Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Författarna vill tacka NIAID VRC Flow flödescytometri kärnan och MHRP Flow flödescytometri Core faciliteter för underhåll och drift av FACS instrument och sortering utrustning. Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song för teknisk experthjälp; Michael Piatak, Jr. (död) för hjälp med SIV qPCR assay design; och Brandon Keele och Matthew Scarlotta för SIV isolera sekvenser. De åsikter som framförs är författarnas och ska inte tolkas för att representera ståndpunkter av den amerikanska armén eller försvarsdepartementet. Forskningen genomfördes enligt en godkänd användning av djur-protokollet i en AAALAC ackrediterade anläggning i enlighet med djurskyddslagen, andra federala lagar och förordningar som avser djur och experiment med djur och följer principerna anges i guiden för skötsel och användning av försöksdjur, NRC publikation, 2011 upplagan.

Obs: En schematisk av protokollet arbetsflödet visas i figur 1. Det består av tre huvudsakliga steg: FACS, RT och cDNA före förstärkning och qPCR för upp till 96 gener samtidigt. Två versioner av protokollet, sortering celler i begränsa utspädningar och sortering enstaka celler, beskrivs i detalj i steg 5 och steg 6, respektive. Dessa strategier itu olika frågeställningar men följa liknande förfaranden.
1. förkunskap eller tidigare analyser
<ol><li...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

Protokollet beskrivs här, kallas tSCEPTRE, integrerar encelliga ytan protein kvantifiering av multiparametrar flödescytometri med kvantitativa encelliga mRNA uttryck av mycket multiplexade RT-qPCR. Unionen av dessa två tekniker möjliggör hög-innehåll ögonblicksbilder av den kombinerade transkriptionell och protein profil av enstaka celler i en hög genomströmning format. Vi använder metoden för att identifiera hittills svårfångade celler infekterade med SIV i vivooch beskriva Differentiellt uttryckt...

Många intracellulära patogener lita på mottagande cell maskiner att replikera, ofta ändra värd cellbiologi eller inriktning mycket specifika subpopulations av värdceller att maximera sina chanser att förökning. Som ett resultat, störs cell biologiska processer ofta, med skadliga konsekvenser för den allmänna hälsan hos värden. Förstå samspelet mellan virus och värdcellerna där de replikera kommer att belysa sjukdomsmekanismer som får stöd i utvecklingen av förbättrade terapier och strategier för att förhindra infektion. Direkta analytiska verktyg som möjliggör studier av värd-patogen interaktioner är avgörande mot detta syfte. Encelliga analys ger det enda medlen att otvetydigt tillskriva en cellulär fenotyp en bestämd genotyp eller infektion status1. Till exempel framkalla patogena infektioner ofta både direkta och indirekta förändringar i värdceller. Därför skilja infekterade celler från deras oinfekterade motsvarigheter är nödvändigt att attributändringar värd cell antingen direkt infektion eller sekundära effekter, såsom generaliserad inflammation. Dessutom för många patogener, som SIV och mänskliga immunodeficiency virus (HIV), värd cell infektion fortskrider genom flera etapper, som tidigt, sent, eller latent, som alla kan kännetecknas av distinkta genen och protein expression profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser av cell blandningar kommer att misslyckas att fånga denna heterogenitet6. Däremot multiplexed mycket encelliga analyser kunna kvantifiera uttrycket av både virus och värd gener erbjuder ett sätt att lösa infektion-specifika cellulära störningar, inklusive varianter infektion investeringsfaser. Vidare, analysera värd-patogen interaktioner i fysiologiskt relevanta inställningar är kritiska för identifiering av händelser som inträffar i infekterade organismer. Således, metoder som kan tillämpas direkt ex vivo är sannolikt att bästa fånga i vivo processer.
SIV och HIV rikta CD4+ T celler, där de motverkar värd antivirala ”begränsning” faktorer och downregulate antigenpresenterande molekyler för att fastställa produktiv infektion och undvika immun övervakning7,8, 9,10,11. Utan behandling, infektionen resulterar i omfattande förluster av CD4+ T celler, slutligen kulminerade i förvärvad immunbrist syndrom (AIDS)12. I inställningen av antiretroviral behandling kvarstår latent infekterade cellen reservoarer i årtionden, poserar ett formidabelt hinder för botande strategier. Förstå egenskaperna för vivo/SIV hivinfekterade celler har potential att avslöja värd cell funktioner instrumentell i patogenes och uthållighet. Men har detta mycket utmanande, främst på grund av low frequency av infekterade celler och brist på reagens kan lätt identifiera dem. Celler som transkribera viral RNA, uppskattas för att närvara vid 0,01 – 1% av CD4+ T celler i blod och lymfatisk vävnad13,14,15. Under suppressiv behandling är latent infekterade celler ännu mindre frekvent vid 10-3– 10-7 16,17,18. Virala protein färgning analyser att fungerar bra för att studera in vitro infektioner, exempelvis intracellulära Gag, är suboptimal på grund av bakgrundsfärgning 0,01 – 0,1%, lika med eller större än frekvensen av infekterade celler13, 14. Yta färgning för Env protein med välkarakteriserad SIV och HIV Env-specifika monoklonala antikroppar har också visat sig vara svårt, sannolikt av liknande skäl. Nyligen har nya verktyg syftar till att förbättra upptäckten av celler som uttrycker Gag av antingen införliva analyser specifika för gag RNA eller genom att använda alternativa imaging teknik14,15,19. Sådana tillvägagångssätt är dock fortfarande begränsat antal kvantitativa mätningar utförs på varje cell.
Här, vi beskriver metodik som (1) identifierar enda virus-infekterade celler direkt ex vivo av känsliga och specifika viral genen kvantitativa qPCR och (2) kvantifierar uttryck för upp till 18 ytproteiner och 96 gener för varje infekterad (och oinfekterade) cell. Denna metod kombinerar encelliga ytan protein mätning av FACS följt av omedelbar cell lysis och gen uttryck analys använder multiplexed riktade qPCR på Biomark systemet. Integrerad fluidic krets (IFC) tekniken gör multiplexade kvantitering av 96 gener från 96 prover samtidigt, genom en matris av 9216 kammare där de enskilda qPCR reaktionerna utförs. Levande cellen FACS sorteringen poster hög-innehåll protein överflöd mätningar medan bevara den hela transkriptom analys utförs omedelbart nedströms. För att identifiera virus-infekterade celler, analyser är specifika för alternativt skarvade och Osplitsat viral RNAs (vRNA) ingår i den qPCR-analysen, tillsammans med en panel av användardefinierade analyser totalt upp till 96 gener, det maximala antalet analyser som för närvarande bor i IFC. Den genuttryck och protein information samlas in för varje cell är sammanlänkade genom väl position. Vi har tidigare rapporterat resultat från denna analys någon annanstans20. Här, vi ge mer detaljerad metodologiska riktlinjer samt ytterligare beskrivande fenotypning av SIV-infekterade CD4+ T celler.
Detta synsätt, som vi kallar tSCEPTRE, kan tillämpas på upphävanden av någon livskraftig cell befolkningen reaktiva fluorescently märkt antikroppar och uttrycker en transkriptom kompatibel med tillgängliga qPCR-analyser. Det kan till exempel användas för kännetecknar differentiell gen- och proteinuttryck i sällsynta celler eller celler som inte lätt att skilja av surface protein markörer. Provberedningen är beroende av en standard färgning protokoll använder kommersiellt tillgängliga antikroppar. Cytometers med encelliga sortering kapacitet är också kommersiellt tillgängliga, men ytterligare biosäkerhet försiktighetsåtgärder krävs för bearbetning av infektiös levande celler. Inspelning den enda – cell protein uttryck profilen för varje cell av väl position, häri är som indexeras sortering, gemensamt för kommersiellt tillgängliga FACS sortering programvara. Computational analys av Differentiellt uttryckta värd gener bland cellpopulationer sevärdheter beskrivs inte här, men referenser tillhandahålls till tidigare publicerade metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Encelliga analys är ett viktigt verktyg för dissekera heterogena populationer av celler. Identifiering och isolering av sällsynta celler kan vara svårt. För att övervinna denna utmaning, en metodik som kombinerar indexerade flödescytometri och hög genomströmning multiplexade kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) utvecklades. Syftet var att identifiera och karaktärisera simian immunodeficiency virus (SIV)-infekterade celler inom rhesus makaker. Genom kvantitering av surface protein av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och mRNA av qPCR identifieras virus-infekterade celler av viral genuttryck, som kombineras med värd genen och protein mätningar för att skapa en flerdimensionell profil . Vi benämner det tillvägagångssätt, riktade Single-Cell Proteo-transkriptionell utvärdering eller tSCEPTRE. För att utföra metoden, är viabla celler färgade med fluorescerande antikroppar specifika för yta markörer används för FACS isolering av cell delmängd eller nedströms fenotypiska analys. Enstaka celler sorteras följt av omedelbar lysis, multiplex omvänd Transkription (RT), före PCR-amplifiering och hög genomströmning qPCR av upp till 96 utskrifter. FACS mätningar registreras vid tidpunkten för sortering och därefter kopplade till gen uttryck data för väl position för att skapa en kombinerad protein och transkriptionell profil. För att studera SIV-infekterade celler direkt ex vivo, celler identifierades av qPCR detektion av flera viral RNA arter. Kombinationen av viral avskrifter och kvantiteten av varje tillhandahålla en ram för klassificering av celler i olika faser av viral livscykel (t.ex., produktiva kontra icke-produktiva). Dessutom var tSCEPTRE av SIV+ -celler jämfört med icke-infekterade celler isolerade från samma prov att bedöma Differentiellt uttryckta värd gener och proteiner. Analysen visade tidigare unappreciated viral RNA uttryck heterogenitet bland infekterade celler samt i vivo SIV-medierad post-transcriptional genreglering med encelliga upplösning. Den tSCEPTRE metoden är relevant för analysen av någon cell befolkningen mottagliga för identifiering av uttryck av surface protein marker(s), värd eller patogen gene(s) eller kombinationer av dessa.

Arbetsflödet för hela protokollet avbildas i figur 1. Det består av två variationer definieras av antalet celler sorterade: antingen begränsa utspädning eller som enstaka celler, som beskrivs i texten. Exempel på primer-probe kvalifikation analyser på 2-faldig seriespädningar av RNA visas i figur 2. Usenets strategin för att identifiera potentiella SIV+ celler visas i figur 3. En...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Encelliga kvantitering av mRNA och ytan proteinuttryck i Simian Immunodeficiency Virus-infekterade CD4+ T celler isolerade från Rhesus makaker

Beskrivs är en metod för att kvantifiera uttrycket av 96 gener och 18 ytproteiner genom singelcellerna ex vivo, möjliggör identifiering av differentially uttryckt gener och proteiner i virus-infekterade celler i förhållande till icke-infekterade celler. Vi tillämpar en strategi för studien SIV-infekterade CD4+ T celler isolerade från rhesus makaker.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området för värd-patogen interaktioner såsom vad är de unika egenskaperna hos de produktivt infekterade cellerna, vad värdkofaktorer tillåta virus att etablera produktiv infektion, och hur man rikta dessa celler i terapeutiska insatser. Den största fördelen med denna teknik är att den ger kvantitativa mått för både protein och mRNA inom enstaka celler, och de flesta reagenser är kommersiellt tillgängliga. Demonstrationen av cell-sortering förfarandet kommer att Matthew Creegan, en senior tekniker från flödet cytometri kärna i Doktor Michael Eller laboratorium.Till att börja, i en utsedd pre-PCR molekylärbiologi arbetsstation, förbereda analysen mix genom att kombinera 96 gen uttrycksanalyser i en RNase, DNase gratis rör se till att lägga till varje analys till en slutlig koncentration av 180 nanomolar av framåt och omvänd primers. Tillsätt DNA-suspensionsbuffert för att uppnå lämplig utspädning av analysblandningen. För varje förväntad 96 av 96 chip array, pipetter sex mikroliter av varje analys i en utsedd brunn av en 96 väl PCR-platta, sedan försegla plattan med ett lim.För att börja ytan färgning livskraftiga celler, i en vävnad kultur biosäkerhet skåp, först förbereda ersättning prover och en mästare blandning av fluorescerande antikroppar cocktail som beskrivs i textprotokollet. Tina cryopreserved cellerna i en 37 graders Celsius vattenbad i två minuter. Efter detta, tillsätt mellan 5 och två milliliter av cellupphängningen till ett 15 milliliter rör som innehåller 12 milliliter PBS.Centrifugera vid 500 G i tre minuter vid 25 grader Celsius, sedan aspirera PBS och återanvända pelleten i tre milliliter färsk PBS. Överför denna blandning till ett fem milliliter polystyrenrör. Centrifugera återigen vid 500 G i tre minuter vid 25 grader Celsius.Aspirera supernatanten och lämna cirka 10 mikroliters kvarvarande PBS. Därefter återanvänds upp till 20 miljoner tvättade celler i 80 mikroliter av antikroppscocktail. Inkubera i 20 minuter vid 25 grader Celsius samtidigt skyddas från ljus.Efter detta lägger du till tre milliliter PBS. Centrifugera vid 500 G i tre minuter och aspirera supernatanten. Grundligt resuspend cellerna i 300 till 500 mikroliter av PBS.Filtrera denna lösning genom pipettering det genom en 35 mikrometer nylon cell-sil lock. sedan hålla cellerna på is och skyddas från ljus tills sorten. Tillbaka i pre-PCR arbetsstation, först förbereda RT preAMP reaktion mix i en enda RNase, DNase fri sterilt rör som beskrivs i textprotokollet.Med hjälp av en flerkanalig pipett, dispensera 10 mikroliter av denna reaktionsmix i önskat antal av 96 väl PCR-sorteringssamlingsplattor. Täta plattan med självhäftande film och sedan placera plattan på en pre-kyld 96 väl aluminiumblock. Efter detta upprättar cell-sortering gating schema och förbereda flödet cytometric cell sorterare som beskrivs i textprotokollet.Ange lämpliga instrumentinställningar för att ange antalet celler och delmängd som ska sorteras i varje brunn. Ta bort den självhäftande tätningen, sedan FACS sortera cellerna i den förberedda 96 väl PCR samlingsplattor. Återförslut plattan med färsk självhäftande film.Omgående vortexa den återförslutna plattan och sedan centrifug vid 2000 G i en minut vid fyra grader Celsius. Thermocycle plattan i en PCR-maskin med en förvärmd lock på 50 grader Celsius i 15 minuter följt av 95 grader Celsius i två minuter. Slutligen, termocykel för 18 cykler av 95 grader Celsius i 15 sekunder och 60 grader Celsius i fyra minuter, sedan i en post-PCR arbetsstation, överföra fem mikroliter av cDNA i 20 mikroliter av DNA suspension buffert i en ny 96 väl PCR-platta.Till att börja, förbereda qPCR-analysplattan genom att pipettera fyra mikroliter av analys-lastande reagens i varje brunn. Därefter överför du fyra mikroliter av varje analys från 2X-analysplattan till qPCR-plattan. Underhåll qPCR-analysplattan vid fyra grader Celsius.Fördela kontrollledningsvätskorna från primingsprutorna i chipens två insugningsventiler. Ta bort skyddsplasten underifrån plattan. Placera chipet på en IFC-styrenhet med den skårade sidan vid A1-positionen och välj sedan och kör det främsta skriptet.För varje mikrofluidiskt chip, blanda 50 mikroliter av provladdningsreagensen med 500 mikroliter av PCR-mastermix för att förbereda reaktionsmixen i realtid. Pipett 4.4 mikroliter av denna reaktionsblandning i varje brunn av en ny 96 väl PCR-platta som nu betecknas som provplattan. Därefter pipettera 3,6 mikroliter av den tidigare utspädda cDNA i varje brunn av provplattan.Efter detta överför fem mikroliter från analysplattan till motsvarande brunn på skåran sidan av chipet. För över fem mikroliter från provplattan till motsvarande brunn på andra sidan av chipet. Sätt in det inlästa chippet i IFC-styrenheten och kör lastmixskriptet.Därefter överför du chipet till BioMark-plattformen och ställer in instrumentet som det skisseras i textprotokollet och spara sedan chipkörningsfilen i en angiven mapp. När chipkörningen är klar öppnar du realtids-PCR-analysprogramvaran och väljer sedan fil, öppen, för att öppna chiprun. bml-fil.I det övre vänstra hörnet av mjukvarufönstret, lokalisera chip explorer och chip run sammanfattning. Under chip run sammanfattning, klicka på detektor setup. Klicka på nytt under aktivitet och välj behållartypen SBS-plåt och behållarformat SBS 96.Klicka på knappen med ellipsen bredvid kartläggning, välj sedan M96-Assay-SBS96.dsp. Klicka på analysvyer. I qPCR-fliken under aktivitet väljer du baslinjekorrigering för linjär derivat- och CT-tröskelmetod för användardetektorer.I fliken CT tröskelvärden, kontrollera den initiera med auto rutan och klicka sedan på knappen analysera. I den övre högra kvadranten av analysvyer, klicka på den andra fliken, resultattabell. Välj heat map view i rullgardinsmenyn så visas värmekartan med data.Klicka på tröskel och loggdiagram under värmekartan. Justera CT-tröskelvärdena manuellt för varje detektor genom att klicka på analyser, representerade av kolumner på värmekartan, och dra tröskeln efter behov för att korsa förstärkningskurvorna i den exponentiella fasen. När klar, klicka på analysera.Därefter exporterar du qPCR-data som en csv-fil. Överför qPCR-data från BioMark-datorn till skrivbordet. Importera data till ett kalkylblad eller en statistisk analysprogramvara och kartlägger resultaten genom prov- och analyspositioner på chipet.Skapa en ny kolumn och använd en villkorsformel för att organisera cellerna i grupper utifrån uttrycket av virusgener. Under analysera väljer du fit Y by X och plottar genuttryck kontra grupp. Efter detta använder FlowJo version nio för att öppna FCS filer från FACS sortera motsvarar en 96 väl platta.Med filnamnet markerat väljer du plattform, händelsenummergrind och skapar indexerade sorteringsgrindar. Enskilda celler kommer att visas visas efter rad. Framhäv alla 96 celler och välj sedan arbetsyta, exportera, välj alla kompenserade golv.Under data väljer du FCS-fil, klickar på export och väljer en utsedd mapp. Dra de nya FCS-filerna för enskilda celler till en ny FlowJo-arbetsyta. Framhäv alla cellerna och klicka på Lägg till statistik, representerad av sigmaknappen, medelvärdet och alla fluorescensparametrar.Öppna tabellredigeraren och markera sedan alla våningarna i den första cellen och dra dem till tabellredigerarfönstret. I det här fönstret klickar du på Skapa och visa tabell. Efter detta, kopiera och utdata till en statistisk programvara antingen genom att kopiera-klistra eller genom att klicka på spara och starta ansökan knappen.Sammanfoga encells-FACS-data med qPCR-data i JMP med plåtnumret och brunnspositionen. Slutligen utföra grafiska och statistiska analyser på de kombinerade uppgifterna. I denna studie, single cell yta protein quantitation genom multi-parameter flöde cytometry är integrerad med kvantitativa enda cell mRNA uttryck genom mycket multiplexerad RTqPCR.Visas här är single cell kvantitativa viral gen uttryck från FACS sorterade Rhesus makak CD4 positiva T-celler. Tat/rev positiva N av negativa celler uttrycker färre kopior av tat/rev RNA än N av positiva celler i mörkgrönt vilket är förenligt med ett tidigt stadium av infektion före stabilisering och en nukleär export av delvis skarvade virala RNA. Ett högt överflöd av unspliced Gag-RNA i tat/rev positiva N av positiva celler är förenligt med sent stadium produktiv infektion under vilken rikligt genomisk RNA uttrycks och förpackas i spirande virions.Denna trivariate tomt visar den enda cellen viral gen, värd gen och värd yta protein uttryck visar att ytan CD4 och CD3 protein uttryck minskar i tat/rev positiva celler som visas i grönt även om CD4 och CD3 avskrifter är ihållande. När behärskar, denna teknik kan göras i två till tre dagar. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man utför riktade enda cell prototranscriptional utvärdering för att ta itu med frågor som rör differentially uttryckta gener och proteiner i viralt infekterade celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes induktion i möss genom adoptiv överföring av diabetogen CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk och funktionell analys av aktiverade regulatoriska T-celler isolerade från kronisk lymfatisk koriomeningitvirus-infekterade möss

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...