Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

저자는 NIAID VRC Flow Cytometry 코어와 MHRP Flow Cytometry 핵심 시설 유지 보수 및 FACS 악기와 정렬 장비 운영에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 마리아 몬테, Vishakha Sharma, Kaimei 노래 전문가 기술 지원; 마이클 Piatak, 주니어 (고 인)를 통해 SIV 정량 분석 결과 디자인; 브랜든 킬와 SIV에 대 한 매튜 Scarlotta 시퀀스를 분리 하 고. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수는 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.

참고: 프로토콜 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 세 가지 주요 단계로 구성 됩니다: FACS, RT 및 cDNA 사전 증폭, 및 최대 96 유전자에 대 한 정량 동시에. 프로토콜, 희석을 제한 하 고 단일 셀 정렬 셀 정렬의 두 가지 버전 5 단계 및 6 단계에서 자세히 각각 설명 되어 있습니다. 이러한 전략 다른 연구 질문 하지만 유사한 절차.
1. 필수 또는 이전...

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	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. 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프로토콜 여기에 설명 된, tSCEPTRE 되 나, 높은 다중화 실시간 정량 Pcr에 의해 양적 단일 셀 mRNA 식 multiparameter cytometry에 의해 통합 하는 단일 세포 표면 단백질 정량. 이 두 기술의 조합 transcriptional는 결합의 높은 콘텐츠 스냅샷 및 높은 처리량 형식에서 단일 세포의 단백질 프로필 수 있습니다. 우리는 메서드를 사용 하 여 지금까지 애매 셀 SIV에서 vivo에서, 감염을 식별 하 고 차동 표현된 호?...

종종 호스트 세포 생물학 변경 또는 전파의 그들의 기회를 극대화 하기 위해 호스트 세포의 매우 구체적인 부분 모집단을 대상으로 많은 세포내 병원 체 복제 호스트 셀 기계에 의존 합니다. 그 결과, 세포 생물학 프로세스는 일반적으로 중단, 호스트의 전반적인 건강에 해로운 결과. 바이러스 및 그들은 복제 하는 있는 호스트 세포 사이 상호 작용 이해 감염을 방지 하기 위해 향상 된 치료 및 전략의 개발에 도움이 있습니다 질병 메커니즘 명료 하 게 됩니다. 호스트 병원 체 상호 작용의 연구를 직접 분석 도구는이 필수적입니다. 단일 세포 분석은 명확 하 게 특정 유전자 형 또는 감염 상태1세포 표현 형을 특성에 유일한 수단을 제공 합니다. 예를 들어 병원 성 감염 자주 호스트 세포에서 둘 다 직접 및 간접 변화 유도. 따라서, 구별 그들의 감염에서 감염 된 세포는 직접 감염 또는 보조 효과 특성 호스트 셀 변경 하는 데 필요한 같은 일반화 된 염증. 또한, 많은 병원 체, SIV와 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 같은 일찍, 늦게, 호스트 세포 감염 같은 여러 단계를 통해 진행 또는 숨겨진, 각각의 특징 수 있습니다 고유한 유전자와 단백질 표정 단면도2 , 3 , 4 , 5. 세포 혼합물의 대량 분석이이6을 잡으려고 실패 합니다. 대조적으로, 매우 둘 다 바이러스의 식 계량 수 단일 세포 분석 다중화 하 고 감염 관련 세포 섭, 감염 단계에 걸쳐 변화를 포함 하 여 해결 하는 수단을 제공 하는 호스트 유전자. 또한, 순수에 호스트 병원 체 상호 작용 분석 관련 설정을 감염 된 유기 체에서 발생 하는 이벤트의 식별을 위해 중요 합니다. 따라서, vivo ex vivo에서 최고의 가능성이 캡처는 직접 적용할 수 있는 방법을 처리 합니다.
SIV와 HIV CD4 대상+ T는 그들이 중화 호스트 항 바이러스 "제한" 요소와 downregulate 항 원 제시 하는 생산적인 감염 고 방지 면역 감시7,8, 분자 세포 9,,1011. 치료를 하지 않으면 감염 c d 4의 대규모 손실에 결과+ T 세포, 궁극적으로에 culminating 획득 면역 결핍 증후군 (에이즈)12. 투여 요법의 설정에서 latently 감염된 세포 저수지 치료 전략에 강한 장벽 포즈, 수십 년 동안 지속. Vivo에서 HIV/SIV에 감염 된 세포의 속성을 이해 pathogenesis 및 지 속성에 호스트 세포 기능을 가능성이 있다. 그러나, 이것은 매우 도전, 감염 된 세포의 low frequency 그리고 그들을 쉽게 식별할 수 시 약의 부족 때문에 주로. 바이러스 성 RNA 녹음 셀 0.01-1에 있기 위하여 견적 된다 CD4의 %+ T 세포가 혈액과 림프 조직13,,1415에. 진압 치료에서 latently 감염 된 세포는 10-3– 10-7- 16,,1718도 덜 자주. 체 외에 감염, 같은 세포내 개 그 공부 잘 작동 배경 0.01-0.1의 얼룩 때문에 차선은 분석 실험 바이러스 성 단백질 얼룩 %, 감염 된 세포13의 주파수 보다 작거나 비슷합니다 14. 잘 특징이 SIV/에이즈 환경을 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 여 환경 단백질에 대 한 표면 얼룩 또한 입증 되었다 어려울, 아마 유사한 이유를 위해. 최근, 새로운 도구 중 개 그를 표현 하는 세포의 탐지를 향상을 목표로 통합 개 그 RNA 또는 대체 이미징 기술14,,1519를 사용 하 여 특정 분석 실험. 그러나, 이러한 접근 제한 남아 양적 측정 수에서 각 셀에서 수행.
여기, 우리 (1) 직접 비보 전 과민 하 고 특정 바이러스 성 유전자 정량 정량 및 (2) 각 감염에 대 한 최대 18 표면 단백질 및 96 유전자의 식을 단정 단일 바이러스에 감염 된 세포를 식별 하는 방법 설명 (그리고 감염 되지 않은) 셀입니다. 이 방법론은 FACS 즉시 세포 세포의 용 해에 의해 다음에 의해 단일 세포 표면 단백질 측정 그리고 Biomark 시스템에 대상으로 정량 멀티플렉스 유전자 표정 분석 사용 하 여. 통합된 유체 회로 (IFC) 기술 수 있습니다 96 샘플에서 96 유전자의 멀티플렉스 정량을 동시에 개별 정량 Pcr 반응을 수행 됩니다 9,216 챔버의 매트릭스에 의해 수행. 즉시 수행 분석에 대 한 전체 transcriptome 보존 하는 동안이 콘텐츠 단백질 풍부한 측정 기록 라이브 셀 FACS 정렬 다운스트림. 바이러스에 감염 된 세포를 식별, 양자 택일로 접합 하 고 unspliced 바이러스 성 RNAs (vRNA)에 대 한 분석 실험 관련 최대 96 유전자, 현재에 수용 하는 분석 실험의 최대 수를 총 사용자 정의 분석 실험의 패널 함께 정량 분석에 포함 IFC입니다. 유전자 발현 및 단백질 정보 각 셀에 대 한 좋은 위치에 의해 연결 됩니다. 우리는 이전20이 분석을 다른 곳에서 결과 보고 했다. 여기, 우리는 자세한 SIV에 감염 된 CD4의 추가 설명 형질으로 서 방법론 지침 제공+ T 세포.
우리 tSCEPTRE 기간,이 접근의 어떤 가능한 셀 붙일 레이블된 항 체를 표현 transcriptome 호환 가능한 정량 분석 실험 반응 정지에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 차동 유전자와 단백질 표정 희귀 세포 또는 세포 표면 단백질 마커에 의해 쉽게 구별 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다. 샘플 준비는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 표준에 의존 합니다. 단일 셀 정렬 기능 Cytometers 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다, 하지만 추가 biosafety 예방 감염 라이브 셀을 처리 하는 데 필요한. 여기 라고 잘 위치 하 여 각 셀에 대 한 단일-셀 단백질 식 프로필 기록 분류, 색인으로 정렬 소프트웨어 상용 FACS의 일반적인 기능입니다. 관심의 셀 인구 가운데 차동 표현된 호스트 유전자의 전산 분석, 설명 되지 않은 하지만 참조는 이전에 게시 방법에 제공 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

단일 세포 분석은 세포의 이종 인구를 해 부하는 중요 한 도구 이다. 식별 및 희귀 세포의 격리 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 방법론 결합 인덱스 cytometry 고 높은 처리량 다중화 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 개발 되었다. 목표를 식별 하 여 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 특성은-붉은 털 원숭이 내의 세포를 감염. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 단백질의 정량에 의해 mRNA 정량를 통해 바이러스에 감염 된 세포는 다차원 프로필을 만들 호스트 유전자와 단백질 측정 함께 바이러스 성 유전자 발현에 의해 식별 됩니다. . 우리 용어 접근, 타겟된 단일 셀 Proteo transcriptional 평가, 또는 tSCEPTRE. 메서드를 수행 하기 위해 실행 가능한 세포 표면 마커 FACS 절연 셀 집합 또는 다운스트림 phenotypic 분석의 사용에 대 한 특정 형광 항 체와 스테인드는. 단일 셀 뒤에 즉시 세포, 다중 반전 녹음 방송 (실시간), PCR 사전 확대, 및 최대 96 성적 높은 처리량 정량 정렬 됩니다. FACS 측정 정렬의 시간에서 기록 하 고 이후 transcriptional 프로필 및 결합된 단백질을 만드는 좋은 위치에 의해 유전자 표현 데이터에 연결 됩니다. SIV에 감염 연구를 직접 ex vivo세포, 세포는 여러 바이러스 RNA의 정량 검출에 의해 확인 되었다. 바이러스 성 성적표의 조합과 각 양의 바이러스 성 수명 주기 (예를 들어, 비 생산적 대 생산)의 단계로으로 세포를 분류 하기 위한 프레임 워크를 제공 합니다. 또한, SIV+ 세포의 tSCEPTRE 감염에 비해 셀 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 평가 하기 위해 동일한 견본에서 고립 되었다. 분석 감염 된 세포 뿐만 아니라 vivo에서 단일 셀 해상도 post-transcriptional 유전자 SIV 중재 규정 중 이전 진가 바이러스 성 RNA 식이 밝혔다. TSCEPTRE 메서드는 의무가 표면 단백질 marker(s), 호스트 또는 병원 체 gene(s), 또는 그것으로 조합 식으로 식별 된 셀 인구의 분석입니다.

전체 프로토콜에 대 한 워크플로 그림 1에 묘사 된다. 그것은 이루어져 있다 2 개의 유사 콘텐츠를 정렬 하는 셀의 수에 의해 정의: 어느 제한 희석 또는 텍스트에 설명 된 대로 셀, 싱글로. 2-fold 직렬 RNA 희석에 뇌관 프로브 자격 분석의 예는 그림 2에 표시 됩니다. 잠재적인 SIV+ 셀을 식별 하는 제어 전략은 <strong class="xfig...

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

이 방법은 생산적으로 감염된 세포의 독특한 특성이 무엇인지, 호스트 보조 인자가 바이러스가 생산적인 감염을 확립할 수 있도록 허용하는 것과 같은 호스트 병원체 상호 작용 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 치료 내정간섭에서 이러한 세포를 표적으로 하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 내에서 단백질과 mRNA 모두에 대한 정량적 측정을 제공하고 대부분의 시약이 시판된다는 것입니다. 세포 선별 절차를 보여주는 것은 닥터 마이클 엘러의 실험실에 있는 유동 세포측정 코어에서 수석 기술자 매튜 Creegan, 일 것입니다.우선, 지정된 사전 PCR 분자 생물학 워크스테이션에서 96개의 유전자 발현 분석제를 RNase, DNase 프리 튜브에 결합하여 분석 믹스를 준비하여 각 분석기를 180 나노몰라의 최종 농도에 추가하여 전방 및 역 프라이머의 최종 농도를 추가합니다. DNA 서스펜션 버퍼를 추가하여 분석 믹스의 적절한 희석을 달성한다. 96칩 어레이로 예상되는 각 96의 마이크로리터에 대해 각 분석의 6마이크로리터를 96개의 잘 PCR 플레이트의 지정된 웰에 넣은 다음 접착제로 플레이트를 밀봉합니다.표면 염색 가능한 세포를 시작하려면, 조직 배양 생물 안전 캐비닛에서, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 보상 샘플과 형광 항체 칵테일의 마스터 믹스를 준비한다. 냉동 보존 된 세포를 섭씨 37도 의 수조에서 2 분 동안 해동하십시오. 그 후, PBS의 12 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 세포 현탁액의 5 그리고 2 밀리리터 사이를 추가합니다.500G의 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 PBS를 흡입한 다음 신선한 PBS 3밀리리터로 펠릿을 재차 놓습니다. 이 혼합물을 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮킨다. 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 500G로 다시 한 번 원심분리기.슈퍼나탈자를 흡인하여 약 10개의 마이크로리터 잔류 PBS를 남깁니다. 다음으로, 항체 칵테일 80 마이크로리터에서 최대 2천만 개의 세척 된 세포를 다시 중단하십시오. 빛으로부터 보호하면서 섭씨 25도에서 20분 동안 배양하십시오.그 후 PBS의 3 밀리리터를 추가합니다. 500 G의 원심분리기는 3분 동안 슈퍼나탈것을 흡인시합니다. PBS의 300에서 500 마이크로 리터에서 세포를 철저히 재중단합니다.35 마이크로미터 나일론 셀 스트레이너 캡을 통해 파이프팅하여 이 솔루션을 필터링합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 보관하고 종류까지 빛으로부터 보호합니다. 다시 사전 PCR 워크 스테이션에서, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 단일 RNase, DNase 무료 멸균 튜브에 RT preAMP 반응 믹스를 준비합니다.멀티채널 파이펫을 사용하여 이 반응의 10마이크로리터를 원하는 96개의 PCR 정렬 컬렉션 플레이트로 분배합니다. 접착제 필름으로 접시를 밀봉한 다음 미리 냉각된 96 개의 알루미늄 블록에 접시를 놓습니다. 그런 다음 셀 정렬 게이팅 체계를 설정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유동 세포 식 세포 선별기를 준비합니다.적절한 계측기 설정을 입력하여 각 웰로 정렬할 셀의 수와 하위 집합을 지정합니다. 접착제 씰을 제거한 다음 FACS는 셀을 준비된 96 개의 잘 PCR 수집 플레이트로 정렬합니다. 신선한 접착제 필름으로 접시를 다시 밀봉합니다.즉시 다시 밀봉 된 플레이트와 원심 분리기를 섭씨 4도에서 1 분 동안 2000 G에서 소용돌이합니다. PCR 기계의 온도 순환은 15분 동안 섭씨 50도에서 예열된 뚜껑을 한 다음 2분 동안 섭씨 95도입니다. 마지막으로, 18사이클동안 섭씨 95도95°C의 15°C를 4분 동안 15초, 섭씨 60도, PCR 이후 워크스테이션에서 새로운 96웰 PCR 플레이트에서 DNA 서스펜션 버퍼 20마이크로리터로 5마이크로리터를 전송합니다.시작하려면 각 웰에 분석 로딩 시약 4 개의 마이크로 리터를 파이프하여 qPCR 분석 플레이트를 준비하십시오. 다음으로, 각 분석기의 4개의 마이크로리터를 2X 분석 플레이트에서 qPCR 플레이트로 옮기. qPCR 분석판을 섭씨 4도에서 유지합니다.프림 프림 주사기에서 제어 라인 유체를 칩의 두 개 내포 밸브에 분배합니다. 접시 아래에서 보호 플라스틱을 제거합니다. A1 위치에 노치 측이 있는 IFC 컨트롤러에 칩을 배치한 다음 프라임 스크립트를 선택하고 실행합니다.각 미세 유체 칩에 대해, 실시간 반응 믹스를 준비하기 위해 500 마이크로 리터의 PCR 마스터 믹스와 샘플 로딩 시약의 50 마이크로 리터를 혼합. 이 반응의 파이펫 4.4 마이크로리터는 이제 샘플 플레이트로 지정된 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 혼합됩니다. 다음으로, 이전에 희석된 cDNA의 파이펫 3.6 마이크로리터가 샘플 플레이트의 모든 우물로 들어갑니다.그 후, 분석 플레이트에서 칩의 노치 측에 해당하는 우물으로 5개의 마이크로리터를 옮길 수 있습니다. 샘플 플레이트에서 5개의 마이크로리터를 칩의 반대편에 있는 해당 우물로 옮기. 로드된 칩을 IFC 컨트롤러에 삽입하고 로드 믹스 스크립트를 실행합니다.그런 다음 칩을 BioMark 플랫폼으로 전송하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계측기를 설정한 다음 지정된 폴더에 칩 실행 파일을 저장합니다. 칩 실행이 완료되면 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 열고 파일을 열고 열어 칩런을 엽니다. bml 파일.소프트웨어 창의 왼쪽 위 모서리에 칩 탐색기및 칩 실행 요약을 찾습니다. 칩 실행 요약에서 검출기 설정을 클릭합니다. 작업에서 새 를 클릭하고 컨테이너 유형 SBS 플레이트 및 컨테이너 형식 SBS 96을 선택합니다.매핑 옆에 있는 타원이 있는 버튼을 클릭한 다음 M96-Assay-SBS96.dsp를 선택합니다. 분석 보기를 클릭합니다. 작업 아래 qPCR 탭에서 사용자 감지기에 대한 선형 유도체 및 CT 임계값 메서드에 대한 기준 수정을 선택합니다.CT 임계값 탭에서 자동 상자로 초기화를 확인한 다음 분석 단추를 클릭합니다. 분석 뷰의 오른쪽 상단 사분면에서 두 번째 탭인 결과 테이블을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 열맵 보기를 선택하고 데이터가 있는 열지도가 나타납니다.히트 맵 아래에서 임계값및 로그 그래프를 클릭합니다. 열지도의 열로 표시된 assays를 클릭하고 필요에 따라 임계값을 드래그하여 각 검출기에 대해 CT 임계값을 수동으로 조정하여 지수 단계의 증폭 곡선을 교차합니다. 완료되면 분석을 클릭합니다.다음으로 qPCR 데이터를 csv 파일로 내보냅니다. BioMark 컴퓨터에서 바탕 화면으로 qPCR 데이터를 전송합니다. 데이터를 스프레드시트 또는 통계 분석 소프트웨어로 가져오고 칩의 샘플 및 분석 위치로 결과를 매핑합니다.새로운 컬럼을 만들고 조건부 포뮬러를 사용하여 바이러스 유전자의 발현에 기초하여 세포를 그룹으로 구성합니다. 분석에서 X별로 맞는 Y를 선택하고 유전자 발현대 그룹을 플롯합니다. 그런 다음 FlowJo 버전 9을 사용하여 96 웰 플레이트에 해당하는 FACS 정렬에서 FCS 파일을 엽니다.파일 이름이 강조 표시되면 플랫폼, 이벤트 번호 게이트를 선택하고 인덱싱된 정렬 게이트를 만듭니다. 개별 셀이 행별로 표시됩니다. 모든 96 개의 셀을 강조 표시 한 다음 작업 영역을 선택하고 내보내고 보상 된 모든 바닥을 선택합니다.데이터에서 FCS 파일을 선택하고 내보내기를 클릭하고 지정된 폴더를 선택합니다. 개별 셀에 대한 새 FCS 파일을 새 FlowJo 작업 공간으로 드래그합니다. 모든 셀을 강조 표시하고 시그마 버튼, 평균 및 모든 형광 매개 변수로 표시되는 통계를 추가합니다.테이블 편집기를 열고 첫 번째 셀의 모든 바닥을 강조 표시하고 테이블 편집기 창으로 드래그합니다. 이 창에서 테이블 만들기 및 보기를 클릭합니다. 그런 다음 복사 붙여넣기또는 저장 및 시작 응용 프로그램 단추를 클릭하여 통계 소프트웨어에 복사하고 출력합니다.단일 셀 FACS 데이터를 JMP의 qPCR 데이터와 플레이트 번호 및 위치별로 병합합니다. 마지막으로 결합된 데이터에 대한 그래픽 및 통계 분석을 수행합니다. 본 연구에서, 다중 파라미터 유량 세포측정에 의한 단세포 표면 단백질 수량은 고다중 멀티플렉스 RTqPCR에 의한 정량적인 단세포 mRNA 발현과 통합된다.여기에 도시된 단세포 정량적 바이러스 유전자 발현은 Rhesus 마카크 CD4 양성 T 세포를 분류하였다. 부정적인 세포의 Tat/rev 양성 N은 안정화 전에 감염의 초기 단계와 부분적으로 접합된 바이러스성 RNA의 핵 수출과 일치하는 어두운 녹색에 있는 양성 세포의 N 보다는 tat/rev RNA의 더 적은 사본을 표현합니다. 양성 세포의 타/레브 양성 N에 있는 접합되지 않은 개그 RNA의 높은 풍부는 풍부한 게놈 RNA가 발현되고 신진 비온으로 포장되는 동안 말기 생산적인 감염과 일치합니다.단일 세포 바이러스 유전자, 숙주 유전자 및 숙주 표면 단백질 발현을 나타내는 이러한 트리변량플롯은 CD4 및 CD3 전사체가 유지되더라도 녹색으로 표시된 tat/rev 양성 세포에서 표면 CD4 및 CD3 단백질 발현이 감소한다는 것을 보여준다. 이 기술을 마스터하면 2~3일 후에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바이러스에 감염된 세포에서 분화된 유전자 및 단백질과 관련된 질문을 해결하기 위해 표적 단일 세포 프로토레틱 평가를 수행하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

연구

면역학 및 감염병학

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...