Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Gli autori vorrei ringraziare il NIAID VRC flusso Cytometry Core e le strutture di MHRP flusso Cytometry Core per la manutenzione e il funzionamento degli strumenti di FACS e ordinamento attrezzature; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song per assistenza tecnica; Michael Piatak, Jr. (defunti) per assistenza con progetto di SIV qPCR assay; e Brandon Keele e Matthew Scarlotta per SIV isolare sequenze. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretate per rappresentare le posizioni dell'esercito degli Stati Uniti o il dipartimento della difesa. Ricerca è stato condotto secondo un protocollo approvato l'uso di animali in una struttura di AAALAC accreditati in conformità con l'Animal Welfare Act e altri statuti federali e regolamenti in materia di animali e gli esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi indicato nella Guida per la cura e uso di animali da laboratorio, NRC pubblicazione, edizione 2011.

Nota: Lo schema di flusso di lavoro protocollo è illustrato nella Figura 1. Si compone di tre fasi principali: FACS, RT e pre-amplificazione del cDNA e qPCR per fino a 96 geni contemporaneamente. Due versioni del protocollo, ordinamento celle in diluizioni di limitazione e l'ordinamento di singole cellule, sono descritti più dettagliatamente nei passaggi 5 e 6, rispettivamente. Queste strategie di affrontare questioni di ricerca differenti ma seguono procedure simili.
<p class="jove_ti...

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Il protocollo descritto qui, chiamato tSCEPTRE, integra la quantificazione di cella singola proteina di superficie mediante citometria a flusso multiparametrica con espressione quantitativa del mRNA unicellulare di altamente Multiplex RT-qPCR. L'Unione di queste due tecnologie consente ad alto contenuto istantanee della combinata trascrizionale e profilo proteico delle singole cellule in un formato ad alta velocità. Usiamo il metodo per identificare le celle precedentemente sfuggente infettate con SIV in vivoe ...

Molti agenti patogeni intracellulari si basano su macchina cellula ospite per replicare, spesso targeting molto specifiche sottopopolazioni di cellule dell'ospite per massimizzare le loro possibilità di propagazione o alterare la biologia delle cellule ospite. Di conseguenza, i processi biologici delle cellule sono comunemente perturbati, con conseguenze deleterie per la salute generale dell'ospite. Comprensione delle interazioni tra virus e cellule dell'ospite in cui si replicano chiariranno i meccanismi di malattia che possono essere di aiuto nello sviluppo di terapie migliori e le strategie per prevenire l'infezione. Diretti strumenti analitici che permettono lo studio delle interazioni ospite-patogeno sono essenziali verso questo fine. Cella singola analisi fornisce l'unico mezzo per attribuire inequivocabilmente un fenotipo cellulare ad un particolare genotipo o infezione di stato1. Ad esempio, infezioni da patogeni inducono frequentemente modifiche dirette e indirette in cellule ospiti. Pertanto, distinguendo le cellule infettate dalle loro controparti non infetti è necessario attributo host cella modifiche o infezione diretta o effetti secondari, come generalizzata infiammazione. Inoltre, per molti agenti patogeni, come SIV e virus di immunodeficenza umana (HIV), infezione delle cellule ospite procede attraverso fasi multiple, come presto, tardi, o latente, ognuno dei quali può essere caratterizzato da distinte gene e della proteina espressione profili2 , 3 , 4 , 5. analisi di massa di miscele di cella non riuscirà a catturare questa eterogeneità6. Al contrario, altamente multiplexed analisi unicellulare in grado di quantificare l'espressione di entrambi virale e geni ospitanti offrono un mezzo per risolvere specifici di infezione cellulare perturbazioni, comprese le varianti attraverso fasi di infezione. Ulteriormente, analizzando fisiologicamente interazioni ospite-patogeno in impostazioni rilevanti è fondamentale per l'identificazione di eventi che si verificano negli organismi infetti. Così, metodi che possono essere applicati direttamente ex vivo sono probabilmente migliori cattura in vivo i processi.
SIV e HIV CD4 di destinazione+ T cellule, in cui essi neutralizzare fattori antivirali "restrizione" ospite e downregulate antigene che presenta molecole per stabilire l'infezione produttiva ed evitare la sorveglianza immune7,8, 9,10,11. Senza trattamento, l'infezione si traduce in perdita massiccia di CD4 cellule+ T, in ultima analisi si conclude con acquistata di immunodeficenza (AIDS) la sindrome12. L'impostazione della terapia antiretrovirale, serbatoi latente infettate delle cellule persistono per decenni, che propone una formidabile barriera alle strategie curative. Comprendere le proprietà delle cellule in vivo HIV/SIV-infettati ha il potenziale per rivelare caratteristiche della cellula ospite strumentale nella patogenesi e persistenza. Tuttavia, questo è stato molto impegnativo, soprattutto dovuto le evacuazioni delle cellule infettate e mancanza di reagenti in grado di identificare prontamente. Cellule che trascrivono RNA virale, sono valutati per essere presente al 0,01 – 1% di CD4+ T cellule nel sangue e tessuto linfoide13,14,15. Sotto terapia soppressiva, cellule latente infettate sono anche meno frequenti al 10-3-10-7 16,17,18. Colorazione delle proteine virali saggi che lavorano bene per studiare in vitro infezioni, ad esempio per Gag intracellulare, sono non ottimale a causa di una colorazione di fondo di 0,01 – 0,1%, simile o maggiore della frequenza di cellule infettate13, 14. Marcatura di superficie per la proteina Env usando gli anticorpi monoclonali SIV/HIV Env-specifici ben caratterizzati inoltre ha dimostrato di essere difficile, probabilmente per motivi analoghi. Recentemente, nuovi strumenti mirano a migliorare la rilevazione di cellule esprimenti Gag da uno che incorporano dosaggi specifici per bavaglio RNA o utilizzando alternativo imaging technologies14,15,19. Tuttavia, tali approcci rimangono limitati nel numero di misurazioni quantitative eseguite su ciascuna cella.
Qui, descriviamo la metodologia che (1) identifica singole cellule infettate da virus direttamente ex vivo di qPCR quantitativa sensibile e specifico gene virale e (2) quantifica l'espressione di proteine di superficie fino a 18 e 96 geni per ogni infettati (e delle cellule non infette). Questa metodologia combina la misurazione di cella singola proteina di superficie di FACS seguita da lisi cellulare immediato e analisi di espressione genica utilizzando multiplexed qPCR mirata sull'apparato Biomark. La tecnologia del circuito integrato fluidico (IFC) consente di multiplex quantificazione di 96 geni da 96 campioni contemporaneamente, compiuta da una matrice di 9.216 alloggiamenti in cui vengono eseguite le reazioni individuali qPCR. L'ordinamento di cellule vive FACS registra ad alto contenuto proteico abbondanza misure mentre conservando l'intero trascrittoma per analisi eseguita immediatamente a valle. Per identificare le cellule infettate da virus, specifici saggi per alternativamente impiombate e unspliced virali RNA (vRNA) sono inclusi nell'analisi qPCR, insieme a un pannello di analisi definite dall'utente per un totale di fino a 96 geni, il numero massimo di analisi attualmente alloggiati in l'IFC. L'espressione genica e proteica informazioni raccolte per ogni cella sono collegate da ben posizionato. Precedentemente abbiamo segnalato i risultati di questa analisi altrove20. Qui, forniamo più dettagliate linee guida metodologiche, nonché ulteriormente descrittivo fenotipizzazione di SIV-infettati CD4+ T cellule.
Questo approccio, che chiamiamo tSCEPTRE, può essere applicato per le sospensioni di qualsiasi popolazione di cellule vitali reattivo agli anticorpi fluorescente identificati e che esprimono un transcriptome compatibile con saggi qPCR disponibili. Ad esempio, può essere utilizzato per la caratterizzazione genica differenziale ed espressione della proteina in cellule rare o cellule non facilmente distinguibili dai marcatori di proteina di superficie. La preparazione del campione si basa su uno standard di protocollo utilizzando anticorpi commerciali di colorazione. Citometri con cella singola funzionalità di ordinamento sono anche disponibili in commercio, ma biosicurezza ulteriori precauzioni sono necessarie per l'elaborazione di cellule vive infettive. Registrare il profilo di espressione di proteina delle cellule di singolo – per ogni cella di posizione ben, qui indicato come indicizzato l'ordinamento, è una caratteristica comune di FACS commercialmente disponibile software di ordinamento. Analisi computazionale di geni differenzialmente espressi ospitanti tra popolazioni cellulari di interesse non è descritto qui, ma vengono forniti riferimenti ai metodi precedentemente pubblicati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Analisi unicellulare è uno strumento importante per la dissezione popolazioni eterogenee delle cellule. L'identificazione e l'isolamento di cellule rare può essere difficile. Per superare questa sfida, una combinazione di metodologia indicizzati citometria a flusso e reazione a catena della polimerasi quantitativa multiplex di alto-rendimento (qPCR) è stato sviluppato. L'obiettivo era di identificare e caratterizzare il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV)-cellule presenti all'interno di macachi rhesus infette. Attraverso la quantificazione della proteina di superficie ordinando fluorescenza-attivato delle cellule (FACS) e mRNA di qPCR, cellule infettate da virus sono identificate da espressione genica virale, che è combinata con misure di gene e la proteina di host per creare un profilo multidimensionale . Chiamiamo l'approccio, valutazione singola cellula Proteo-trascrizionale mirati o tSCEPTRE. Per eseguire il metodo, cellule vitali sono macchiate con anticorpi fluorescenti specifiche per gli indicatori di superficie utilizzati per l'isolamento di FACS di un sottoinsieme delle cellule e/o analisi fenotipica a valle. Singole celle vengono ordinate seguita dall'immediata Lisi, multisala trascrizione inversa (RT), pre-amplificazione di PCR e qPCR elevato throughput di fino a 96 trascrizioni. FACS misure sono registrate al momento dell'ordinamento e successivamente collegate a dati di espressione genica di ben posizionato per creare una proteina combinata e profilo trascrizionale. Per studiare la SIV-infettati direttamente cellule ex vivo, le cellule sono state identificate tramite rilevazione di qPCR di più specie di RNA virale. La combinazione di trascrizioni virali e la quantità di ciascuno forniscono un quadro per classificare le cellule in diversi stadi del ciclo di vita virale (ad es., produttivo contro non-produttiva). Inoltre, tSCEPTRE delle cellule SIV+ erano rispetto ai non infetti cellule isolate dallo stesso campione per valutare host differenzialmente espressi geni e proteine. L'analisi ha rivelato precedentemente incompreso eterogeneità di espressione RNA virale tra cellule infette come pure in vivo regolazione genica post-trascrizionale mediata SIV con cella singola ad alta risoluzione. Il metodo tSCEPTRE è rilevante per l'analisi di qualsiasi popolazione delle cellule suscettibili di identificazione dall'espressione della proteina di superficie marker(s), geni di host o agente patogeno o loro combinazioni.

Il flusso di lavoro per l'intero protocollo è descritto in Figura 1. Si compone di due variazioni definite dal numero di celle filtrate: o diluizione limitante o come singole cellule, come descritto nel testo. Nella Figura 2vengono illustrati esempi di analisi di qualificazione primer-sonda su 2 volte diluizioni seriali di RNA. La strategia di gating per identificare potenziali cellule SIV+ è illustrata nella <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni ospite-patogeno come quali sono le caratteristiche uniche delle cellule infette produttivamente, quali cofattori ospiti consentono ai virus di stabilire un'infezione produttiva e come indirizzare queste cellule negli interventi terapeutici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce misure quantitative sia per le proteine che per l'mRNA all'interno di singole cellule, e la maggior parte dei reagenti sono disponibili in commercio. A dimostrare la procedura di smistamento delle cellule sarà Matthew Creegan, un tecnico senior del nucleo di citometria a flusso nel laboratorio del dottor Michael Eller.Per iniziare, in una workstation di biologia molecolare pre-PCR designata, preparare il mix di test combinando 96 test di espressione genica in un tubo libero di RNasi, DNasi assicurandosi di aggiungere ogni saggio a una concentrazione finale di 180 nanomolari di primer avanti e indietro. Aggiungere il tampone di sospensione del DNA per ottenere l'appropriata diluizione della miscela di test. Per ogni array di chip 96 per 96 previsto, pipettare sei microlitri di ogni saggio in un pozzo designato di una piastra PCR da 96 po ', quindi sigillare la piastra con un adesivo.Per iniziare la colorazione superficiale di cellule vitali, in un armadietto di biosicurezza della coltura tissutale, preparare prima i campioni di compensazione e un mix principale di cocktail di anticorpi fluorescenti come delineato nel protocollo di testo. Scongelare le cellule crioconservate in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, aggiungere da 5 a due millilitri della sospensione cellulare a un tubo da 15 millilitri contenente 12 millilitri di PBS.Centrifugare a 500 G per tre minuti a 25 gradi Celsius, quindi aspirare il PBS e rimospendare il pellet in tre millilitri di PBS fresco. Trasferire questa miscela in un tubo di polistirolo a cinque millilitri. Centrifuga ancora una volta a 500 G per tre minuti a 25 gradi Celsius.Aspirare il supernatante, lasciando circa 10 microlitri pbs residui. Successivamente, ha rimospenso fino a 20 milioni di cellule lavate in 80 microlitri di cocktail di anticorpi. Incubare per 20 minuti a 25 gradi Celsius mentre è protetto dalla luce.Successivamente, aggiungere tre millilitri di PBS. Centrifuga a 500 G per tre minuti e aspira il supernatante. Rimorsi completamente le cellule in 300-500 microlitri di PBS.Filtrare questa soluzione tubazione attraverso un tappo filtrante a celle in nylon da 35 micrometri. quindi tenere le cellule sul ghiaccio e protette dalla luce fino all'ordinamento. Di nuovo nella workstation pre-PCR, preparare prima il mix di reazione RT preAMP in un singolo tubo sterile privo di RNasi, DNasi come delineato nel protocollo di testo.Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 10 microlitri di questa miscela di reazione nel numero desiderato di 96 piastre di raccolta di ordinamento PCR ben. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e quindi posizionare la piastra su un blocco di alluminio pre-refrigerato da 96 po '. Successivamente, stabilire lo schema di smistamento delle celle e preparare lo smistatore di celle citometriche del flusso come descritto nel protocollo di testo.Immettere le impostazioni dello strumento appropriate per specificare il numero e il sottoinsieme di celle da ordinare in ogni pozzo. Rimuovere la guarnizione adesiva, quindi FACS ordinare le celle nelle piastre di raccolta PCR preparate da 96 po '. Rigillare la piastra con pellicola adesiva fresca.Vortice immediatamente la piastra richiacrato e quindi centrifugare a 2000 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Termociclo la piastra in una macchina PCR con coperchio preriscaldato a 50 gradi Celsius per 15 minuti seguita da 95 gradi Celsius per due minuti. Infine, termociclo per 18 cicli di 95 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per quattro minuti, quindi in una workstation post-PCR, trasferire cinque microlitri di cDNA in 20 microlitri di tampone di sospensione del DNA in una nuova piastra PCR da 96 po '.Per iniziare, preparare la piastra di dosaggio qPCR pipettando quattro microlitri di reagente di carico del saggio in ogni pozzo. Successivamente, trasferire quattro microlitri di ogni saggio dalla piastra di dosaggio 2X alla piastra qPCR. Mantenere la piastra di dosaggio qPCR a quattro gradi Celsius.Erogare i fluidi della linea di controllo dalle siringhe di adescamento nelle due valvole di aspirazione del chip. Rimuovere la plastica protettiva da sotto la piastra. Posizionare il chip su un controller IFC con il lato dentellato nella posizione A1, quindi selezionare ed eseguire lo script principale.Per ogni chip microfluidico, mescolare 50 microlitri del reagente di caricamento del campione con 500 microlitri di mix master PCR per preparare il mix di reazione in tempo reale. I microlitri Pipette 4.4 di questa reazione si mescolano in ogni pozzo di una nuova piastra PCR da 96 po 'ora designata come piastra campione. Successivamente, pipetta 3,6 microlitri del cDNA precedentemente diluito in ogni pozzo della piastra del campione.Successivamente, trasferire cinque microlitri dalla piastra di dosaggio al pozzo corrispondente sul lato dentellato del chip. Trasferire cinque microlitri dalla piastra del campione nel pozzo corrispondente sull'altro lato del chip. Inserire il chip caricato nel controller IFC ed eseguire lo script di combinazione di carico.Successivamente, trasferire il chip sulla piattaforma BioMark e impostare lo strumento come descritto nel protocollo di testo, quindi salvare il file di esecuzione del chip in una cartella designata. Al termine dell'esecuzione del chip, aprire il software di analisi PCR in tempo reale e quindi selezionare il file, aprire, per aprire il chiprun. bml.Nell'angolo in alto a sinistra della finestra del software, individuare il riepilogo dell'explorer dei chip e dell'esecuzione del chip. In Riepilogo esecuzione chip fare clic sulla configurazione del rilevatore. In attività fare clic su nuovo e selezionare il tipo di contenitore SBS plate e il formato contenitore SBS 96.Fare clic sul pulsante con i puntini di sospensione accanto alla mappatura, quindi selezionare M96-Assay-SBS96.dsp. Fare clic sulle visualizzazioni analisi. Nella scheda qPCR in attività selezionare correzione di base per la derivata lineare e il metodo di soglia CT per i rilevatori utente.Nella scheda Soglie CT selezionare la casella inizializza con auto e quindi fare clic sul pulsante analizza. Nel quadrante superiore destro delle visualizzazioni analisi fare clic sulla seconda scheda, tabella dei risultati. Dal menu a discesa, selezionare la visualizzazione mappa termica e verrà visualizzata la mappa termica con i dati.Sotto la mappa termica, fare clic su soglia e grafico di registro. Regolare manualmente le soglie CT per ogni rivelatore facendo clic su saggi, rappresentati da colonne sulla mappa termica, e trascinando la soglia se necessario per intersecare le curve di amplificazione nella fase esponenziale. Al termine, fare clic su analizza.Esportare quindi i dati qPCR come file CSV. Trasferire i dati qPCR dal computer BioMark al desktop. Importare i dati in un foglio di calcolo o in un software di analisi statistica e mappare i risultati in base alle posizioni di campionamento e dosaggio sul chip.Creare una nuova colonna e utilizzare una formula condizionale per organizzare le cellule in gruppi basati sull'espressione di geni virali. In analisi, selezionare fit Y per X e tracciare l'espressione genica rispetto al gruppo. Successivamente, utilizzare FlowJo versione nove per aprire i file FCS dall'ordinamento FACS corrispondente a una piastra di pozzo 96.Con il nome del file evidenziato, selezionare piattaforma, gate del numero di evento e creare gate di ordinamento indicizzati. Le singole celle appariranno visualizzate per riga. Evidenziare tutte le 96 celle e quindi selezionare l'area di lavoro, esportare, selezionare tutti i piani compensati.In Dati selezionare file FCS, fare clic su Esporta e selezionare una cartella designata. Trascinare i nuovi file FCS per le singole celle in una nuova area di lavoro FlowJo. Evidenziare tutte le celle e fare clic su aggiungi statistiche, rappresentate dal pulsante sigma, dalla media e da tutti i parametri di fluorescenza.Aprire l'editor di tabelle, quindi evidenziare tutti i piani della prima cella e trascinarli nella finestra dell'editor della tabella. In questa finestra fare clic su Crea e visualizza tabella. Successivamente, copiare e produrre in un software statistico copiando o facendo clic sul pulsante salva e avvia applicazione.Unire i dati FACS a cella singola con i dati qPCR in JMP in base al numero di targa e alla posizione del pozzo. Infine, eseguire analisi grafiche e statistiche sui dati combinati. In questo studio, la quantificazione delle proteine di superficie a singola cellula per citometria a flusso multi-parametro è integrata con l'espressione quantitativa di mRNA a singola cellula da RTqPCR altamente multiplexato.Qui è mostrata l'espressione genica virale quantitativa a singola cellula dalle cellule T positive cd4 di Rhesus macaque ordinate dalla FACS. Tat/rev positivo N di cellule negative esprimono meno copie di tat/rev RNA rispetto alla N delle cellule positive in verde scuro che è coerente con una fase precoce dell'infezione prima della stabilizzazione e un'esportazione nucleare di RNA virale parzialmente spliced. Un'alta abbondanza di Gag-RNA non scontento in tat/rev positivo N di cellule positive è coerente con l'infezione produttiva in fase avanzata durante la quale l'abbondante RNA genomico viene espresso e confezionato in virioni in erba.Questo grafico trivariato che mostra il gene virale a singola cellula, il gene ospite e l'espressione proteica della superficie ospite mostra che l'espressione proteica di superficie CD4 e CD3 è diminuita in cellule tat/rev positive mostrate in verde anche se le trascrizioni CD4 e CD3 sono sostenute. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre giorni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una valutazione prototrascrizionale a singola cellula mirata per affrontare le domande relative ai geni e alle proteine espressi in modo differenziato nelle cellule infettate viralmente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

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