכונת PCR עם מכסה שחומם מראש ב 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ואחריו 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לבסוף, תרמוצ'יצ'ל עבור 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות, ולאחר מכן בתחנת עבודה שלאחר PCR, להעביר חמישה microliters של cDNA לתוך 20 microliters של חיץ ההשעיה DNA בצלחת חדשה 96 גם PCR.כדי להתחיל, להכין את צלחת הבדיקה qPCR על ידי צינור ארבעה microliters של reagent הטעינה בדיקה בכל באר. לאחר מכן, להעביר ארבעה microliters של כל בדיקה מצלחת בדיקה 2X לצלחת qPCR. שמור על צלחת ההתמדה של qPCR בארבע מעלות צלזיוס.מחלקים את נוזלי קו הבקרה מהמזרקים לתוך שני שסתומי הצריכה של השבב. מוציאים את הפלסטיק המגן מתחת לצלחת. מקם את השבב על בקר IFC עם הצד הנוון במיקום A1 ולאחר מכן בחר והפעל את קובץ ה- Script הראשי.עבור כל שבב microfluidic, לערבב 50 microliters של ריאגנט טעינת מדגם עם 500 microliters של תערובת מאסטר PCR כדי להכין את תערובת התגובה בזמן אמת. פיפטה 4.4 microliters של תגובה זו לערבב לתוך כל באר של צלחת PCR חדשה 96 היטב עכשיו מיועד כצלחת המדגם. לאחר מכן, פיפטה 3.6 microliters של cDNA מדולל בעבר לתוך כל באר של צלחת המדגם.לאחר מכן, להעביר חמישה microliters מצלחת ההתדגם ל באר המתאימה בצד חריץ של השבב. מעבירים חמישה מיקרוליטרים מצלחת הדגימה לתוך באר המתאימה בצד השני של השבב. הכנס את השבב שנטען לבקר IFC והפעל את קובץ ה- Script של ערבוב העומס.לאחר מכן, העבר את השבב לפלטפורמת BioMark והגדר את המכשיר כמפורט בפרוטוקול הטקסט ולאחר מכן שמור את קובץ הפעלת השבב בתיקיה ייעודית. לאחר השלמת הפעלת השבב, פתח את תוכנת ניתוח PCR בזמן אמת ולאחר מכן בחר קובץ, פתח, כדי לפתוח את chiprun. קובץ bml.בפינה השמאלית העליונה של חלון התוכנה, אתר את סייר השבבים ואת סיכום הפעלת השבבים. תחת סיכום הפעלת שבב, לחץ על הגדרת גלאי. תחת פעילות, לחץ על חדש ובחר את לוחית SBS של סוג הגורם המכיל ותבנית הגורם המכיל SBS 96.לחץ על הכפתור עם שלוש הנקודות לצד מיפוי ולאחר מכן בחר M96-Assay-SBS96.dsp. לחץ על תצוגות ניתוח. בכרטיסיה qPCR תחת משימה, בחר תיקון בסיסי עבור נגזרת ליניארית ושיטת סף CT עבור גלאי משתמשים.בכרטיסיה ספי CT, סמן את התיבה אתחל באמצעות אוטומטי ולאחר מכן לחץ על לחצן נתח. ברביע הימני העליון של תצוגות ניתוח, לחץ על הכרטיסיה השניה, טבלת תוצאות. מהתפריט הנפתח, בחר תצוגת מפת חום ומפת החום עם הנתונים תופיע.תחת מפת החום, לחץ על סף וגרף יומן רישום. התאם את סף ה- CT באופן ידני עבור כל גלאי על-ידי לחיצה על בדיקות, המיוצגות על-ידי עמודות במפת החום וגרירת הסף לפי הצורך כדי להדק את עקומות ההגברה בשלב המעריכי. כשתסיים, לחץ על נתח.לאחר מכן, יצא את נתוני qPCR כקובץ csv. העבר נתוני qPCR ממחשב BioMark לשולחן העבודה שלך. יבא את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנת ניתוח סטטיסטי ומפה את התוצאות לפי עמדות מדגם והסתערות על השבב.צור עמודה חדשה ולהשתמש בנוסחה מותנית כדי לארגן את התאים לקבוצות המבוססות על ביטוי של גנים ויראליים. תחת ניתוח, בחר התאם Y לפי X והתווית ביטוי גנים לעומת קבוצה. לאחר מכן, השתמש ב- FlowJo גירסה 9 כדי לפתוח קבצי FCS ממיון FACS התואם לצלחת באר 96.כאשר שם הקובץ מסומן, בחר פלטפורמה, שער מספר אירוע וצור שערי מיון הכלולים באינדקס. תאים בודדים יופיעו מוצגים לפי שורה. סמן את כל 96 התאים ולאחר מכן בחר סביבת עבודה, יצא, בחר את כל הקומות המפוצות.תחת נתונים, בחר קובץ FCS, לחץ על ייצוא ובחר תיקיה ייעודית. גרור את קבצי FCS החדשים עבור תאים בודדים לסביבת עבודה חדשה של FlowJo. סמן את כל התאים ולחץ על הוסף סטטיסטיקה, המיוצגת על-ידי לחצן סיגמא, ממוצע וכל הפרמטרים הפלואורסצנטיים.פתח את עורך הטבלה ולאחר מכן סמן את כל הקומות של התא הראשון וגרור אותן לחלון עורך הטבלה. בחלון זה, לחץ על צור והצג טבלה. לאחר מכן, העתק ופלט לתוכנה סטטיסטית על-ידי הדבקת העתקה או על-ידי לחיצה על לחצן שמור וה הפעל יישום.מזג את נתוני FACS של תא יחיד עם נתוני qPCR ב- JMP לפי מספר הלוחית ומיקום הבאר. לבסוף, בצע ניתוחים גרפיים וסטטיסטיים על הנתונים המשולבים. במחקר זה, כימות חלבון פני השטח של תא יחיד על ידי ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים משולב עם ביטוי mRNA כמותי של תא יחיד על ידי RTqPCR מרובה מאוד.מוצג כאן ביטוי גנים ויראלי כמותי תא יחיד מתא FACS ממוין רזוס מאקי CD4 חיובי T תאים. Tat /rev חיובי N של תאים שליליים לבטא פחות עותקים של tat / rev RNA מאשר N של תאים חיוביים בירוק כהה אשר עולה בקנה אחד עם שלב מוקדם של זיהום לפני התייצבות וייצוא גרעיני של RNA ויראלי שותק חלקית. שפע גבוה של Gag-RNA unspliced ב tat / rev חיובי N של תאים חיוביים עולה בקנה אחד עם זיהום פרודוקטיבי בשלב מאוחר שבמהלכו RNA גנומי בשפע מתבטא ונארז לתוך ניצנים virions.עלילה זו trivariate המציג את הגן ויראלי תא יחיד, גן מארח, ביטוי חלבון משטח המארח מראה כי ביטוי חלבון CD4 ו- CD3 פני השטח הוא ירד תאים חיוביים tat / rev המוצגים בירוק למרות CD4 ו CD3 תעתיקים מתמשכים. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות ביומיים עד שלושה ימים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע הערכה prototranscriptional תא יחיד ממוקד כדי לענות על שאלות הנוגעות גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי וחלבונים בתאים נגועים ויראלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...