Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Os autores gostaria de agradecer o NIAID VRC Flow Cytometry núcleo e as instalações do núcleo de citometria de fluxo MHRP para manutenção e operação de instrumentos de FACS e classificação de equipamentos; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song para assistência técnica especializada; Michael Piatak, Jr. (falecido) para obter assistência com projeto de ensaio qPCR SIV; e Brandon Keele e Matthew Scarlotta para SIV isolar sequências. As opiniões expressadas são as dos autores e não devem ser interpretadas para representar as posições do exército dos EUA ou o departamento de defesa. Pesquisa foi conduzida sob um protocolo aprovado uso de animais em uma facilidade AAALAC credenciado em conformidade com o Animal Welfare Act e outros estatutos federais e regulamentos relativos a animais e experimentos envolvendo animais e adere aos princípios indicado no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, publicação do NRC, edição 2011.

Nota: Um esquema de fluxo de trabalho do protocolo é mostrado na Figura 1. Consiste em três etapas principais: FACS, RT e pré-amplificação do cDNA e qPCR para até 96 genes simultaneamente. Duas versões do protocolo, classificação de células em limitar as diluições e classificação células únicas, são descritas mais detalhadamente nas etapas 5 e 6, respectivamente. Estas estratégias abordar questões de investigação diferentes, mas seguem procedimentos semelhantes.
<p c...

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O protocolo descrito aqui, denominado tSCEPTRE, integra a quantificação da proteína de superfície de célula única por citometria de fluxo multiparâmetros com expressão de RNAm de célula única quantitativa por RT-qPCR altamente multiplexado. A União dessas duas tecnologias permite snapshots de alto teor do combinado transcriptional e perfil de proteína de células individuais em um formato de alta produtividade. Usamos o método para identificar células até então indescritíveis infectadas com SIV na vi...

Muitos patógenos intracelulares contam com máquinas de célula de acolhimento para replicar, muitas vezes alterando a biologia de pilha de anfitrião ou direcionamento especifico subpopulações de células hospedeiras para maximizar suas chances de propagação. Como resultado, processos biológicos células comumente são rompidos, com consequências deletérias para a saúde geral do hospedeiro. Compreender as interações entre os vírus e as células hospedeiras, na qual eles replicar irá elucidar mecanismos de doença que podem auxiliar no desenvolvimento de terapias melhoradas e estratégias para prevenir a infecção. Diretas ferramentas analíticas que permitem o estudo das interações patógeno-hospedeiro são essenciais para este fim. Análise de célula única fornece os meios apenas atribuem inequivocamente um fenótipo celular a um determinado genótipo ou infecção status1. Por exemplo, infecções patogênicas frequentemente induzem alterações directas e indirectas em células hospedeiras. Por conseguinte, distinguir células infectadas de seus homólogos não infectados é necessário atributo anfitrião célula alterações ou infecção direta ou efeitos secundários, tais como generalizada inflamação. Além disso, para muitos patógenos, como SIV e vírus de imunodeficiência humana (HIV), infecção de célula de acolhimento prossegue através de múltiplos estágios, tais como cedo, tarde, ou latente, cada uma delas pode ser caracterizada por gene distinto e de perfis de expressão da proteína2 , 3 , 4 , 5. as análises em massa das misturas de célula irão falhar capturar esta heterogeneidade6. Por outro lado, altamente multiplexado análises de célula única capazes de quantificar a expressão dos dois viral e genes de host oferecem um meio para resolver perturbações celulares específicos de infecção, incluindo variações em fases de infecção. Além disso, analisando interações patógeno-hospedeiro em fisiologicamente configurações relevantes é fundamental para a identificação dos eventos que ocorrem em organismos infectados. Assim, processos de métodos que podem ser aplicados diretamente ex vivo são susceptíveis de melhor captura na vivo .
SIV e HIV CD4-alvo+ T células, no qual eles neutralizar fatores do hospedeiro antiviral "restrição" e downregulate apresentadoras de moléculas para estabelecer infecção produtiva e evitar a vigilância imune7,8, 9,10,11. Sem tratamento, a infecção resulta em enormes perdas de CD4+ T células, em última análise, culminando na adquirida da imunodeficiência síndrome (AIDS)12. No cenário da terapia anti-retroviral, reservatórios de células Latentemente infectadas persistirem por décadas, colocando uma barreira formidável para estratégias curativas. Compreender as propriedades na vivo de células infectadas pelo VIH/SIV tem potencial para revelar características de célula de acolhimento fundamental na patogênese e persistência. No entanto, isto tem sido altamente desafiador, principalmente devido a low frequency de células infectadas e falta de reagentes prontamente reconhecê-los. Células que transcrevem RNA viral, estima-se que para estar presente no 1 – 0,01% de CD4+ T células no sangue e tecido linfoide13,14,15. Sob terapia supressiva, células Latentemente infectadas são ainda menos frequentes em 10-3– 10-7 16,17,18. Coloração da proteína viral ensaios que funcionam bem para estudar em vitro infecções, tais como para Gag intracelular, são suboptimal devido a coloração de fundo de 0.01-0.1%, similar ou maior do que a frequência de células infectadas13, 14. Coloração da superfície para proteína Env usando bem caracterizadas SIV/HIV Env específicas os anticorpos monoclonais também provou ser difícil, provavelmente por razões semelhantes. Recentemente, novas ferramentas que visam melhorar a detecção de células expressando mordaça por qualquer incorporando os ensaios específicos para mordaça RNA ou usando tecnologias alternativas de imagem14,15,19. No entanto, essas abordagens permanecem limitadas no número de medições quantitativas executadas em cada célula.
Aqui, descrevemos a metodologia que (1) identifica células infectadas por vírus única diretamente ex vivo por qPCR quantitativo sensível e específica do gene viral e (2) quantifica a expressão de proteínas de superfície até 18 e 96 genes para cada infectado (e célula não infectada). Esta metodologia combina a medição da proteína de superfície de célula única por FACS seguido de lise celular imediata e expressão de gene análise usando multiplexado qPCR alvo no sistema Biomark. A tecnologia de circuito integrado de fluídico (IFC) permite a quantificação multiplexada de 96 genes de 96 amostras simultaneamente, realizado por uma matriz de 9.216 câmaras em que são realizadas as reações individuais qPCR. A classificação de células vivas FACS registra medições de abundância de alto teor de proteína, enquanto preservar a transcriptoma inteira para análise realizada imediatamente a jusante. Para identificar as células infectadas por vírus, ensaios específicos para RNAs virais alternativamente emendados e unspliced (vRNA) estão incluídos na análise qPCR, juntamente com um painel de ensaios definidos pelo usuário, totalizando até 96 genes, o número máximo de ensaios atualmente acomodadas em a IFC. A expressão de gene e proteína informações coletadas para cada célula são ligados por posição bem. Anteriormente, informou20resultados desta análise em outro lugar. Aqui, nós fornecemos mais detalhadas orientações metodológicas, bem como mais descritiva fenotipagem de CD4 infectadas SIV+ T células.
Esta abordagem, que nós chamamos de tSCEPTRE, pode ser aplicada para as suspensões de qualquer população de célula viável reativa para anticorpos fluorescente etiquetados e expressando um transcriptome compatível com ensaios de qPCR disponível. Por exemplo, ele pode ser usado para caracterizar gene diferencial e expressão de proteínas em raras células ou células não facilmente distinguidas por marcadores de proteína. A preparação da amostra se baseia em um padrão que mancha o protocolo usando anticorpos comercialmente disponíveis. Cytometers com capacidade de classificação de célula única também estão disponíveis comercialmente, mas precauções de biossegurança adicionais são necessárias para o processamento de células vivas infecciosas. Gravar o perfil de expressão de proteínas de célula única – para cada célula pela posição bem, referida aqui como indexados a classificação, é uma característica comum de FACS comercialmente disponível software de classificação. Análise computacional de genes diferencialmente expressos anfitrião entre populações de células de interesse não é descrito aqui, mas as referências são fornecidas métodos publicados anteriormente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Análise de célula única é uma ferramenta importante para dissecar heterogêneas populações de células. A identificação e isolamento de células raras podem ser difícil. Para superar este desafio, combinando uma metodologia indexados citometria de fluxo e elevado-throughput multiplexado quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) foi desenvolvido. O objetivo foi identificar e caracterizar o vírus da imunodeficiência símia (SIV)-infectados células presentes dentro macaques do rhesus. Através da quantificação da proteína classificando fluorescência-ativado da pilha (FACS) e mRNA por qPCR, células infectadas por vírus são identificadas pela expressão do gene viral, que é combinada com medidas de gene e proteína de anfitrião para criar um perfil multidimensional . Chamamos a abordagem, avaliação de célula única Proteo-transcriptional alvo ou tSCEPTRE. Para executar o método, células viáveis estão manchadas com anticorpos fluorescentes específicas para marcadores de superfície utilizados para isolamento de FACS de um subconjunto de células e/ou análise fenotípica a jusante. Células individuais são classificadas seguido de Lise imediata, multiplex transcrição reversa (RT), pré-amplificação por PCR e qPCR alto throughput de até 96 transcrições. Medições de FACS são registradas no momento da triagem e posteriormente relacionadas com os dados de expressão do gene por posição bem para criar uma proteína combinada e perfil transcricional. Para estudar infectados com SIV diretamente células ex vivo, as células foram identificadas por qPCR detecção de múltiplas espécies de RNA virais. A combinação de transcrição viral e a quantidade de cada fornecem uma estrutura para classificar as células em estágios diferentes do ciclo de vida viral (por exemplo, produtivo versus não-produtivos). Além disso, tSCEPTRE de células SIV+ foram em relação ao não infectados células isoladas do mesmo espécime para avaliar genes diferencialmente expressos anfitrião e proteínas. A análise revelou anteriormente apreciada heterogeneidade de expressão do RNA viral entre células infectadas, assim como na vivo mediada por SIV pós-transcricional gene regulamento com resolução de célula única. O método tSCEPTRE é relevante para a análise de qualquer população de célula passível de identificação pela expressão da proteína de superfície marker(s), host ou patógeno genes ou suas combinações.

O fluxo de trabalho para o protocolo inteiro é representado na Figura 1. Consiste em duas variações definidas pelo número de células ordenadas: qualquer diluição limitante ou como único células, conforme descrito no texto. Exemplos de análises de qualificação da primeira demão-sonda em 2 vezes diluições em série do RNA são mostrados na Figura 2. A estratégia associada para identificar potenciais células SIV<sup...

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações hospedeiro-patógeno, como quais são as características únicas das células produtivamente infectadas, quais cofatores de hospedeiro permitem que os vírus estabeleçam infecção produtiva e como direcionar essas células em intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece medidas quantitativas tanto para proteínas quanto para mRNA dentro de células únicas, e a maioria dos reagentes estão disponíveis comercialmente. Demonstrando o procedimento de triagem celular estará Matthew Creegan, um técnico sênior do núcleo de citometria de fluxo no laboratório do Doutor Michael Eller.Para começar, em uma estação de trabalho de biologia molecular pré-PCR designada, prepare a mistura de ensaios combinando 96 ensaios de expressão genética em um tubo RNase, livre de DNase certificando-se de adicionar cada ensaio a uma concentração final de 180 nanomolar de primers dianteiros e invertidos. Adicione o tampão de suspensão de DNA para obter a diluição apropriada da mistura de ensaio. Para cada matriz de chip 96 por 96, pipeta seis microliters de cada ensaio em um poço designado de uma placa PCR de 96 poços, em seguida, selar a placa com um adesivo.Para começar a coloração superficial de células viáveis, em um armário de biossegurança da cultura tecidual, primeiro prepare as amostras de compensação e uma mistura mestre de coquetel de anticorpos fluorescentes, conforme descrito no protocolo de texto. Descongele as células criopreservadas em um banho de água de 37 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, adicione entre 5 e dois mililitros da suspensão celular a um tubo de 15 mililitros contendo 12 mililitros de PBS.Centrifugar a 500 G por três minutos a 25 graus Celsius, depois aspirar o PBS e resuspensar a pelota em três mililitros de PBS fresco. Transfira esta mistura para um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Centrífuga mais uma vez a 500 G por três minutos a 25 graus Celsius.Aspire o supernascer, deixando aproximadamente 10 microliters resíduos pbs. Em seguida, resuspende até 20 milhões de células lavadas em 80 microliters de coquetel de anticorpos. Incubar por 20 minutos a 25 graus Celsius enquanto estiver protegido contra a luz.Depois disso, adicione três mililitros de PBS. Centrifugar a 500 G por três minutos e aspirar o supernante. Resuspense completamente as células em 300 a 500 microliters de PBS.Filtre esta solução pipetando-a através de uma tampa de 35 micrômetros de célula de nylon. em seguida, manter as células no gelo e protegido da luz até o tipo. De volta à estação de trabalho pré-PCR, primeiro prepare a mistura de reação pré-AMP RT em um único tubo estéril livre de RNase, como descrito no protocolo de texto.Usando uma pipeta multicanal, dispense 10 microliters desta mistura de reação no número desejado de 96 placas de coleta de tipo PCR bem. Sele a placa com filme adesivo e, em seguida, coloque a placa em um bloco de alumínio pré-refrigerado 96 bem. Depois disso, estabeleça o esquema de gating de classificação celular e prepare o classificador de células citométricas de fluxo conforme descrito no protocolo de texto.Digite as configurações de instrumentos apropriadas para especificar o número e o subconjunto das células a serem classificadas em cada poço. Remova o selo adesivo e, em seguida, FACS classifique as células nas placas de coleta PCR preparadas 96 bem. Reseal a placa com filme adesivo fresco.Imediatamente vórtice a placa resealada e, em seguida, centrífuga a 2000 G por um minuto a quatro graus Celsius. Termociclo a placa em uma máquina PCR com uma tampa pré-aquecido a 50 graus Celsius por 15 minutos seguido de 95 graus Celsius por dois minutos. Finalmente, termociclo para 18 ciclos de 95 graus Celsius por 15 segundos e 60 graus Celsius por quatro minutos, depois em uma estação de trabalho pós-PCR, transfira cinco microliters de cDNA em 20 microliters de tampão de suspensão de DNA em uma nova placa PCR de 96 poços.Para começar, prepare a placa de ensaio qPCR, tubondo quatro microliters de reagente de carga de ensaios em cada poço. Em seguida, transfira quatro microliters de cada ensaio da placa de ensaio 2X para a placa qPCR. Mantenha a placa de ensaio qPCR a quatro graus Celsius.Distribua os fluidos da linha de controle das seringas de escorvamento nas duas válvulas de admissão do chip. Remova o plástico protetor debaixo da placa. Coloque o chip em um controlador IFC com o lado entalhado na posição A1 e selecione e execute o script principal.Para cada chip microfluido, misture 50 microliters do reagente de carregamento de amostras com 500 microliters de mix mestre pcr para preparar a mistura de reação em tempo real. Pipetas 4.4 microliters desta mistura de reação em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços agora designada como a placa de amostra. Em seguida, pipeta 3,6 microliters do CDNA previamente diluído em cada poço da placa de amostra.Depois disso, transfira cinco microliters da placa de ensaio para o poço correspondente no lado entalhado do chip. Transfira cinco microliters da placa de amostra para o poço correspondente do outro lado do chip. Insira o chip carregado no controlador IFC e execute o script de mixagem de carga.Em seguida, transfira o chip para a plataforma BioMark e configure o instrumento conforme descrito no protocolo de texto e, em seguida, salve o arquivo de execução do chip em uma pasta designada. Quando a execução do chip estiver concluída, abra o software de análise pcr em tempo real e selecione o arquivo, aberto, para abrir o chiprun. arquivo bml.No canto superior esquerdo da janela de software, localize o explorador de chips e o resumo da execução do chip. Em resumo de execução do chip, clique na configuração do detector. Em tarefa, clique em novo e selecione a placa SBS tipo contêiner e o formato de contêiner SBS 96.Clique no botão com a elipse ao lado do mapeamento e selecione M96-Assay-SBS96.dsp. Clique nas visualizações de análise. Na guia qPCR em tarefa, selecione a correção da linha de base para o método de derivativo linear e limiar de TC para detectores de usuários.Na guia limiares ct, verifique o inicialize com caixa automática e, em seguida, clique no botão analisar. No quadrante superior direito das visualizações de análise, clique na segunda guia, tabela de resultados. No menu suspenso, selecione a exibição do mapa de calor e o mapa de calor com os dados aparecerá.Sob o mapa de calor, clique no limiar e no gráfico de registro. Ajuste os limiares de tomografia manualmente para cada detector clicando em ensaios, representados por colunas no mapa de calor, e arrastando o limiar conforme necessário para cruzar as curvas de amplificação na fase exponencial. Quando terminar, clique em analisar.Em seguida, exporte os dados qPCR como um arquivo csv. Transfira dados qPCR do computador BioMark para sua área de trabalho. Importe os dados em um software de planilha ou análise estatística e mapeie os resultados por amostra e posições de ensaio no chip.Crie uma nova coluna e use uma fórmula condicional para organizar as células em grupos baseados na expressão de genes virais. Em análise, selecione fit Y por X e plote expressão genética versus grupo. Depois disso, use a versão 9 do FlowJo para abrir arquivos FCS do tipo FACS correspondente a uma placa de 96 poços.Com o nome do arquivo destacado, selecione a plataforma, o portão do número do evento e crie portões de classificação indexados. Células individuais aparecerão exibidas por linha. Destaque todas as 96 células e selecione espaço de trabalho, exporte, selecione todos os andares compensados.Em dados, selecione arquivo FCS, clique em exportar e selecione uma pasta designada. Arraste os novos arquivos FCS para células individuais em um novo espaço de trabalho FlowJo. Destaque todas as células e clique em adicionar estatísticas, representadas pelo botão sigma, média e todos os parâmetros de fluorescência.Abra o editor da mesa, em seguida, destaque todos os andares do primeiro celular e arraste-os para a janela do editor da mesa. Nesta janela, clique em criar e visualizar a tabela. Depois disso, copie e exaboia em um software estatístico, copiando ou clicando no botão salvar e iniciar o aplicativo.Mescle os dados FACS de célula única com os dados qPCR em JMP pelo número da placa e posição do poço. Por fim, realize análises gráficas e estatísticas sobre os dados combinados. Neste estudo, a quantitação de proteína de superfície unicelular por citometria de fluxo de vários parâmetros é integrada com a expressão quantitativa de mRNA de célula única por RTqPCR altamente multiplexado.Mostrado aqui é uma única célula expressão quantitativa do gene de facs classificada células T de Rhesus macaque. Tat/rev positivo N de células negativas expressam menos cópias de tat/rev RNA do que o N de células positivas em verde escuro que é consistente com um estágio inicial de infecção antes da estabilização e uma exportação nuclear de RNA viral parcialmente emendado. Uma alta abundância de Gag-RNA não-pliced em tat/rev positivo N de células positivas é consistente com a infecção produtiva em estágio tardio durante a qual o RNA genômico abundante é expresso e embalado em virions brotantes.Este enredo trivariado exibindo o gene viral de célula única, gene hospedeiro e expressão de proteína de superfície hospedeira mostra que a expressão da proteína CD4 e CD3 da superfície é diminuída em células tat/rev positivas mostradas em verde, embora as transcrições de CD4 e CD3 sejam sustentadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois ou três dias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar avaliação prototranscricional de células únicas direcionadas para abordar questões relativas a genes e proteínas expressos diferencialmente em células infectadas viralmente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

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Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...