Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Los autores desean agradecer a la base de citometría de flujo de NIAID VRC y las instalaciones de la base de Cytometry del flujo MHRP para mantenimiento y operación de FACS instrumentos y equipos de clasificación; María Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song expertos asistencia técnica; Michael Piatak, Jr. (fallecido) para obtener ayuda con diseño de ensayo qPCR SIV; y Brandon Keele y Matthew Scarlotta para SIV aislar secuencias. Las opiniones expresadas son las de los autores y no deben ser interpretadas para representar las posiciones del ejército de Estados Unidos o el Departamento de defensa. Investigación se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado uso de animales en una instalación AAALAC acreditado conforme a la ley de Bienestar Animal y otros estatutos federales y reglamentos relativos a los animales y experimentos con animales y se adhiere a los principios indicado en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicación del NRC, edición 2011.

Nota: Un esquema del flujo de trabajo de protocolo se muestra en la figura 1. Consta de tres pasos principales: FACS, RT y pre amplificación de cDNA y qPCR para hasta 96 genes simultáneamente. Dos versiones del Protocolo, clasificar las células en la limitación de las diluciones y clasificación de las células, se describen en mayor detalle en el paso 5 y paso 6, respectivamente. Estas estrategias de investigación diferentes cuestiones pero seguir procedimientos similares.
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El protocolo aquí descrito, denominado tSCEPTRE, integra la cuantificación de la proteína unicelular de la superficie por citometría de flujo multiparamétrico con la expresión de mRNA de unicelular cuantitativa por RT-qPCR altamente multiplexado. La Unión de estas dos tecnologías permite instantáneas de alto contenido de combinado transcripcionales y perfil proteico de las células en un formato de alto rendimiento. Utilice el método para identificar células hasta ahora esquivos infectadas con SIV en vivo<...

Muchos patógenos intracelulares dependen de maquinaria de la célula huésped para replicar, a menudo alterando la biología de la célula huésped o dirigidas a subpoblaciones muy específicas de las células del huésped para maximizar sus posibilidades de propagación. Como resultado, los procesos biológicos celulares comúnmente se interrumpen, con consecuencias deletéreas para la salud general del hospedero. Comprensión de las interacciones entre el virus y las células hospedadoras que replican a aclarar mecanismos de la enfermedad que pueden ayudar en el desarrollo de mejores terapias y estrategias para prevenir la infección. Directas herramientas analíticas que permiten el estudio de las interacciones huésped-patógeno son esenciales para este fin. Sola célula análisis proporciona el único medio para atribuir inequívocamente un fenotipo celular a un genotipo particular o infección estado1. Por ejemplo, infecciones patógenas frecuentemente inducen cambios directos e indirectos en las células del huésped. Por lo tanto, distinguir las células infectadas de sus contrapartes no infectadas es necesario cambios de atributo anfitrión célula infección directa o efectos secundarios, tales como generalizada inflamación. Por otra parte, para muchos patógenos, como el SIV y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección de la célula huésped procede a través de etapas múltiples, tales como temprano, tarde, o latente, que puede caracterizarse por genes distintos y de perfiles de expresión de la proteína2 , 3 , 4 , 5. Análisis de bulk de mezclas celular dejará de capturar esta heterogeneidad6. Por el contrario, altamente multiplexadas en análisis unicelulares capaces de cuantificar la expresión de ambos virus y genes de host ofrecen un medio para resolver las perturbaciones celulares específicos de infección, incluyendo las variaciones en distintas etapas de la infección. Además, análisis huésped-patógeno en fisiológicamente ajustes pertinentes es fundamental para la identificación de eventos que se producen en los organismos infectados. Así, los procesos de métodos que pueden aplicarse directamente ex vivo son probablemente mejor captura en vivo .
SIV y VIH objetivo CD4+ T las células, en el cual ellos contrarrestar factores antivirales "restricción" de host y downregulate antígeno que presenta las moléculas para establecer infección productiva y evitar la vigilancia inmune7,8, 9,10,11. Sin tratamiento, la infección resulta en la pérdida masiva de CD4+ T de las células, en última instancia culminando en adquirido de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA)12. En el marco de la terapia antiretroviral, célula latente infectada depósitos persisten durante décadas, planteando una barrera formidable a estrategias curativas. Comprender las propiedades de en vivo células infectadas por el VIH/SIV tiene el potencial para revelar características de la célula de host en la patogenia y persistencia. Sin embargo, esto ha sido muy difícil, debido principalmente a la obviados de las células infectadas y la falta de reactivos capaces de identificarlos fácilmente. Las células que transcriben el ARN viral, se estima que en 0.01 – 1% de CD4+ T las células en la sangre y tejido linfoide13,14,15. Bajo tratamiento supresivo, células latente infectadas son aún menos frecuentes en 10-3-10-7 16,17,18. La coloración de la proteína viral ensayos que trabajo bien para el estudio de las infecciones in vitro , tales como Gag intracelular, son subóptimos debido a la tinción de fondo de 0.01 – 0.1%, similar o mayor que la frecuencia de las células infectadas13, 14. Coloración superficial para proteína Env bien caracterizados anticuerpos monoclonales SIV y VIH Env-específicas también ha demostrado ser difícil, probablemente por razones similares. Recientemente, nuevas herramientas tienen por objeto mejorar la detección de las células que expresan la mordaza ya sea por la incorporación de ensayos específicos para gag RNA o usando proyección de imagen alternativas tecnologías14,15,19. Sin embargo, estos enfoques siguen siendo limitados en el número de mediciones cuantitativas realizadas en cada célula.
Aquí, describimos la metodología que (1) identifica las células virus-infectadas directamente ex vivo por gene viral sensible y específico cuantitativo qPCR y (2) cuantifica la expresión de proteínas de la superficie hasta 18 y 96 genes por cada infectado (y célula no infectada). Esta metodología combina la medición de la proteína unicelular de la superficie por FACS seguido de lisis celular inmediata y análisis de expresión génica usando multiplexado qPCR específica en el sistema de Biomark. La tecnología integrado circuito fluídico (IFC) permite cuantificación multiplexada de 96 genes de 96 muestras al mismo tiempo, logrado por una matriz de 9.216 cámaras en las que se realizan las reacciones individuales de la qPCR. La clasificación de células vivas FACS registra las mediciones de abundancia de proteína de alto contenido mientras que preserva el transcriptoma completo para análisis realizados inmediatamente aguas abajo. Para identificar las células virus-infectadas, ensayos específicos para RNAs virales o bien empalmados y unspliced (vRNA) están incluidos en el análisis de qPCR, junto a un panel de análisis definidos por el usuario por un total de hasta 96 genes, el número máximo de ensayos actualmente alojados en la IFC. La expresión de genes y proteína información recogido para cada celda están vinculados por la posición bien. Divulgamos previamente los resultados de este análisis en otro lugar20. Presentamos más detallada lineamientos metodológicos así como más descriptivo phenotyping de CD4 infectados por SIV+ T las células.
Este enfoque, que llamamos tSCEPTRE, puede aplicarse a las suspensiones de cualquier población de células viables reactiva a anticuerpos fluorescente etiquetados y expresando un transcriptoma compatible con ensayos de qPCR disponibles. Por ejemplo, puede utilizarse para la caracterización génica diferencial y expresión de proteínas en las células raras o no fácilmente distinguidas por marcadores de la proteína de la superficie de las células. La preparación de la muestra se basa en un estándar de protocolo utilizando anticuerpos comercialmente disponibles de tinción. Citómetros con capacidad clasificación unicelulares están también disponibles comercialmente, pero medidas de bioseguridad adicionales son necesarios para el procesamiento de células vivas infecciosas. Registrar el perfil de expresión – una proteína de la célula para cada celda por bien puesto, contemplado en el presente como indexadas clasificación, es una característica común de FACS comercialmente disponible software de clasificación. Análisis computacional de genes diferencialmente expresados host entre poblaciones celulares de interés no se describen aquí, pero se proporcionan referencias a los métodos previamente publicados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

El análisis unicelular es una herramienta importante para poblaciones heterogéneas de células de disección. La identificación y aislamiento de células pueden ser difíciles. Para superar este desafío, una combinación de metodología indexadas citometría de flujo y reacción en cadena de alto rendimiento multiplexados cuantitativa de la polimerasa (qPCR) fue desarrollada. El objetivo fue identificar y caracterizar el virus de la inmunodeficiencia símica (VIS)-infectó las células presentes en macaques del macaco de la India. A través de la cuantificación de la proteína de la superficie de separación de células activado por fluorescencia (FACS) y mRNA por qPCR, células infectadas por virus se identifican por la expresión génica viral, que se combina con medidas gen y la proteína de host para crear un perfil multidimensional . Llamamos el enfoque de evaluación unicelulares Proteo-transcripcional dirigida y tSCEPTRE. Para realizar el método, células viables se tiñen con anticuerpos fluorescentes específicas para marcadores de superficie utilizados para el aislamiento de la FACS de un subconjunto de células y análisis fenotípico aguas abajo. Las células se clasifican seguido de lisis inmediata, multiplex transcripción reversa (RT), la amplificación por PCR y qPCR de alto rendimiento de hasta 96 transcripciones. Mediciones de FACS se registran en el momento de la clasificación y posteriormente vinculadas a los datos de expresión genética por posición bien para crear un perfil transcripcional y proteína combinada. Para estudiar infectados por SIV directamente células ex vivo, las células fueron identificadas por la detección de la qPCR de múltiples especies de RNA virales. La combinación de la transcripción viral y la cantidad de cada uno proporcionan un marco para clasificar las células en distintas etapas del ciclo de vida viral (p. ej., productivo versus no-productivos). Además, tSCEPTRE de las células SIV+ eran en comparación con no infectado células aisladas de la misma muestra para evaluar diferencialmente expresados anfitrión genes y proteínas. El análisis reveló previamente poco apreciado heterogeneidad de expresión RNA viral en células infectadas como en vivo gen postranscripcional mediada por SIV Reglamento con resolución unicelular. El método tSCEPTRE es relevante para el análisis de cualquier población de células susceptible de identificación por la expresión del marcador de la proteína de la superficie, host o patógeno genes o combinaciones de las mismas.

El flujo de trabajo para el conjunto del Protocolo se muestra en la figura 1. Consta de dos variantes definidas por el número de células ordenadas: cualquier dilución limitante o como solo las células, como se describe en el texto. En la figura 2se muestran ejemplos de análisis de calificación primer-probe 2 veces diluciones seriadas de la RNA. La estrategia de bloquea para identificar posibles células SIV+ se m...

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones huésped-patógeno, como cuáles son las características únicas de las células infectadas productivamente, qué cofactores del huésped permiten a los virus establecer la infección productiva y cómo atacar estas células en intervenciones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona medidas cuantitativas para proteínas y ARNM dentro de células individuales, y la mayoría de los reactivos están disponibles comercialmente. Demostrando el procedimiento de clasificación celular estará Matthew Creegan, un técnico superior del núcleo de citometría de flujo en el laboratorio del Doctor Michael Eller.Para comenzar, en una estación de trabajo de biología molecular pre-PCR designada, prepare la mezcla de ensayos combinando 96 ensayos de expresión génica en un tubo libre de RNase, DNase asegurándose de agregar cada ensayo a una concentración final de 180 nanomolares de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás. Añadir tampón de suspensión de ADN para lograr la dilución adecuada de la mezcla de ensayo. Para cada matriz de chips prevista de 96 por 96, pipetee seis microlitros de cada ensayo en un pozo designado de una placa PCR de 96 pozos, luego selle la placa con un adhesivo.Para comenzar la tinción superficial de células viables, en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejido, primero prepare las muestras de compensación y una mezcla maestra de cóctel de anticuerpos fluorescentes como se describe en el protocolo de texto. Descongelar las celdas crioconservadas en un baño de agua celsius de 37 grados durante dos minutos. Después de esto, añadir entre 5 y dos mililitros de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga 12 mililitros de PBS.Centrifugar a 500 G durante tres minutos a 25 grados Celsius, luego aspirar el PBS y resuspender el pellet en tres mililitros de PBS fresco. Transfiera esta mezcla a un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Centrifugar una vez más a 500 G durante tres minutos a 25 grados centígrados.Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 10 microlitros residuales PBS. A continuación, resuspender hasta 20 millones de células lavadas en 80 microlitros de cóctel de anticuerpos. Incubar durante 20 minutos a 25 grados centígrados mientras esté protegido de la luz.Después de esto, agregue tres mililitros de PBS. Centrifugar a 500 G durante tres minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspender a fondo las células en 300 a 500 microlitros de PBS.Filtrar esta solución pipeteándola a través de una tapa de 35 micrómetros de nylon cell-strainer. luego mantener las células sobre hielo y protegidas de la luz hasta el tipo. De vuelta en la estación de trabajo pre-PCR, primero prepare la mezcla de reacción preAMP RT en un solo tubo estéril libre de RNase, DNase como se describe en el protocolo de texto.Usando una pipeta multicanal, dispensar 10 microlitros de esta mezcla de reacción en el número deseado de placas de recogida de clasificación PCR de 96 pozos. Selle la placa con película adhesiva y luego coloque la placa en un bloque de aluminio pre-refrigerado de 96 pozos. Después de esto, establezca el esquema de medición de celdas y prepare el clasificador de celdas citométricas de flujo como se describe en el protocolo de texto.Introduzca la configuración de instrumento adecuada para especificar el número y subconjunto de celdas que se ordenarán en cada pozo. Retire el sello adhesivo, luego FACS clasifre las células en las placas de recolección de PCR preparadas de 96 pozos. Vuelva a sellar la placa con película adhesiva fresca.Inmediatamente vórtice la placa resedada y luego centrifugar a 2000 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Termocicla la placa en una máquina PCR con una tapa precalentada a 50 grados Celsius durante 15 minutos seguido de 95 grados Celsius durante dos minutos. Finalmente, termociclo para 18 ciclos de 95 grados Celsius durante 15 segundos y 60 grados Celsius durante cuatro minutos, luego en una estación de trabajo post-PCR, transferir cinco microlitros de cDNA en 20 microlitros de tampón de suspensión de ADN en una nueva placa PCR de 96 pozos.Para empezar, prepare la placa de ensayo qPCR pipeteando cuatro microlitros de reactivo de carga de ensayo en cada pozo. A continuación, transfiera cuatro microlitros de cada ensayo desde la placa de ensayo 2X a la placa qPCR. Mantenga la placa de ensayo qPCR a cuatro grados centígrados.Dispensar los fluidos de la línea de control de las jeringas de cebado en las dos válvulas de admisión del chip. Retire el plástico protector de debajo de la placa. Coloque el chip en un controlador IFC con el lado con muesca en la posición A1, luego seleccione y ejecute el script principal.Para cada chip microfluídico, mezcle 50 microlitros del reactivo de carga de muestra con 500 microlitros de mezcla maestra de PCR para preparar la mezcla de reacción en tiempo real. Pipette 4.4 microlitros de esta mezcla de reacción en cada pozo de una nueva placa PCR de 96 pozos ahora designada como la placa de muestra. A continuación, pipeteadores 3,6 microlitros del ADNc previamente diluido en cada pozo de la placa de muestra.Después de esto, transfiera cinco microlitros de la placa de ensayo al pozo correspondiente en el lado con muesca del chip. Transfiera cinco microlitros de la placa de muestra al pozo correspondiente del otro lado del chip. Inserte el chip cargado en el controlador IFC y ejecute el script de mezcla de carga.A continuación, transfiera el chip a la plataforma BioMark y configure el instrumento como se describe en el protocolo de texto y, a continuación, guarde el archivo de ejecución de chip en una carpeta designada. Una vez completada la ejecución del chip, abra el software de análisis de PCR en tiempo real y, a continuación, seleccione el archivo, abra, para abrir el chiprun. bml archivo.En la esquina superior izquierda de la ventana del software, localice el explorador de chips y el resumen de ejecución de chip. En Resumen de ejecución de chip, haga clic en configuración del detector. En tarea, haga clic en nuevo y seleccione el tipo de contenedor SBS plate and container format SBS 96.Haga clic en el botón con los puntos suspensivos junto a la asignación y, a continuación, seleccione M96-Assay-SBS96.dsp. Haga clic en las vistas de análisis. En la pestaña qPCR en la tarea, seleccione la corrección de línea base para la derivada lineal y el método de umbral de TC para los detectores de usuario.En la pestaña Umbrales de TC, marque la casilla inicializar con automático y, a continuación, haga clic en el botón Analizar. En el cuadrante superior derecho de las vistas de análisis, haga clic en la segunda pestaña, tabla de resultados. En el menú desplegable, seleccione la vista de mapa de calor y aparecerá el mapa de calor con los datos.En el mapa de calor, haga clic en umbral y gráfico de registro. Ajuste los umbrales de TC manualmente para cada detector haciendo clic en los ensayos, representados por columnas en el mapa de calor, y arrastrando el umbral según sea necesario para intersectar las curvas de amplificación en la fase exponencial. Cuando haya terminado, haga clic en analizar.A continuación, exporte los datos qPCR como un archivo csv. Transfiera datos qPCR desde el ordenador BioMark a su escritorio. Importe los datos a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico y asigne los resultados por las posiciones de muestra y ensayo en el chip.Crea una nueva columna y usa una fórmula condicional para organizar las células en grupos basados en la expresión de genes virales. En Analizar, seleccione ajustar Y por X y trazar expresión génica frente a grupo. Después de esto, utilice FlowJo versión nueve para abrir archivos FCS de FACS que correspondan a una placa de 96 pozos.Con el nombre de archivo resaltado, seleccione plataforma, puerta de número de evento y cree puertas de ordenación indexadas. Las celdas individuales aparecerán por fila. Resalte las 96 celdas y, a continuación, seleccione el espacio de trabajo, exporte, seleccione todos los pisos compensados.En Datos, seleccione Archivo FCS, haga clic en Exportar y seleccione una carpeta designada. Arrastre los nuevos archivos FCS para celdas individuales a un nuevo espacio de trabajo FlowJo. Resalte todas las celdas y haga clic en Agregar estadísticas, representadas por el botón sigma, la media y todos los parámetros de fluorescencia.Abra el editor de tablas, resalte todos los pisos de la primera celda y arrástrelos a la ventana del editor de tablas. En esta ventana, haga clic en crear y ver la tabla. Después de esto, copie y genere en un software estadístico, ya sea copiando o haciendo clic en el botón Guardar e iniciar la aplicación.Combine los datos FACS de celda única con los datos qPCR en JMP por el número de placa y la posición del pozo. Por último, realice análisis gráficos y estadísticos de los datos combinados. En este estudio, la cuantificación de proteínas de superficie de una sola célula por citometría de flujo multiparámesis se integra con la expresión cuantitativa de ARNm de una sola célula mediante RTqPCR altamente multiplexado.Aquí se muestra la expresión génica viral cuantitativa de una sola célula de células T positivas Rhesus ordenadas Rhesus. Tat/rev positivo N de células negativas expresan menos copias de arn de tat/rev que la N de células positivas en verde oscuro que es consistente con una etapa temprana de infección antes de la estabilización y una exportación nuclear de ARN viral parcialmente empalmado. Una alta abundancia de ARN-GAG sin empalme en el N positivo de tat/rev de las células positivas es consistente con la infección productiva tardía durante la cual se expresa abundante ARN genómico y se empaqueta en viriones en ciernes.Esta gráfica trivariada que muestra el gen viral de una sola célula, el gen huésped y la expresión de proteína de superficie huésped muestra que la expresión de proteína CD4 y CD3 de superficie disminuye en las células positivas de tat/rev que se muestran en verde, aunque se mantengan las transcripciones CD4 y CD3. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos o tres días. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar una evaluación protorscriptual de una sola célula dirigida para abordar preguntas relacionadas con genes y proteínas expresados diferencialmente en células infectadas viralmente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Investigación

Inmunología e Infección

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

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La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

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