Name: single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Yazarlar NIAID VRC akış sitometresi çekirdek ve MHRP akış sitometresi çekirdek tesisleri bakım ve işletme FACS aletleri ve sıralama ekipman için teşekkür etmek istiyorum; Maria Montero, Vishakha Sharma, uzman teknik destek için Kaimei şarkı; Michael Piatak, Jr. (SIV qPCR tahlil tasarım; hakkında yardım almak için öldü) ve Brandon Keele ve Matthew Scarlotta SIV için dizileri izole etmek. Görüşler yazarlar vardır ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı'nın pozisyonlar temsil etmek üzere alınmamalıdır. Araştırma bir akredite AAALAC tesis hayvan refah Yasası ve diğer federal tüzük ve hayvanlara ilişkin düzenlemelere uygun olarak onaylanmış hayvan kullanım kuralında altında yapılmıştır ve içeren hayvan deneyleri ve politikalarına Bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NATO-Rusya Konseyi yayın, 2011 baskı için kılavuzdaki belirtti.

Not: Protokolü iş akışı şeması Şekil 1' de gösterilen. Üç temel adımdan oluşur: FACS, RT ve cDNA öncesi amplifikasyon ve qPCR 96 genler için aynı anda. Hücreleri dilutions sınırlama ve tek hücre, sıralama sıralama iletişim kuralı, iki sürümü daha ayrıntılı olarak adım 5 ve adım 6, sırasıyla açıklanmıştır. Bu stratejileri farklı araştırma soruları adresi ama benzer yordamları izleyin.
1. ön koşul veya önceki analizleri</...

<ol>
	<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Multiomics:+Multiple+Measurements+from+Single+Cells.">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-associated+HIV+RNA:+a+dynamic+biomarker+of+viral+persistence.">Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence.</a> Retrovirology. 10, 41 (2013).</li><li>Mailler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Life-Cycle+of+the+HIV-1+Gag-RNA+Complex.">The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses.">Retroviruses.</a> Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).</li><li>Frankel, A. D., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1:+fifteen+proteins+and+an+RNA.">HIV-1: fifteen proteins and an RNA.</a> Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).</li><li>Tokarev, A., Guatelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misdirection+of+membrane+trafficking+by+HIV-1+Vpu+and+Nef:+Keys+to+viral+virulence+and+persistence.">Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence.</a> Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).</li><li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Restriction+Factors+and+Mechanisms+of+Evasion.">HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).</li><li>Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+Host+Cell+Plasma+Membrane+by+HIV-1+Nef+and+Vpu:+A+Strategy+to+Ensure+Viral+Fitness+and+Persistence.">Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence.</a> Viruses. 8 (3), 67 (2016).</li><li>Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+host+restrictions+to+HIV-1+and+mechanisms+of+viral+escape.">Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape.</a> Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).</li><li>Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+and+counteraction+of+restriction+factors+by+HIV-1+and+other+primate+lentiviruses.">Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).</li><li>Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+HIV+infection.">Immunopathogenesis of HIV infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).</li><li>Reynolds, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+SIV-infected+cells+by+flow+cytometry.">Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).</li><li>Baxter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Characterization+of+Viral+Translation-Competent+Reservoirs+in+HIV-Infected+Individuals.">Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals.</a> Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).</li><li>Grau-Exposito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Cell+FISH-Flow+Assay+Identifies+Effector+Memory+CD4++T+cells+as+a+Major+Niche+for+HIV-1+Transcription+in+HIV-Infected+Patients.">A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients.</a> MBio. 8 (4), (2017).</li><li>Eriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+measures+of+viral+reservoirs+in+HIV-1+eradication+studies.">Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies.</a> PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+reservoir+for+HIV-1+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy.">Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).</li><li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation.">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).</li><li>DeMaster, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+CD4/CD8+Double-Negative+T+Cells+Expresses+HIV+Proteins+in+Patients+on+Antiretroviral+Therapy.">A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy.</a> J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).</li><li>Bolton, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+quantitation+of+host+and+SIV+genes+and+proteins+ex+vivo+reveals+host-pathogen+interactions+in+individual+cells.">Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells.</a> PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).</li><li>Quintans, J., Lefkovits, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+specific+to+sheep+red+cells+in+nude+mice.+Estimation+of+frequency+in+the+microculture+system.">Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system.</a> Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).</li><li>Finak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAST:+a+flexible+statistical+framework+for+assessing+transcriptional+changes+and+characterizing+heterogeneity+in+single-cell+RNA+sequencing+data.">MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 278 (2015).</li><li>McDavid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+bi-modality+improves+characterization+of+cell+cycle+on+gene+expression+in+single+cells.">Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).</li><li>McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+cell+cycle+to+heterogeneity+in+single-cell+RNA-seq+data.">The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data.</a> Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).</li><li>Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+HIV-1+Latency,+One+Cell+at+a+Time.">Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time.</a> Trends Microbiol. , (2017).</li><li>Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+viral+infection+using+single-cell+sequencing.">Exploring viral infection using single-cell sequencing.</a> Virus Res. 239, 55-68 (2017).</li><li>Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+vectors+of+cellular+identity+with+single-cell+genomics.">Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Soh, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous,+Single-Cell+Measurement+of+Messenger+RNA,+Cell+Surface+Proteins,+and+Intracellular+Proteins.">Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins.</a> Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).</li><li>Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+analysis+of+DNA,+RNAs,+and+proteins+in+the+same+single+cell.">Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell.</a> Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).</li><li>Assarsson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+96-plex+PEA+immunoassay+exhibiting+high+sensitivity,+specificity,+and+excellent+scalability.">Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability.</a> PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Genshaft, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeted+profiling+of+single-cell+proteomes+and+transcriptomes+in+a+single+reaction.">targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction.</a> Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).</li><li>Mahnke, Y. D., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+multicolor+immunophenotyping+assay.">Optimizing a multicolor immunophenotyping assay.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).</li><li>Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliced+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+is+reverse+transcribed+into+cDNA+within+infected+cells.">Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+protein+analysis.">Single-cell protein analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75 (2017).</li></ol>

Protokol, burada açıklanan tSCEPTRE olarak adlandırdığı, multiparameter akış sitometresi ile nicel tek hücreli mRNA ifade son derece çoğaltılmış RT-qPCR tarafından tarafından tek hücre yüzey proteini Nefelometri bütünleştirir. Bu iki teknoloji Birliği yüksek içerikli anlık görüntülerini kombine transkripsiyon ve bir yüksek-den geçerek biçimde tek hücre proteini profili sağlar. Biz SIV vivo içindeile enfekte şimdiye kadar zor hücrelerini tanımlamak için yöntemini kullanın v...

Çok sayıda hücre içi patojenlerin çoğaltmak için konak hücre makine kez konak hücre biyolojisi değiştirme veya ana hücrelerinin yayılma şanslarını en üst düzeye çıkarmak için çok özel altgrupları hedefleme güveniyor. Sonuç olarak, hücre biyolojik süreçlerin yaygın olarak, ana bilgisayarın genel sağlık için zararlı sonuçları ile kesintiye. Virüsler ve içinde çoğalıyorlar konak hücreleri arasındaki etkileşimler anlama bulaşmayı önlemek amacıyla gelişmiş tedaviler ve stratejileri geliştirmede yardımcı olabilir hastalığı mekanizmaları aydınlatmak. Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma sağlayan doğrudan analitik araçlar bu amaçla doğru gereklidir. Tek hücreli analiz tek belirsizliğe yer bırakmadan bir hücresel fenotip özniteliği bir belirli genotip ya da enfeksiyon durumu1için bulunmasını sağlar. Örneğin, patojenik enfeksiyonları sık konak hücreleri doğrudan ve dolaylı değişimler neden. Bu nedenle, ayrım bulaşmamış karşılıklarından enfekte hücreleri doğrudan enfeksiyon veya ikincil etkileri, öznitelik ana hücre değişiklikleri için gerekli gibi Genelleştirilmiş iltihabı. Ayrıca, SIV ve insan immün yetmezlik virüsler (HIV), gibi birçok patojenler için konak hücre enfeksiyon birden çok aşamalardan gibi gelirleri erken, geç, ya da gizli, her biri farklı gen ve protein ifade profilleri2 tarafından karakterize edilebilir , 3 , 4 , 5. hücre karışımları toplu analizleri bu heterojenlik6yakalamak başarısız olur. Aksine, son derece multiplexed tek hücreli analizleri viral her iki ifade ölçmek mümkün ve ana bilgisayar genler enfeksiyon etap üzerinden türevleriyle birlikte enfeksiyon özgü hücresel tedirginlikler gidermek için bir yol sunar. Ayrıca, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde fizyolojik açıdan analiz ilgili ayarları virüslü canlılar arasında meydana gelen olayları tanımlaması için kritik. Böylece, ex vivo çoğu doğrudan olasılığı en iyi yakalama vivo içinde uygulanacak yöntemleri işler.
SIV ve HIV hedef CD4+ T hücreleri, ana bilgisayar antiviral "kısıtlama" faktörler ve tümleyici antijen sunan molekül immün gözetim7,8, önlemek ve üretken enfeksiyon kurmak için hangi onlar karşı koymak 9,10,11. Tedavi olmadan, enfeksiyon sonuçları büyük CD4 kaybına+ T hücreleri, sonuçta sonuçlanan kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AIDS)12. Antiretroviral tedavi ayarında gizlice enfekte hücre rezervuarlar iyileştirici stratejiler için zorlu bir engel poz yıllardır devam ediyor. Vivo HIV/SIV-enfekte hücre özellikleri'ni anlama ana bilgisayar ökaryotlar arasındaki farklılıklar patogenez ve sebat enstrümantal ortaya çıkarmak için potansiyele sahiptir. Ancak, bu son derece, öncelikle enfekte hücreleri low frequency ve onları kolayca tespit edebilmek reaktifler eksikliği nedeniyle zor oldu. Viral RNA, uyarlamak hücreleri 0,01-1'de bulunması için tahmin edilmektedir CD4%+ T hücreleri kan ve lenf dokusu13,14,15. Süpresif tedavi altında gizlice enfekte hücreleri 10-3–10-7 16,17,18, daha az sıktır. Viral protein boyama deneyleri içinde vitro enfeksiyonlar, tür hücre içi Gag, eğitim için iyi iş 0,01 – 0.1 arka plan boyama nedeniyle suboptimal %, benzer veya daha fazla enfekte hücreleri13, frekans 14. Yüzey boyama için iyi karakterize SIV/HIV Env özgü monoklonal antikorları kullanarak Env protein de büyük olasılıkla benzer nedenlerden dolayı zor olabilir kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, Gag tarafından ifade hücre algılama geliştirmek için yeni araçlar amaç birleşmeyle deneyleri belirli gag RNA veya alternatif görüntüleme teknolojileri14,15,19. Ancak, bu tür yaklaşımlar sınırlı kalır nicel ölçümler sayısı içinde gerçekleştirilen her cep telefonundan.
Burada, biz (1) 18'e kadar yüzey proteinleri ve 96 genlerin ifadesi her bulaştırmak için ex vivo duyarlı ve spesifik viral gen nicel qPCR ve (2) tarafından quantifies doğrudan tek virüs bulaşan hücreleri tanımlayan yöntembilim tanımlamak (ve virüs bulaşmamış) hücre. Tek hücre yüzey proteini ölçüm hemen hücre lizis tarafından takip FACS tarafından Bu metodoloji birleştirir ve gen ifade analizi ile hedeflenen qPCR Biomark sistemdeki multiplexed. Entegre sıvı devre (IFC) teknoloji 96 örneklerinden 96 genlerin çoğaltılmış Nefelometri aynı anda, 9,216 odaları tek tek qPCR reaksiyonlar gerçekleştirildiği bir matris tarafından başarılı izin verir. Analiz için tüm transcriptome koruyarak hemen gerçekleştirilen iken canlı hücre FACS sıralama yüksek içerikli protein bereket ölçümleri kaydeder aşağı akım. Virüs bulaşan hücreleri tanımlamak için alternatif olarak spliced ve unspliced viral RNA'ların (vRNA) ilişkin deneyleri özel dahildir 96 genler, şu anda içinde ağırladı deneyleri sayısının Toplam Kullanıcı tanımlı deneyleri bir panel ile birlikte qPCR Analizi IFC. Gen ekspresyonu ve protein her hücre için toplanan bilgilerin iyi konuma göre bağlantılıdır. Biz daha önce başka bir yerde bu analiz sonuçları20bildirdi. Burada, daha ayrıntılı metodolojik yönergeleri yanı sıra daha da açıklayıcı fenotipleme SIV-enfekte CD4 sağlamak+ T hücreleri.
TSCEPTRE dönem, bu yaklaşım herhangi bir geçerli hücre popülasyon fluorescently etiketli antikorlar ve transcriptome temin qPCR deneyleri ile uyumlu ifade için reaktif süspansiyonlar uygulanabilir. Örneğin, farklı gen ve protein ifadede nadir hücreleri veya hücre yüzey proteini işaretleri tarafından kolayca ayırt karakterize için kullanılabilir. Numune hazırlama bir standart iletişim kuralı'nı piyasada bulunan antikor boyama dayanır. Cytometers tek hücreli sıralama yeteneği ile de ticari olarak kullanılabilir, ancak ek Biyogüvenlik önlemleri bulaşıcı canlı hücreleri işlemek için gereklidir. Tek - hücre protein ifade profil burada başvurulan her hücre iyi konuma göre kayıt sıralama, dizine gibi piyasada bulunan FACS yazılım sıralama ortak bir özelliği var. Sayısal Analiz differentially ifade ana bilgisayar genlerin hücre popülasyonlarının ilgi arasında burada açıklanmayan ancak başvurular için daha önce yayımlanmış yöntemleri sağlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			RNA extraction and PCR reagents and consumables
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate
			</td>
			<td>
			BioExpress/VWR
			</td>
			<td>
			T-3060-1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Adhesive PCR Plate Seals
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB0558
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Armadillo 384-well PCR Plate
			</td>
			<td>
			ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AB2384
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			MicroAmp Optical Adhesive Film
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4311971
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DEPC Water
			</td>
			<td>
			Quality Biological
			</td>
			<td>
			351-068-101
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glass Distilled Water
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			W3345
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			11732088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SUPERase-In Rnase Inhibitor
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM2696
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Platinum Taq
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			10966034
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			dNTP Mix
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			18427088
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ROX Reference Dye (if separate from kit)
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			12223012
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			DNA Suspension Buffer
			</td>
			<td>
			Teknova
			</td>
			<td>
			T0223
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			RNAqueous kit
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			AM1931
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CD6
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs00198752_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TLR3
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			Hs1551078_m1
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Control Line Fluid Kit
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			89000021
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			TaqMan Universal PCR Mix
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4304437
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Assay Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000736
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sample Loading Reagent
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			85000735
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Dynamic Array 96.96 (chip)
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMK-M-96.96
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			FACS reagents
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)
			</td>
			<td>
			Spherotech Inc.
			</td>
			<td>
			CMIgP-30-5H
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			CompBeads Anti-Mouse Ig,k
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			51-90-9001229
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			5 ml Polystyrene tube with strainer cap
			</td>
			<td>
			FALCON
			</td>
			<td>
			352235
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Aqua Live/Dead stain
			</td>
			<td>
			Invitrogen/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			L34976
			</td>
			<td>
			dilute 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563916
			</td>
			<td>
			dilute 1:40
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			563914
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564804
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302948
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564710
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			301842
			</td>
			<td>
			dilute 1:83
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302048
			</td>
			<td>
			dilute 1:167
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			302340
			</td>
			<td>
			dilute 1:37
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Anti-CD38-R PE clone OKT10
			</td>
			<td>
			NHP reagent recource
			</td>
			<td>
			N/A
			</td>
			<td>
			dilute 1:100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			564364
			</td>
			<td>
			dilute 1:10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td>
			561358
			</td>
			<td>
			dilute 1:20
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A
			</td>
			<td>
			Biolegend
			</td>
			<td>
			313528
			</td>
			<td>
			dilute 1:80
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Instruments
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BioPrptect Containment Enclosure
			</td>
			<td>
			Baker
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			BD FACS Aria
			</td>
			<td>
			BD Biosciences
			</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			ProtoFlex Dual 96-well PCR system
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4484076
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Quant Studio 6 qPCR instrument
			</td>
			<td>
			Applied Biosystems/ThermoFisher
			</td>
			<td>
			4485694
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			IFC controller HX
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			IFC-HX
			</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Biomark HD
			</td>
			<td>
			Fluidigm
			</td>
			<td>
			BMKHD-BMKHD
			</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantitation of mrna and surface protein expression in simian immunodeficiency virus-infected cd4+ t cells isolated from rhesus macaques

Tek hücre Analizi hücre türdeş olmayan nüfus dissekan için önemli bir araçtır. Kimlik ve yalıtım nadir hücre-ebilmek var olmak zor. Bu zorluğu aşmak için bir metodoloji birleştirerek akış sitometresi dizine ve yüksek üretilen iş çoğaltılmış nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) geliştirilmiştir. Amaç tanımlamak ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) karakterize oldu-enfekte hücreleri rhesus makak içinde mevcut. Nefelometri floresans aktif hücre (FACS) sıralama tarafından yüzey protein ve mRNA qPCR tarafından virüs bulaşan hücreleri çok boyutlu bir profil oluşturmak için ana bilgisayar gen ve protein ölçümleri ile kombine viral gen ekspresyonu tanımlanır . Biz yaklaşım, hedeflenen tek hücreli proteolitik-transkripsiyon değerlendirme veya tSCEPTRE vadeli. Yöntemi gerçekleştirmek için hücrelerin floresan antikor ile belirli bir hücre alt ve/veya aşağı akım fenotipik analiz FACS yalıtımı için kullanılan yüzey işaretleri lekeli. Tek hücreleri hemen lizis, multiplex ters Transkripsiyon (RT), PCR öncesi amplifikasyon ve yüksek işlem hacmi qPCR 96 tutanaklar, ardından sıralanır. FACS ölçümleri sıralama sırasında kaydedilir ve daha sonra gen ifadesi verileri bir kombine protein ve transkripsiyon profil oluşturmak için iyi konuma göre bağlı. SIV-enfekte çalışmaya doğrudan ex vivohücre, hücre birden çok viral RNA türler qPCR tespiti tarafından tespit edilmiştir. Viral transkript kombinasyonu ve miktar her sağlamak bir çerçeve içine viral ömrünün (Örneğin, karşı verimli verimli) farklı aşamalarında hücreleri sınıflandırma. Ayrıca, SIV+ hücre tSCEPTRE göre hastalık bulaşmamış tek hücreleri differentially ifade ana bilgisayar genler ve proteinler değerlendirmek için aynı örnek izole edildi. Analiz daha önce hesaba katılmayan viral RNA ifade heterojenite yanı sıra vivo SIV-aracılı çoğu gen düzenlemesi tek hücreli çözünürlük ile enfekte hücreleri arasında ortaya koydu. TSCEPTRE yöntemi herhangi bir hücre popülasyon yüzey protein marker(s), ana bilgisayar veya patojen gene(s) veya bunların kombinasyonları ifade tarafından kimliği için mükellef analizi için uygundur.

Tüm iletişim kuralı için iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. İki varyasyon göre hücre sayısı tarafından tanımlanan oluşur: her iki sınırlayıcı seyreltme ya da metinde açıklandığı gibi hücreleri, tek. Logosuna 2 kat seri RNA dilutions astar-sonda yeterlilik analizlere örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Potansiyel SIV+ hücreleri tanımlamak için gating strateji Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques at JoVE.c

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Bu yöntem, verimli enfekte hücrelerin benzersiz özellikleri nelerdir, hangi konak kofaktöranlarının virüslerin üretken enfeksiyon oluşturmasına izin verebildiği ve terapötik müdahalelerde bu hücrelerin nasıl hedeflendirilebildiği gibi konak-patojen etkileşimleri alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek hücre içinde hem protein hem de mRNA için nicel önlemler sağlamasıdır ve reaktiflerin çoğu ticari olarak mevcuttur. Hücre sıralama prosedürünü gösteren Matthew Creegan, Doktor Michael Eller'in laboratuvarındaki akış sitometri çekirdeğinden kıdemli bir teknisyen.Başlamak için, pcr öncesi moleküler biyoloji iş istasyonunda, 96 gen ekspresyonu tahlillerini bir RNase,DNase serbest tüpünün bir araya getirerek ileri ve ters astarların 180 nanomolar son konsantrasyonuna her bir tahlil eklemeyi sağlayarak tahlil karışımını hazırlayın. Isırık karışımının uygun seyreltilmesini sağlamak için DNA süspansiyon tamponu ekleyin. Her beklenen 96 by 96 yonga dizisi için, pipet her bir töz altı mikrolitre bir 96 iyi PCR plaka belirlenmiş bir kuyu içine, sonra bir yapıştırıcı ile plaka mühür.Yüzey boyama canlı hücreleri başlamak için, bir doku kültürü biyogüvenlik kabine, ilk tazminat örnekleri ve metin protokolünde belirtildiği gibi floresan antikor kokteyl bir ana karışımı hazırlamak. 37 derece santigrat su banyosunda iki dakika boyunca cryopreserved hücreleri eritin. Bundan sonra, pbs 12 mililitre içeren bir 15 mililitre tüp hücre süspansiyon 5 ve iki mililitre arasında ekleyin.Santrifüj 500 G'de 25 santigrat derecede üç dakika, sonra PBS'yi aspire edin ve üç mililitre taze PBS'de peleti yeniden askıya alın. Bu karışımı beş mililitrelik polistiren tüpe aktarın. Santrifüj bir kez daha 500 G'de 25 santigrat derecede üç dakika.Süpernatant aspire, yaklaşık 10 mikrolitre artık PBS bırakarak. Daha sonra, 80 mikrolitre antikor kokteylinde 20 milyon adede kadar yıkanmış hücreyi yeniden askıya alın. Işıktan korunurken 25 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yat.Bundan sonra, PBS üç mililitre ekleyin. Santrifüj 500 G'de üç dakika süreyle ve süpernatantı aspire edin. PBS'nin 300 ila 500 mikrolitresindeki hücreleri iyice askıya alın.Bu çözeltiyi 35 mikrometrelik naylon hücre süzgeci kapağına borutakarak filtreleyin. sonra hücreleri buz üzerinde tutun ve sıralamakadar ışıktan korunun. PCR öncesi iş istasyonunda, ilk olarak metin protokolünde belirtildiği gibi TEK bir RNase, DNase serbest steril tüp teRT preAMP reaksiyon karışımını hazırlayın.Çok kanallı bir pipet kullanarak, bu reaksiyon karışımının 10 mikrolitresini istenilen sayıda 96 iyi PCR sıralama toplama plakasına dağıtın. Plakayı yapışkan filmle kapatın ve daha sonra plakayı önceden soğutulmuş 96 kuyu alüminyum bloğun üzerine yerleştirin. Bundan sonra, hücre sıralama gating düzenini kurun ve metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometrik hücre ayırıcısını hazırlayın.Her kuyuya sıralanacak hücrelerin sayısını ve alt kümesini belirtmek için uygun araç ayarlarını girin. Yapışkan contayı çıkarın, ardından FACS hücreleri hazırlanan 96 iyi PCR toplama plakasına sıralayın. Taze yapışkan film ile plaka reseal.Hemen resealed plaka girdap ve sonra santrifüj 2000 G dört derece santigrat bir dakika için. Termocycle 15 dakika boyunca 50 derece santigrat önceden ısıtılmış bir kapak ile bir PCR makinede plaka iki dakika boyunca 95 derece santigrat takip. Son olarak, 15 saniye boyunca 95 santigrat derece 18 döngüleri ve dört dakika boyunca 60 santigrat derece için termocycle, daha sonra bir post-PCR iş istasyonunda, yeni bir 96 iyi PCR plaka DNA süspansiyon tampon 20 mikrolitre içine cDNA beş mikrolitre aktarın.Başlamak için, her kuyuda dört mikrolitre istihar edici reaktif içip qPCR titretplakasını hazırlayın. Daha sonra, 2X tsay plakasından qPCR plakasına her bir titrenin dört mikrolitresini aktarın. QPCR titrek plakasını dört santigrat derecede koruyun.Kontrol hattı sıvılarını astar şırıngalarından çipin iki giriş valfine dağıtın. Koruyucu plastiği tabağın altından çıkarın. Çipi A1 konumunda çentikli tarafı olan bir IFC denetleyicisi üzerine yerleştirin ve ardından asal komut dosyasını seçin ve çalıştırın.Her mikroakışkan talaş için, gerçek zamanlı reaksiyon karışımını hazırlamak için numune yükleme reaktifinin 50 mikrolitresini 500 mikrolitre PCR ana karışımıyla karıştırın. Pipet 4.4 mikrolitre bu reaksiyon yeni bir 96 iyi PCR plaka şimdi örnek plaka olarak belirlenen her kuyu içine karıştırın. Daha sonra, pipet 3.6 mikrolitre önceden seyreltilmiş cDNA örnek plaka her kuyuiçine.Bundan sonra, fiş çentikli tarafında ilgili kuyuya doymak plaka beş mikrolitre aktarın. Numune plakasından beş mikrolitreyi çipin diğer tarafındaki ilgili kuyuya aktarın. Yüklü çipi IFC denetleyicisine takın ve yük karışımı komut dosyasını çalıştırın.Ardından, çipi BioMark platformuna aktarın ve enstrümanı metin protokolünde belirtildiği şekilde ayarlayın, ardından fiş çalıştırma dosyasını belirlenen bir klasöre kaydedin. Fiş çalışması tamamlandığında, gerçek zamanlı PCR analiz yazılımını açın ve chiprun'u açmak için dosyayı, açık olarak seçin. bml dosyası.Yazılım penceresinin sol üst köşesinde, yonga gezgini ve yonga çalıştırma özetini bulun. Fiş çalıştırma özetinin altında, dedektör kurulumuna tıklayın. Görev altında, yeni'yi tıklatın ve konteyner türü SBS plakasını ve konteyner biçimi SBS 96'yı seçin.Haritalamanın yanındaki elipsli düğmeye tıklayın ve ardından M96-Assay-SBS96.dsp'yi seçin. Analiz görünümleri üzerine tıklayın. Görev altındaki qPCR sekmesinde, kullanıcı dedektörleri için doğrusal türev ve CT eşik yöntemi için taban çizgisi düzeltmesini seçin.CT eşikleri sekmesinde, otomatik kutuyla başlatmayı işaretleyin ve ardından çözümle düğmesini tıklatın. Analiz görünümlerinin sağ üst çeyreğinde, ikinci sekme, sonuç tablosuna tıklayın. Açılan menüden, ısı haritası görünümünü seçin ve verilerle birlikte ısı haritası görüntülenir.Isı haritasının altında, eşik ve günlük grafiğini tıklatın. Isı haritasındaki sütunlarla temsil edilen tahlillere tıklayarak ve üstel aşamadaki amplifikasyon eğrilerini kesişmek için eşiği gerektiği gibi sürükleyerek her dedektör için CT eşiklerini el ile ayarlayın. Bittiğinde, analiz et'i tıklatın.Ardından, qPCR verilerini csv dosyası olarak dışa aktarın. QPCR verilerini BioMark bilgisayardan masaüstünüze aktarın. Verileri bir elektronik tabloya veya istatistiksel analiz yazılımına aktarın ve sonuçları çipteki örnek ve tahlil konumlarına göre eşleyin.Yeni bir sütun oluşturun ve hücreleri viral genlerin ekspresyonuna göre gruplar halinde düzenlemek için koşullu bir formül kullanın. Analiz altında, X'e uygun Y'yi seçin ve gen ekspresyonunu grupla karşı çizin. Bundan sonra, 96 iyi plakaya karşılık gelen FACS sıralamasındaki FCS dosyalarını açmak için FlowJo sürüm dokuzu kullanın.Dosya adı vurgulanırken, platform, olay numarası kapısı seçin ve dizinlenmiş sıra kapıları oluşturun. Tek tek hücreler satır tarafından görüntülenir. Tüm 96 hücreyi vurgulayın ve ardından çalışma alanını seçin, dışa aktarın, tüm telafi edilen katları seçin.Veriler altında FCS dosyalarını seçin, dışa aktar'ı tıklatın ve belirlenmiş bir klasörü seçin. Tek tek hücreler için yeni FCS dosyalarını yeni bir FlowJo çalışma alanına sürükleyin. Tüm hücreleri vurgulayın ve sigma düğmesi, ortalama ve tüm floresan parametreleri ile temsil edilen istatistik ekle'yi tıklatın.Tablo düzenleyicisini açın, ardından ilk hücrenin tüm katlarını vurgulayın ve tablo düzenleyicipenceresine sürükleyin. Bu pencerede, tablo oluştur ve görüntüle'yi tıklatın. Bundan sonra, kopyala-yapıştırma veya uygulama kaydet ve başlat düğmesini tıklatarak istatistiksel bir yazılıma kopyalayıp çıktı layın.Tek hücreli FACS verilerini JMP'deki qPCR verileriyle plaka numarası ve iyi konuma göre birleştirin. Son olarak, birleştirilmiş veriler üzerinde grafiksel ve istatistiksel analizler yapın. Bu çalışmada, çoklu parametre akış sitometrisi ile tek hücreli yüzey protein ibitomu, yüksek multipleksli RTqPCR ile nicel tek hücreli mRNA ekspresyonu ile bütünleşmiştir.Burada gösterilen FACS sıralanmış Rhesus makak CD4 pozitif T hücrelerinden tek hücreli kantitatif viral gen ekspresyonudur. Negatif hücrelerin Tat/rev pozitif N'si, stabilizasyon dan önce enfeksiyonun erken bir evresi ve kısmen spliced viral RNA'nın nükleer ihracatı ile tutarlı olan koyu yeşil pozitif hücrelerin N'sinden daha az tat/rev RNA kopyasını ifade eder. Pozitif hücrelerin tat/rev pozitif N'deki spliced Gag-RNA'nın yüksek bolluğu, bol genomik RNA'nın ifade edildiği ve tomurcuklanan virions'lara paketlendiği geç evre üretken enfeksiyonla tutarlıdır.Tek hücreli viral gen, konak gen ve konak yüzey protein ekspresyonu gösteren bu trivariate çizim, CD4 ve CD3 transkriptleri devam etse bile yeşil renkte gösterilen tat/rev pozitif hücrelerde yüzey CD4 ve CD3 protein ekspresyonunun azaldığını göstermektedir. Bir kez hakim, bu teknik 2-3 gün içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, viral enfekte hücrelerde farklı ifade genler ve proteinler ile ilgili soruları ele almak için hedeflenen tek hücreli prototranskripsiyonel değerlendirme gerçekleştirmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...