Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Forfatterne gjerne takke NIAID VRC Flow cytometri kjernen og MHRP Flow cytometri Core fasiliteter for vedlikehold og drift av FACS instrumenter og sortering utstyr; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song for ekspert teknisk assistanse; Michael Piatak Jr (død) for hjelp med SIV qPCR analysen design; og Brandon Keele og Matthew Scarlotta for SIV isolere sekvenser. Synspunktene er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer plasseringen av den amerikanske hæren eller forsvarsdepartementet. Forskningen ble utført under en godkjent dyr bruk protokoll i et AAALAC akkreditert anlegg i samsvar med det dyr velferd gjerning og andre føderale lover og forskrifter relatert til dyr og eksperimenter som involverer dyr og overholder personvernprinsippene angitt i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr, NRC publikasjon, 2011 utgaven.

Merk: En skjematisk av protokollen arbeidsflyten er vist i figur 1. Det består av tre viktigste trinn: FACS, RT og cDNA før forsterkning og qPCR for opptil 96 gener samtidig. To versjoner av protokollen, sortere celler i begrense fortynninger og sortering enkeltceller, er beskrevet nærmere i trinn 5 og 6, henholdsvis. Disse strategiene adresse ulike problemstillinger, men Følg lignende fremgangsmåter.
1. forutsetning eller tidligere analyser
<ol><li>Valider...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

Protokollen beskrevet her, kalt tSCEPTRE, integrerer encellede overflaten protein kvantifisering av multiparameter flowcytometri med kvantitative encellede mRNA uttrykk av meget multiplex RT-qPCR. Unionen av disse to teknologiene kan høyt innhold øyeblikksbilder av den kombinerte transcriptional og protein profilen til enkeltceller i et format som høy gjennomstrømming. Vi bruker metoden til å identifisere hittil unnvikende celler infisert med SIV i vivo, og Beskriv ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Pro...

Mange intracellulær patogener stole på verten celle maskiner å gjenskape, ofte endre vert cellebiologi eller målretting svært spesifikke subpopulasjoner av verten cellene å maksimere sine sjanser til overføring. Som et resultat, er celle biologiske prosesser ofte forstyrret, med skadelige konsekvenser for den generelle tilstanden til verten. Forstå samspillet mellom virus og verten cellene der de gjenskape vil belyse sykdom mekanismer som kan hjelpe til utvikling av bedre behandlinger og strategier å hindre infeksjon. Direkte analytisk verktøy som muliggjør studiet av vert-patogen interaksjoner er avgjørende mot dette formål. Én celle analyse er den eneste å entydig tillegge en mobilnettet fenotypen til bestemt genotype eller infeksjon status1. For eksempel skape patogene infeksjoner ofte både direkte og indirekte vertsceller. Derfor skille infiserte celler fra sine infisert kolleger er nødvendig å attributtendringer verten celle direkte infeksjon eller sekundære effekter, eksempel generalisert betennelse. Videre, for mange patogener, som SIV og humant immunsvikt-virus (HIV), verten celle infeksjon går gjennom flere faser, som tidlig, sent, eller latente, hver kan være preget av forskjellige gene og protein uttrykk profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser av cellen blandinger mislykkes å fange denne heterogene6. Derimot multiplekset svært encellede analyser kunne kvantifisere uttrykk for både virus og vert tilblivelse tilbud en betyr å løse infeksjon-spesifikke mobilnettet forstyrrelser, inkludert variasjoner over infeksjon stadier. Videre analysere vert-patogen interaksjoner i fysiologisk relevante innstillinger er avgjørende for identifikasjon av hendelser som forekommer i infiserte organismer. Dermed metoder som kan brukes direkte ex vivo er trolig best fange i vivo prosesser.
SIV og HIV målrette CD4+ T celler, som de motvirke vert antiviral "begrensning" faktorer og downregulate antigen presentere molekyler å etablere produktiv infeksjon og unngå immun overvåking7,8, 9,10,11. Uten behandling, infeksjonen resulterer i enorme tap av CD4+ T celler, til slutt kulminerte i ervervet immunodeficiency syndrome (AIDS)12. I innstillingen av antiretroviral terapi vedvare latently infiserte cellen reservoarer i flere tiår, poserer en formidabel barriere til helbredende strategier. Forstå egenskapene i vivo HIV/SIV-infiserte celler har potensial til å avsløre verten celle funksjoner i patogenesen og utholdenhet. Men har dette vært meget utfordrende, hovedsakelig på grunn av low frequency av infiserte celler og mangel på reagenser kan lett identifisere dem. Celler som transkribere viral RNA, er anslått til å være tilstede på 0,01 – 1% av CD4+ T celler i blodet og lymfoidvev13,14,15. Under undertrykkende terapi er latently infiserte celler enda sjeldnere 10-3– 10-7 16,17,18. Viral protein flekker søk som brukes til å studere i vitro infeksjoner, slik som for intracellulær Gag, er suboptimal på grunn av bakgrunnen flekker 0,01-0,1%, lik eller større enn hyppigheten av infiserte celler13, 14. Overflate flekk for konv protein bruker godt karakterisert SIV/HIV konv-spesifikke monoklonale antistoffer har også vist seg for å være vanskelig, trolig av lignende grunner. Nylig romanen verktøy mål å forbedre gjenkjenning av celler som uttrykker Gag enten omfatter søk bestemt for kneble RNA eller ved å bruke alternative bildebehandling teknologier14,15,19. Men disse forbli begrenset i antall kvantitative mål utføres på hver celle.
Her beskriver vi metodikk som (1) identifiserer enkelt virus-infiserte celler direkte ex vivo av sensitiv og bestemt viral genet kvantitative qPCR og (2) kvantifiserer uttrykk for opptil 18 overflaten proteiner og 96 gener for hver infisert (og infisert) cellen. Denne metodikken kombinerer encellede overflaten protein måling av FACS etterfulgt av umiddelbar celle lyse og gene expression analyse bruker multiplekset målrettet qPCR på Biomark systemet. Integrert fluidic krets (IFC) teknologien tillater multiplex kvantifisering av 96 gener fra 96 prøver samtidig ved en matrise av 9,216 kamre som individuelle qPCR reaksjonene utføres. Levende celle FACS sorteringen registrerer høyt innhold protein overflod mål mens bevare det hele transcriptome for analyse utført umiddelbart nedstrøms. Identifisere virus-infiserte celler, analyser bestemt alternativt skjøtes og unspliced viral RNAs (vRNA) er inkludert i qPCR analyse, sammen med et panel av brukerdefinerte analyser totalt opptil 96 gener, maksimalt antall analyser er innkvartert i IFC. Genuttrykk og protein-informasjon som er samlet for hver celle er knyttet av godt posisjon. Vi har tidligere rapportert resultater fra denne analysen andre steder20. Her gir vi mer detaljert metodiske retningslinjene samt ytterligere beskrivende phenotyping av SIV-infiserte CD4+ T celler.
Denne tilnærmingen, som vi kaller tSCEPTRE, kan brukes av suspensjon av noen levedyktig celle befolkningen reaktiv til fluorescently merket antistoffer og uttrykke en transcriptome kompatibel med tilgjengelig qPCR analyser. Det kan for eksempel brukes for å karakterisere differensial gene og protein uttrykk i sjeldne celler eller celler som ikke lett skilles ved overflaten protein. Eksempel utarbeidelsen er avhengig av en standard flekker kommersielt tilgjengelig antistoffer-protokoll. Cytometers med én celle sortering evnen er også kommersielt tilgjengelig, men flere biosikkerhet forholdsregler er nødvendige for behandling smittsomme lever celler. Innspillingen single - cellen protein uttrykk profilen for hver celle av godt posisjon, referert til heretter er som indeksert sortering, en vanlig funksjon i kommersielt tilgjengelig FACS sortering programvare. Beregningsorientert analyse av ulikt uttrykt vert gener blant celle populasjoner av interesse er ikke beskrevet her, men referanser tilbys til tidligere publiserte metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Én celle analyse er et viktig verktøy for dissekere heterogene bestander av celler. Identifisering og isolering av sjeldne celler kan være vanskelig. For å overvinne denne utfordringen, en metodikk kombinere indeksert flowcytometri og høy gjennomstrømming multiplex kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) ble utviklet. Målet var å identifisere og karakterisere simian immunsviktvirus (SIV)-infiserte celler innenfor rhesus aper. Gjennom kvantifisering av overflaten protein av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og mRNA av qPCR identifiseres virus-infiserte celler av viral genuttrykk, som er kombinert med verten genet og protein mål å opprette en flerdimensjonal profil . Vi kaller det tilnærming, målrettet encellede BG-transcriptional evaluering eller tSCEPTRE. For å utføre metoden, er levedyktige cellers farget med fluorescerende antistoffer spesifikke for overflate markører brukes for FACS isolering av en celle delsett og/eller nedstrøms fenotypiske analyse. Enkeltceller sorteres etterfulgt av umiddelbar lysis, multiplex omvendt transkripsjon (RT), PCR pre forsterkning og høy gjennomstrømning qPCR av opptil 96 transkripsjoner. FACS målinger registreres ved sortering og senere knyttet til den genuttrykk data av godt posisjon til å skape en kombinert protein og transcriptional profil. Å studere SIV-infiserte celler direkte ex vivo, cellene ble identifisert ved qPCR deteksjon av flere viral RNA arter. Kombinasjonen av viral utskrifter og antallet av hver gir en ramme for klassifisering celler i forskjellige stadier av viral levetid (f.eksproduktiv versus ikke-produktive). Videre var tSCEPTRE av SIV+ celler sammenlignet med infisert celler isolert fra samme prøven å vurdere ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Analysen avdekket tidligere verdsatt viral RNA uttrykk heterogenitet blant infiserte celler så vel som i vivo SIV-mediert post-transcriptional gene regulering med encellede oppløsning. Metoden tSCEPTRE er relevant for analyse av noen celle befolkningen mottakelig for identifikasjon av uttrykk av overflaten protein marker(s), vert eller patogen gene(s) eller kombinasjoner av disse.

Arbeidsflyten for hele protokollen er avbildet i figur 1. Det består av to varianter som er definert av antall celler sortert: enten begrensende fortynning eller som enkelt celler, som beskrevet i teksten. Eksempler på primer-sonden kvalifisering analyser på 2-fold føljetong RNA fortynninger vises i figur 2. Gating strategien for å identifisere potensielle SIV+ celler vises i Figur 3....

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Encellede kvantifisering av mRNA og overflaten Protein uttrykk i Simian immunsvikt-Virus-infiserte CD4+ T celler isolert fra Rhesus aper

Beskrevet er en metode for å quantitate uttrykket av 96 gener 18 overflaten proteiner av enkeltceller ex vivo, tillater for identifikasjon av ulikt uttrykt gener og proteiner i virus-infiserte celler i forhold til uninfected celler. Vi bruker tilnærming til studiet SIV-infiserte CD4+ T celler isolert fra rhesus aper.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen vertspatogeninteraksjoner som hva som er de unike egenskapene til de produktivt infiserte cellene, hvilke vertskofaktorer som tillater virus å etablere produktiv infeksjon, og hvordan man målretter disse cellene i terapeutiske inngrep. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir kvantitative tiltak for både protein og mRNA i enkeltceller, og de fleste reagenser er kommersielt tilgjengelige. Å demonstrere cellesorteringsprosedyren vil være Matthew Creegan, en senior tekniker fra strømmen cytometri kjernen i Doctor Michael Eller laboratorium.Til å begynne, i en utpekt pre-PCR molekylærbiologi arbeidsstasjon, forberede analysen blandingen ved å kombinere 96 genuttrykksanalyser i en RNase, DNase fritt rør sørge for å legge hver analyse til en endelig konsentrasjon av 180 nanomolar av fremover og omvendt primere. Tilsett DNA-suspensjonsbuffer for å oppnå riktig fortynning av analysen. For hver forventet 96 av 96 chip array, pipette seks mikroliter av hver analyse i en utpekt brønn av en 96 brønn PCR plate, deretter forsegle platen med et lim.For å begynne overflatefarging levedyktige celler, i en vevkultur biosikkerhet kabinett, først forberede kompensasjonsprøver og en master blanding av fluorescerende antistoff cocktail som beskrevet i tekstprotokollen. Tin de kryoserverte cellene i et 37 graders Celsius vannbad i to minutter. Etter dette, tilsett mellom 5 og to milliliter av cellesuspensjonen til et 15 milliliter rør som inneholder 12 milliliter PBS.Sentrifuge ved 500 G i tre minutter ved 25 grader Celsius, deretter aspirere PBS og resuspend pellet i tre milliliter med fersk PBS. Overfør denne blandingen til et fem milliliter polystyrenrør. Sentrifuge igjen på 500 G i tre minutter ved 25 grader Celsius.Aspirer det overnaturante, slik at ca 10 mikroliter gjenværende PBS. Deretter bruker du opptil 20 millioner vasket celler i 80 mikroliter antistoffcocktail. Inkuber i 20 minutter ved 25 grader Celsius mens den er beskyttet mot lys.Etter dette legger du til tre milliliter PBS. Sentrifuge ved 500 G i tre minutter og aspirer supernatanten. Gjenoppus cellene grundig i 300 til 500 mikroliter PBS.Filtrer denne løsningen ved å pipe den gjennom en 35 mikrometer nylon celle-sil cap. deretter holde cellene på is og beskyttet mot lys til den slags. Tilbake i pre-PCR arbeidsstasjon, først forberede RT preAMP reaksjon blanding i en enkelt RNase, DNase gratis sterilt rør som beskrevet i tekstprotokollen.Bruk en flerkanals pipette til å dispensere 10 mikroliter av denne reaksjonsblandingen i ønsket antall 96 brønns innsamlingsplater for PCR-sortering. Forsegle platen med selvklebende film og legg deretter platen på en forkjølt 96 brønn aluminiumblokk. Etter dette oppretter du cellesorteringsskjemaet og klargjør flyten cytometrisk cellesortering som beskrevet i tekstprotokollen.Angi de riktige instrumentinnstillingene for å angi antall og delsett av celler som skal sorteres i hver brønn. Fjern klebemiddelforseglingen, og sorter deretter cellene i de tilberedte 96 brønns PCR-oppsamlingsplatene. Reseal platen med frisk selvklebende film.Virvle umiddelbart den forseglede platen og sentrifuge ved 2000 G i ett minutt ved fire grader Celsius. Termosyklus platen i en PCR-maskin med et forvarmet lokk på 50 grader Celsius i 15 minutter etterfulgt av 95 grader Celsius i to minutter. Til slutt, termosyklus for 18 sykluser på 95 grader Celsius i 15 sekunder og 60 grader Celsius i fire minutter, deretter i en post-PCR arbeidsstasjon, overføre fem mikroliter cDNA til 20 mikroliter dna suspensjon buffer i en ny 96 brønn PCR plate.For å begynne, klargjør qPCR-analyseplaten ved å pipettere fire mikroliter med analyselastende reagens i hver brønn. Deretter overfører du fire mikroliter av hver analyse fra 2X-analyseplaten til qPCR-platen. Vedlikehold qPCR-analyseplaten ved fire grader Celsius.Dispenser kontrolllinjevæskene fra grunningssprøytene inn i de to inntaksventilene på brikken. Fjern den beskyttende plasten fra under platen. Plasser brikken på en IFC-kontroller med den hakklagte siden i A1-posisjonen, og velg deretter og kjør hovedskriptet.For hver mikrofluidiske chip, bland 50 mikroliter av prøven lasting reagens med 500 mikroliter av PCR master mix for å forberede sanntidreaksjonsblandingen. Pipette 4,4 mikroliter av denne reaksjonen blandes inn i hver brønn av en ny 96-brønns PCR-plate som nå er angitt som prøveplate. Deretter pipette 3,6 mikroliter av den tidligere fortynnede cDNA i hver brønn av prøveplaten.Etter dette overfører du fem mikroliter fra analyseplaten til tilsvarende brønn på den hakksiden av brikken. Overfør fem mikroliter fra prøveplaten til tilsvarende brønn på den andre siden av brikken. Sett inn den lastede brikken i IFC-kontrolleren og kjør lastblandingsskriptet.Deretter overfører du brikken til BioMark-plattformen og setter opp instrumentet som beskrevet i tekstprotokollen, og deretter lagrer du chip run-filen i en angitt mappe. Når chip run er fullført, åpne sanntid PCR analyse programvare og deretter velge fil, åpne, for å åpne chiprun. bml-filen.Finn chip explorer og chip run summary i øvre venstre hjørne av programvarevinduet. Under chip run sammendrag, klikk på detektor oppsett. Klikk ny under oppgave, og velg beholdertypen SBS-plate- og beholderformat SBS 96.Klikk på knappen med ellipsen ved siden av tilordningen, og velg deretter M96-Assay-SBS96.dsp. Klikk på analysevisninger. I kategorien qPCR under oppgave velger du grunnlinjekorrigering for lineær derivat- og CT-terskelmetode for brukerdetektorer.Merk av for initialiser med automatisk i kategorien CT-terskler, og klikk deretter analyser-knappen. Klikk på den andre fanen, resultattabellen øverst til høyre. Fra rullegardinmenyen velger du varmekartvisning, og varmekartet med dataene vises.Klikk terskel og logggraf under varmekartet. Juster CT-terskler manuelt for hver detektor ved å klikke på analyser, representert av kolonner på varmekartet, og dra terskelen etter behov for å krysse forsterkningskurvene i eksponentiell fase. Når du er ferdig, klikker du analyser.Deretter eksporterer du qPCR-dataene som en csv-fil. Overfør qPCR-data fra BioMark-datamaskinen til skrivebordet. Importer dataene til et regneark eller en statistisk analyseprogramvare, og tilordne resultatene etter eksempel- og analyseposisjoner på brikken.Opprett en ny kolonne og bruk en betinget formel til å organisere cellene i grupper basert på uttrykk for virale gener. Velg fit Y by X og plott genuttrykk kontra gruppe under analyse. Etter dette bruker du FlowJo versjon ni til å åpne FCS-filer fra FACS-sortering som tilsvarer en 96-brønnplate.Når filnavnet er uthevet, velger du plattform, hendelsesnummerport og oppretter indekserte sorteringsporter. Individuelle celler vises etter rad. Merk alle 96 celler og velg deretter arbeidsområde, eksporter, velg alle kompenserte gulv.Velg FCS-fil under data, klikk eksporter, og velg en angitt mappe. Dra de nye FCS-filene for individuelle celler til et nytt FlowJo-arbeidsområde. Merk alle cellene og klikk legg til statistikk, representert ved sigma-knappen, gjennomsnitt og alle fluorescensparametere.Åpne tabellredigeringsprogrammet, og merk deretter alle etasjene i den første cellen og dra dem inn i tabellredigeringsvinduet. Klikk opprett og vis tabell i dette vinduet. Etter dette kopierer og utdata du til en statistisk programvare enten ved å kopiere lime inn eller ved å klikke på knappen lagre og start program.Slå sammen facs-dataene med qPCR-dataene i JMP med platenummeret og godt plassert. Til slutt utfører du grafiske og statistiske analyser på de kombinerte dataene. I denne studien er encellede overflateproteinmengder ved multiparameterflytcytometri integrert med kvantitativt encellemRNA-uttrykk ved svært multipleksede RTqPCR.Vist her er encellede kvantitative viralgenuttrykk fra FACS sortert Rhesus macaque CD4 positive T-celler. Tat/rev positiv N av negative celler uttrykker færre kopier av tat/rev RNA enn N av positive celler i mørkegrønn som er i samsvar med et tidlig infeksjonsstadium før stabilisering og en kjernefysisk eksport av delvis skjøtet viral RNA. En høy overflod av upåaktet Gag-RNA i tat / rev positiv N av positive celler er konsistent med sen stadium produktiv infeksjon der rikelig genomisk RNA uttrykkes og pakkes inn i spirende virions.Dette trivariate plottet som viser encellede virale genet, vertsgenet og vertsproteinuttrykket viser at overflate-CD4 og CD3-proteinuttrykket reduseres i tat / rev positive celler vist i grønt, selv om CD4- og CD3-transkripsjoner opprettholdes. Når mestret, kan denne teknikken gjøres i to til tre dager. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utfører målrettet enkeltcelleprototranscriptional evaluering for å løse spørsmål knyttet til differensialt uttrykte gener og proteiner i viralt infiserte celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduksjon av Naive CD4 T-celler for å studere Treg Differensiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolasjon og Th17 Differensiering av naive CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk og funksjonell analyse av Aktivert regulatoriske T-celler isolert fra kronisk lymfatisk choriomeningittvirus-infiserte mus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...