Name: detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

De auteurs hebben geen bevestigingen.

Menselijke matrices met goedkeuring van hun institutionele Review Board (IRB) uit commerciële bronnen werden gekocht maar moeten worden behandeld als potentieel besmettelijk. Zorg ervoor dat de labo-omgeving gebruikt een cultuur van veiligheid12 onderhoudt.
1. voordat de bepaling
<ol><li>Bereiden ERT-geconjugeerde daar magnetische kralen volgens13instructies van de fabrikant.</li>
	<li>
Kwaliteit controlemonsters (QCs) bereiden: spike een positieve controle antilichaam (PC) (bijvoorbeeldeen NAb) in de soortspecifieke matrix (bv, gebundelde CSF of serum). Opmerking: FDA en EMA begeleiding raadt een hoge en een lage QC voorbereiden met assay validatie en routine testen van1,14.<ol>
<li>Bijvoorbeeld voor het verkrijgen van een QC bij 10 µg/mL, voeg toe 10 µL van 1 mg/mL voorraad positieve controle in 990 µL van de relevante matrix (bv, CSF) voor een totaal volume van 1.000 µL.</li>
		<li>Aliquoot de QC-monsters in een geschikt voor één volume gebruiken (b.v., 50 µL) en bevriezen van de aliquots bij -60-80 ° C1.</li>
		<li>Aliquot een cut-punt-control (CC), soortspecifieke matrix niet behandeld met de test artikel (bijvoorbeeld, gebundelde CSF of serum) voor een enkele gebruiken (b.v., 50 µL) en bevriezen van de aliquots bij -60-80 ° C1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het uitvoeren van een vervoeging reactie tussen de fluorophore en de ERT met behulp van een eiwit-labeling kit volgens de fabrikant protocol15. Aliquoot het monster in een geschikt voor één volume gebruiken (b.v., 50 µL) en bevriezen van de aliquots bij -60-80 ° c.</li>
</ol>2. dag 1: Cel Plating en bereiding van de monsters
<ol><li>
Cel plaat voorbereiding
	<ol>
<li>Gebruik van een weefselkweek kap en het onderhoud van een aseptische omgeving voor de volgende stappen uit. Spuiten van elk object dat zal worden geplaatst in de kap met 70% ethanol en onderhouden van een schoon milieu16,17,18.</li>
		<li>Warm de cel groeimedium (bijvoorbeeldRPMI-1640 met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine) in een bad met water of kraal bij 37 ° C19.</li>
		<li>Graaf de menselijke T lymfocyten Jurkat cellen en plaat 100 µL per putje op 7,5 x 105 cellen/mL in een 96-Wells ronde-onderste cel cultuur plaat geschikt is voor gebruik op een cytometer van de stroom voorzien van een plaat-loader.<ol>
<li>Bijvoorbeeld een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller gebruiken om te tellen de cellen20,21.</li>
			<li>Ervoor zorgen dat de cellen ten minste 70% levensvatbaarheid voordat u doorgaat met het experiment (b.v., het beoordelen van de levensvatbaarheid met trypan blauw kleuring)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid 's nachts voor 14-20 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de monsters van de screening
	<ol>
<li>Verdun het onderwerp of assay controlemonsters gebruik serumvrij media (bijvoorbeeldRPMI-1640). In het voorbeeld van de methode hier, Verdun monsters 1:2.5 in RPMI-1640 door toevoeging van 60 µL van het monster aan 90 µL van de serum-vrije media. (bijvoorbeeld8-strip buizen). Ga naar stap 3.1 voor de test procedure te bereiden een ERT fluorophore-label. Opmerking: De verdunning van 1:2.5 werd experimenteel bepaald en is optimaal voor de methode die hier gepresenteerd. Optimale monster verdunningen moeten worden bepaald voor elke methode die is ontwikkeld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirmatieve kraal en sample voorbereiding
	<ol>
<li>Bereken het aantal ERT-geconjugeerde kralen die nodig zijn voor confirmatieve monsters.<ol>
<li>Voor bijvoorbeeld voor 10 monsters, gebruik 10 monsters x 100 µL van ERT-geconjugeerde kralen per monster + 30% extra te compenseren verliezen tijdens het wassen stap = 1300 µL van ERT-geconjugeerde parels.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex de kralen grondig. Het berekende aantal kralen toevoegen aan een conische tube van 15 mL voor wassen.</li>
		<li>De ERT-geconjugeerde magnetische kralen wassen door 1.300 µL van koppeling buffer of zoals voorgesteld door de fabrikant (bvmet fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Polysorbaat 20) toe te voegen na de onderstaande13stappen.</li>
		<li>Vortex de buis grondig. Plaats de buis in een rek van de magnetische buis gedurende 2 minuten. Zonder verstoring van de kralen, zorgvuldig gecombineerd en verwijder het supernatant. Opmerking: De oplossing verandert van donker bruin tot duidelijk wanneer kralen worden opgehaald aan de magneet.</li>
		<li>Resuspendeer de kralen met 1.300 µL buffer te koppelen. Herhaal de stappen wassen voor een totaal van vier wast.</li>
		<li>Na de definitieve wash, schorsen de kralen in 1300 µL buffer (voorheen berekend in stap 2.3.1.1) te koppelen. Voeg 100 µL per goed op een 96-Wells, witte, ronde-bodem, niet-bindende polypropyleen plate volgens de kaart van de plaat (bijvoorbeeld, een bevestiging ook per monster of QC; het monster zal worden opgesplitst in duplicaten wanneer geïncubeerd met de ERT fluorophore-label).</li>
		<li>Plaats van de plaat op een 96-Wells-magneet langs de kant en laat de parels te vormen een pellet. Zorgvuldig gecombineerd het duidelijke supernatant en verwerpen. Opmerking: De oplossing verandert van donker bruin tot duidelijk na ongeveer 1-2 min aan de magneet langs de kant. De verkregen kralen worden genoemd de "droge" parels.</li>
		<li>Als de monsters gescreend positief zijn wordt bevestigd, Voeg u 100 µL van elk monster met en zonder ERT-geconjugeerde kralen ook in het geval/toegewezen. Afdichting van de plaat met een plastic folie en roteer gedurende ten minste 60 minuten op een rondschudapparaat op ongeveer 800 rpm bij kamertemperatuur (RT). Opmerking: Eerder bereid en bevroren positieve en negatieve QCs en de CC moeten worden opgenomen op elke plaat.</li>
		<li>Na de incubatie, plaatst u de bevestiging plaat op de 96-Wells kant-skirted magneet en laat de parels te vormen een pellet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titer verdunning serie voorbereiding
	<ol>
<li>Ter voorbereiding van een reeks titer, serieel Verdun het monster in de gepoolde matrix een voldoende aantal keren te steken van de vooraf bepaalde titer knippen van punt1.</li>
		<li>Bijvoorbeeld, meng 30 µL van het monster tot 60 µL van gebundelde matrix in een verdunningsreeks van 1:3 voor een totaal van 8 verdunningen (bijv., 8-strip buizen). Ga naar stap 3.1 voor de test procedure te bereiden ERT fluorophore-label.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dag 1: Assay Procedure
<ol><li>
Bereiden de ERT fluorophore-label in het medium serumvrij (b.v., 60 µL per goed, of ongeveer 6 mL/plaat).
	<ol>
<li>Om bijvoorbeeld te bereiden 1 µg/mL 10 mL fluorophore-geëtiketteerden ERT, voeg 10 µL van voorraad 1 mg/mL fluorophore-geëtiketteerden ERT 9,99 ml serum-vrije media (bijvoorbeeldRPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaat (bijv., 96-Wells, witte, ronde onderkant, niet-bindende polypropyleen plaat), Voeg in een nieuwe incubatie de bereide monsters uit stap 2.2, 2.3, of 2.4 en een ERT fluorophore-label in een 1:1-mengsel in dubbele wells (bijvoorbeeldoverdracht 60 µL van elk monster voorbereid en voeg 60 µL van de ERT fluorophore-geëtiketteerden per putje). Opmerking: Een voorbeeld experiment plaat kaart wordt gegeven in Figuur 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> Afbeelding 1: voorbeeld van een experiment plaat lay-out. Monsters en een fluorophore-geëtiketteerden ERT werden 's nachts bij 2-8 ° c geïncubeerd Besturingselementen zoals kwalitatief hoogwaardige controle (HQC), lage kwaliteit controle (LQC) en negatieve kwaliteitscontrole (NQC) werden gescreend en bevestigd op de tegenoverliggende hoeken van de plaat plaat uniformiteit te beoordelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol start="3"><li>Meng de monsters en de ERT fluorophore-geëtiketteerden door pipetteren omhoog en omlaag meerdere malen met een meerkanaalspipet. De platen in de folie wikkelen en ze na een nacht bebroeden bij 2-8 ° C voor 14-20 h.</li>
</ol>4. dag 2: De bereide monsters aan de cellen toevoegen
<ol><li>Verwijderen van de plate(s) van de incubatie monster uit de incubatie bij 2-8 ° C en de platen warm door ze te plaatsen in een bad van de kraal bij 37 ° C gedurende 10 à 15 min.</li>
	<li>Verwijder de cellen uit de CO2 incubator. Voer een visuele controle van de vergulde cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen gezond en gelijkmatig verspreid over de wells17,19 lijken.</li>
	<li>100 µL van de eerder gemengde monsters en ERT fluorophore-label toevoegen aan een cel plaat volgens de kaart van experimentele plaat.</li>
	<li>Plaats de plaat van de cel met de toegevoegde monsters terug in de CO2 incubator bij 37 ° C. Incubeer de plaat voor 3 h en ± 15 min. Opmerking: Deze keer werd opgericht in het lab als optimaal voor de signal-to-noise-reactie in de test.</li>
	<li>Centrifugeer de cel plaat voor 6 min bij 320 x g in een tafelblad centrifuge bij 14-18 ° C. De aanwezigheid van een cel pellet onderin de putjes van de plaat te bevestigen.</li>
	<li>Houd de plaat 30-45° schuin. Verwijder voorzichtig het supernatant van elk putje zonder verstoring van de cel-pellet. Voeg 200 µL van 1 x DPBS naar de cel pellet in elk putje te resuspendeer de cellen.</li>
	<li>Herhaal de stappen voor een totaal van 3 wasbeurten wassen cel. Ga onmiddellijk naar stap 5 voor de kleuring van de levensvatbaarheid van de cel.</li>
</ol>5. dag 2: Cel levensvatbaarheid kleuring
<ol><li>Met behulp van een meerkanaalspipet, voeg 100 µL van een werkende oplossing 1 x Live/dode vlek aan elk putje, geselecteerd voor een emissie golflengte verschilt van die van de ERT fluorophore-label en bereid volgens de fabrikant instructies22.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 15 min. op RT in het donker. Centrifugeer de plaat voor 6 min bij 320 x g in een tafelblad centrifuge bij 14-18 ° C.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant van elk putje zonder verstoring van de cel-pellet. Wassen van de cellen 1 x met 1 x DPBS.</li>
</ol>6. dag 2: Vaststelling van de cellen met 1% Paraformaldehyde
<ol><li>Met behulp van een meerkanaalspipet, Breng 100 µL van gekoeld (bij 2-8 ° C) 1% paraformaldehyde (PFA) in elk putje.</li>
	<li>Het zegel van de platen en zachtjes pulse vortex te mengen. Wikkel de plaat in de folie, en plaats deze bij 2-8 ° C gedurende ten minste 10 minuten te maken voor fixatie. Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat spatten op het zegel van de plaat.</li>
	<li>Voeg 50 µL van 1 x DPBS in elk putje met behulp van een meerkanaalspipet omhoog en omlaag vóór de analyse.</li>
</ol>7. Stroom Cytometry
<ol><li>Plaats de platen op de cytometer van de stroom met de plaat loader en hen in werking stellen.</li>
	<li>Verwerven en de gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) met behulp van de stroom cytometry software opnemen (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Zie Figuur 2 als voorbeeld voor de instellingen van de lader. De bemonsteringsstroom, monstervolume, mengen van volume, mengen snelheden en aantal mixen zijn geoptimaliseerd voor deze test. Deze criteria kunnen worden aangepast met behulp van de "pijlen omhoog" of "omlaag" knoppen naast de nummers voor elk criterium, afhankelijk van de stroom cytometry acquisitie software23.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> Figuur 2: voorbeeld van de stroom cytometer lader instellingen. De instellingen van de lader moeten worden geoptimaliseerd voor elke bepaling die is ontwikkeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol start="3"><li>Maak een cytometer analyse/poorten/percelen zoals afgebeeld in Figuur 3. Opmerking: De oprichting van de poort en de toepassing kunnen verschillen voor elke stroom cytometry software23.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> Figuur 3: stroom cytometry strategie gating. Jurkat cellen werden gescheiden van de totale gebeurtenissen en verzameld door plotten van de vooruit-scatter (FSC) vs. kant-scatter (SSC) kanalen en tekenen van een hek rond de doelpopulatie. Onderhemden (individuele cellen) werden gescheiden van paren of grotere cel aggregaten met behulp van het FSC-gebied (FSC-A) en FSC hoogte (FSC-H) kanalen. Levende cellen werden gekozen door gating op singlet cellen negatief voor een vlek van de levensvatbaarheid. De intensiteit van de fluorescentie van de mediaan (MFI) werd gemeten in één, live Jurkat cellen en uitgezet als een histogram. De MFI-waarden van de cellen met de opname van de drug geblokkeerd (bijvoorbeeldHQC) en van cellen met controle bedragen van opname worden weergegeven (rood en blauw, respectievelijk). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol start="4"><li>Dode cellen uitsluiten van de analyse en neem ongeveer 10.000 gebeurtenissen23.</li>
</ol>8. de gegevensanalyse
<ol><li>De gegevens (raw MFI) exporteren naar de software van de analyse (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Afhankelijk van de analyse nodig, de volgende data-analyse kan worden uitgevoerd met behulp van analysesoftware.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde MFI dubbele Wells (QCs en monsters) en de variatiecoëfficiënt (% CV) te evalueren van de variabiliteit van de verspreiding van de duplicaten van het gemiddelde. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>Voor monsters en QCs die werden vertoond in de assay, berekenen het percentage signaal remming (% SI) ten opzichte van de gemiddelde MFI van de voor de gepoolde matrix van QCs CC. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Indien nodig, bereken de herstel verhoudingen (RRs) voor de bevestigde QCs en monsters ten opzichte van de overeenkomstige waarden van het scherm. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).</li><li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression.">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li><li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome.">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease.">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li><li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapies+and+therapeutic+concepts+for+lysosomal+storage+diseases.">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li><li>Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> (2012)</li><li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).</li><li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Working+in+the+Hood.">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Basics Handbook. , (2010).</li><li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice.">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li><li>. Introduction to Cell Culture Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018)</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. Counting Cells with Bio-Rad&#39;s TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012)</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).</li><li>Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Flow+Cytometry:+A+Learning+Guide.">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li><li>. A guide to gating in flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016)</li><li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).</li><li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules.">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins.">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus.">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Charles River. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow+Cytometric+Method+to+Assess+Neutralizing+Antibodies+to+AAV+Gene-Therapy+Vectors.">A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors.</a> Charles River Researcher. , (2015).</li><li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays.">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).</li><li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome:+Results+From+MOR-005,+a+Phase+III+Extension+Study.">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li><li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa,+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome:+Results+from+MOR-004,+a+Phase+III+Trial.">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li><li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

De auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van BioMarin farmaceutische Inc.

Neutraliserende antilichamen of andere factoren waardoor de ERT opname door middel van CI-M6PR hebben het potentieel om de impact van de veiligheid of werkzaamheid ERT1. Daarom is het belangrijk om te evalueren NAbs in onderwerp monsters met behulp van een robuust model relevant zijn voor van de drug werkingsmechanisme. Wij en anderen hebben gevonden dat de prestaties van sommige bioassay-formaten (bijvoorbeeldreceptor dimerisatie, luciferase expressie, etc.) niet is uitgelijnd met gezondheid autoriteit aanbevelingen voor assay precisie, de reproduceerbaarheid en gevoeligheid 29. in de hier beschreven methode bioassay, Jurkat cellen, die uitdrukking geven aan endogene CI-M6PR te controleren NAbs specifiek voor de lysosomale ERT opname werkzaam zijn. Gecombineerd met een stroom cytometry uitlezing, deze test gebruikt een fysiologische cel model met geschikte assay precisie, gevoeligheid, reproduceerbaarheid en veel monsters worden verwerkt. NAb detectie met een stroom cytometry uitlezing is ook toegepast op andere indicaties. Bijvoorbeeld, zijn methoden ontwikkeld om te detecteren van bestaande antilichamen tegen hepatitis E en adeno-associated virus (AAV)30,31.
Kritische stappen in het protocol opnemen selecteren van een geschikte fluorophore, waarin een LQC dat monitoren assay gevoeligheid, een voldoende beschermingsniveau van de levensvatbaarheid van de cellen en het onderhoud van de strikte naleving van de incubatie times. In het voorbeeld hier gepresenteerd, fluorophores (b.v.Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 en CypHer 5e), geconjugeerd met een lysosomale ERT, sterk uiteen in hun prestaties. Alexa Fluor 647, die ook de helderste fluorophore getest32was, werd geselecteerd voor de verdere ontwikkeling van de test. Het is raadzaam dat verschillende fluorophores tijdig worden geëvalueerd in de ontwikkeling van de test om de beste gevoeligheid en dynamisch bereik. Assay gevoeligheid tijdens steekproef testen moet worden gevolgd door een LQC die is dicht genoeg bij de limiet van de gevoeligheid, die in 1% van de testen loopt1 mislukken zal. Samen met de HQC fungeert de LQC ook als een systeem van geschiktheid QC assay drift over tijd3volgen. Levensvatbaarheid van de optimale cellen en prestaties wordt bereikt door een cel bank voor eenmalig gebruik aliquots voorbereiden en kwalificatie in nieuwe celbanken gebaseerd op vergelijkbare QC resultaten-3,18. Cel en drug fluorophore-geconjugeerde incubatie tijden staan ook centraal in de prestaties van een consistente assay aangezien drug opname neemt toe met de hoeveelheid tijd die de drug is geïncubeerd met cellen. U wilt minimaliseren dagelijkse variabiliteit in drug opname, kunnen voorbeeldgegevens worden genormaliseerd naar gepoolde matrix controlemonsters op elke plaat (bijvoorbeeld, de controlemonsters geslepen punt in de werkwijze vorenstaand). Een andere belangrijke factor in het produceren van consistente gegevens met deze methode is het controleren van de plaat uniformiteit en minimaliseren mogelijk randeffecten. Een eerste experiment bevatten voor het uitvoeren van de test met een enkele QC via de hele plaat, terwijl de meer robuuste experimenten kunnen worden uitgevoerd tijdens assay validatie (b.v., precisie en nauwkeurigheid)1. Dit toont het belang aan van de plaat kaart lay-out33. Zoals blijkt uit het voorbeeld van een websiteplattegrond plaat, kwaliteit controlemonsters geplaatst aan beide zijden van de plaat-monitor een eenvormigheid die na verloop van tijd met Levey-Jennings grafieken34kan worden bijgehouden.
Terwijl deze test controleert NAbs en andere factoren die lysosomale ERT opname remmen kunnen, kunnen extra experimenten worden uitgevoerd om te bevestigen van een remming van de opname als gevolg van antilichamen. Een optie is voor de behandeling van de monsters met de eiwit A/G/L, die niet-specifiek immunoglobulin35 bindt. Als monsters doorgaan met het testen van positief na eiwit A/G/L uitputting, is er mogelijk een niet-antilichaam remmende factor verantwoordelijk is voor het blokkeren van de drug-opname. De hier beschreven methode is ontworpen voor het meten van de antilichaam-gemedieerde opname remming, en de positieve controle en andere kwantitatieve analyse parameters moeten worden heroverwogen als een hoog percentage van onderwerp monsters met niet-antilichaam remmende factoren worden gevonden.
De bepaling kan ook verder worden gekarakteriseerd om aan te tonen van de drug fluorophore-geëtiketteerden trafieken naar het juiste cellulaire compartiment gebaseerd op van de drug mechanisme van actie. In het voorbeeld hier gepresenteerd, een ERT naar verwachting CI-M6PR op het celoppervlak binden en het verkeer naar het lysosoom. Eerder berichtten we de resultaten van verschillende experimenten waaruit blijkt dat bijna al het fluorescent signaal waargenomen in de resultaten van de methode van fluorophore-label in het lysosoom8ERT. We vonden dat de ERT fluorophore-geëtiketteerden signaal werd uitgeschakeld na een behandeling van de cellen met cytochalasin B, die internalisering door de remming van actine reorganisatie verstoort. Experimenten die externe fluorophore met trypan blauw, of vertraagd internalisering uitgeblust door het plaatsen van cellen bij 4 ° C, blijkt ook dat de ERT fluorophore-label is snel geïnternaliseerd en weinig fluorescentie te wijten aan een ERT gebonden aan het celoppervlak is. Lysosomale targeting werd bevestigd door het visualiseren van de co lokalisatie van pH-gevoelige lysotracker kleurstof met de fluorophore-geconjugeerde drug met behulp van de confocal microscopie. Een specificiteit voor opname door middel van CI-M6PR kan ook worden geverifieerd met behulp van exogene M6P om te concurreren met gelabelde drugs voor het receptor binden. Soortgelijke experimenten moeten worden uitgevoerd om te controleren of de kinetiek van opname en cellulaire localisatie van fluorophore-geconjugeerde drugs in andere testen.
Dit platform van cel-gebaseerde bepaling is gebruikt om te studeren NAbs voor therapeutische geneesmiddelen die gebruik maken van de CI-M6PR receptor-gemedieerde endocytose. Onlangs berichtten we resultaten met behulp van deze test platform dat geen correlatie tussen de ontwikkeling van de werkzaamheid van een NAb en drug voor elosulfase alfa36,37aangetoond. De assay voor klinische monster testen, de parameters, met inbegrip van de gevoeligheid van de test, precisie, selectiviteit, specificiteit, drug tolerantie, robuustheid, valideren en knippen van de punten, moet worden beoordeeld op de gevestigde guidances3, 4. ook opgemerkt, voor lysosomale ERTs, dat NAbs met de potentie ontwikkelen kan om drug activiteit verstoren door middel van binding in de buurt van de enzym katalytische site. In het algemeen zijn wij van mening controle op dit soort NAb te zijn van een lagere prioriteit omdat de barre omgeving van de zure en Proteolytische van het lysosoom niet gunstig voor de antilichaam-ERT interacties2,39,40 is. Het is echter mogelijk dat Proteolytische-resistente NAbs bestaan en het katalytische gedeelte van een drug40kan remmen. Deze bepaling monitoren fluorophore-geëtiketteerden ERT opname het lysosoom en een beperking van de bepaling is het onvermogen om te controleren van Proteolytische-resistente NAbs. Indien dit soort NAb wordt vermoed op basis van veiligheid of gegevens over de werkzaamheid, moet een bepaling die ERT activiteit monitoren worden ontwikkeld en gebruikt voor het testen van monsters.
De beoordeling van de immunogeniciteit is belangrijk bij het begrijpen van de effecten van NAbs op drug veiligheid en werkzaamheid. De identificatie van NAbs staat remming van in vitro drug opname via CI-M6PR biedt de mogelijkheid voor het begrijpen van de NAb activiteit in vivo. De methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een menselijke cel-lijn die CI-M6PR voor het meten van de inmenging van fluorophore-geconjugeerde lysosomale ERT cellulaire opname uitdrukt. Deze methode heeft al gebruikt om te controleren NAbs verschillende ERTs bedoeld om opslag Lysosomale ziekten te behandelen. Dit platform assay gelden mogelijk andere methoden voor het bestuderen van de effecten van NAbs op biologische therapeutics waarvoor een cellulaire internalisering voor hun werking.

Beoordeling van de immunogeniciteit is een belangrijk onderdeel van de veiligheid en werkzaamheid controleprogramma voor elk biologische therapeutisch product, met inbegrip van ERTs. Patiënten kunnen het ontwikkelen van een immuunrespons die kan rechtstreeks van invloed zijn drugs veiligheid, werkzaamheid en farmacokinetische/farmacodynamische profielen. Een subset van deze ADA, genaamd NAbs, kan remmen ERT werkzaamheid op twee manieren: via de remming van de ERT-opname in de gerichte cel of door remming van de ERT katalytische activiteit. De methode die hier gepresenteerd is ontworpen voor het meten van NAbs die interfereren met de opname van de ERT in cellen. Als u wilt volledig controleren de veiligheid en de werkzaamheid van de therapeutische ERT, is het van cruciaal belang in het ophelderen van alle mogelijke correlaties met klinische resultaten of farmacodynamische effecten1continue monitoring van NAbs.
Platformen voor de evaluatie van NAbs tegen eiwit therapeutics zijn cel-gebaseerde, enzymatische activiteit en ligand-bindende analyses1. De optimale assay-platform is geselecteerd op basis van een aantal criteria: het werkingsmechanisme van het therapeutisch product, de gevoeligheid van de test platform, selectiviteit, precisie, en belangrijker, haar vermogen om na te bootsen de remmende werking van NAbs in vivo . Ligand-bindende analyses kunnen dienstig zijn in bepaalde gevallen (bijvoorbeeldals een relevante cellijn niet kan worden geïdentificeerd of als de juiste gevoeligheid in een cel-gebaseerde bepaling niet haalbaar). Echter in de 2016 ontwerp FDA begeleiding voor industrie document en andere industrie geaccepteerde white papers, cel-gebaseerde NAb tests worden aanbevolen, omdat ze kunnen beter weerspiegelen het biologische mechanisme van de drug in vivo1,2 , 3.
De kritieke onderdelen voor de ontwikkeling van een stroom cytometry cel-gebaseerde NAb assay omvatten een geschikte cellijn die op drug stimulatie, een surrogaat positief-control reageert NAb dat de ERT, een fluorophore-geconjugeerde ERT en biologische vissoort neutraliseert matrix4,5,6. De celselectie lijn is afhankelijk van het werkingsmechanisme ERT en meerdere cellijnen moeten worden geëvalueerd tijdens de assay ontwikkeling3. In de hier beschreven methode, werden menselijke Jurkat T-cellen geselecteerd voor hun endogene CI-M6PR uitdrukking op het celoppervlak en het ontbreken van antilichaam fragment receptoren (FcRs) die lukraak de Fc-regio van de meeste antilichamen7,8 binden . Tijdens de ontwikkeling van de test is het belangrijk om een negatieve controle voor het validatieonderzoek en de patiënt steekproef testen, zoals serum gebundeld van personen die niet zijn behandeld met de test artikel1. Cellijnen moeten ook relevante matrices van verschillende soorten voor continuïteit in de stadia van het nonclinical, klinische en post marketing van drug ontwikkeling1tolereren. Een ander onderdeel is de selectie van de bepaling van de positieve controle. De positieve controle voor de ERT cel opname assay werd gekozen op basis van haar vermogen om te binden de therapeutische en neutraliseren van de opname door middel van CI-M6PR9,1. Het is vaak moeilijk te verkrijgen van nuttige of duurzame bedragen neutraliserende sera van menselijke proefpersonen voor gebruik als een controle-assay, met name in zeldzame ziekte patiënt populaties2. Alternatieven omvatten antiserum van hyper-geïmmuniseerd dieren, of affiniteit-gezuiverd polyklonale of monoklonale antilichamen spiked in de assay relevante matrix1. Tijdens het gebruik van een soortspecifieke matrix, is het mogelijk dat de remmende factoren dan antistoffen aanwezig zijn in de matrix de ERT-opname kunnen remmen. Een ander essentieel onderdeel van de test is de ERT fluorophore-geconjugeerde. De selectie van de fluorophore voor de vervoeging van de ERT moet worden geëvalueerd voor elk ERT, gebaseerd op de bepaling van de behoefte aan helderheid, pH stabiliteit en eventuele spectrale overlap in andere kanalen op de stroom cytometer.
De hier beschreven test is een voorbeeld voor het meten van een NAb aan een therapeutische eiwitten, zoals een ERT, waarmee u de cel via CI-M6PR invoert. Verschillende ERTs, bestemd om te behandelen aandoeningen van de lysosomale opslag (LSDs), gebruik maken van dit traject voor cel opname en lysosomale targeting, met inbegrip van elosulfase alfa voor syndroom van Morquio A, cerliponase alfa voor CLN2 Batten disease, agalsidase alfa voor de ziekte van Fabry, en alglucosidase alfa voor Pompe ziekte10,11. Het doel van deze methode is voor het meten van de relatieve hoeveelheid NAbs die met de drug bindende en internalisering via CI-M6PR interfereren. Dit wordt uitgevoerd in trapsgewijze screening, bevestiging, en titer3stappen. Monsters zijn eerst vertoond voor NAb positiviteit en vervolgens bevestigd in de confirmatieve stap positief. Tot slot kunnen monsters die scherm en bevestigen positieve serieel worden verdund voor het genereren van een antilichaam titer1. Deze cel-gebaseerde stroom cytometry drug opname assay biedt een gevoelige en mechanistically relevant in vitro -methode voor het meten van de drug-specifieke NAbs die van een drug farmacologisch profiel beïnvloeden kan. Wij eerder de methode gevalideerd en getest klinische monsters met behulp van dit platform voor de drug elosulfase alfa8. Hier beschrijven we de gedetailleerde stapsgewijze protocol dat kan worden toegepast op andere therapeutische proteïnen of ERTs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

Het beheer van enzym vervangende therapieën (ERTs) en andere biologische therapieën voor patiënten kunnen een anti-drug immune reactie uitlokken. De karakterisering van de anti-drug antistoffen (ADA), met name die kunnen neutraliseren de biologische activiteit van de drug, genoemd neutraliserende antilichamen (NAbs), is van cruciaal belang bij het begrijpen van de effecten van deze antilichamen op van de drug farmacologisch profiel. Dit protocol beschrijft een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van factoren die de cellulaire opname van een vertegenwoordiger lysosomale ERT in menselijke matrix neutraliseren. Het protocol bestaat uit drie procedures: screening, een bevestigende stap titer testen te detecteren, identificeren, en stellen het relatieve niveau van neutraliserende antilichamen titer in onderwerp monsters.
In deze methode, monsters zijn eerst gemengd met de ERT fluorophore-geconjugeerde product en vervolgens geïncubeerd met cellen [bijvoorbeeldmenselijke T lymfocyten (Jurkat cellen)] die uitdrukking geven aan een receptor-6-fosfaat celoppervlak catie-onafhankelijke mannose (CI-M6PR), en Ten slotte geanalyseerd met een cytometer van de stroom. Een monster zonder NAbs zal resulteren in de opname van de fluorophore-geconjugeerde ERT product via CI-M6PR, overwegende dat de aanwezigheid van NAbs zal aan de drug binden en met de binding van de CI-M6PR en de opname interfereren. Het bedrag van de fluorophore-geconjugeerde ERT geëigd maken door de Jurkat cellen is gemeten door stroom cytometry en geëvalueerd als het percentage (%) signaal remming in vergelijking met het antwoord verkregen in het bijzijn van een vertegenwoordiger drug-naïeve matrix. In de confirmatieve stap zijn de monsters vooraf bebroede met ERT-geconjugeerde magnetische kralen om afbrekende drug-specifieke factoren die zich aan de drug (zoals NAbs) voorafgaand aan een incubatie met cellen binden. Serieel worden monsters die scherm en bevestigen positief voor drugs-specifieke NAbs in de bepaling voor het genereren van een antilichaam titer verdund. Semi-kwantitatieve antilichamen titers kunnen worden gecorreleerd met metingen van de drug veiligheid en werkzaamheid.

Op de eerste dag van de methode, een bevroren hoeveelheid Jurkat cellen was ontdooid en verguld, en de monsters werden voorbereid. Figuur 1 toont een voorbeeld plaat kaart. Op de tweede dag, waren de monsters gemengd met de Jurkat cellen en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ongeveer 3 uur en 15 min. Vervolgens werden de cellen gewassen, vaste met PFA en geanalyseerd op een stroom cytometer. Figuur 2 toont voorbeeld stroom cytometer instellingen.
De stroom cytometry gating strategie was bedoeld voor het meten van de hoeveelheid fluorophore-geconjugeerde drug in levende één Jurkat cellen24 (Figuur 3). De cellen werden gescheiden van het puin door het opstellen van een hek dat cellulaire puin sluit [meestal laag voorwaartse scatter (FSC)] en dode cellen [meestal hoge kant scatter (SSC)], waardoor alleen levende cellen voor analyse25. Afzonderlijke cellen werden vervolgens van cel clusters gescheiden door het tekenen van een hek dat het hoge gebied van de FSC en de lage FSC hoogte26 sluit. De cellen werden behandeld met een levensvatbaarheid vlek die het label van een dode of ongezonde cellen zonder een intact membraan en een extra poort is gemaakt om uit te sluiten van de dode cellen22. De MFI van de levende enkele cellen werd gebruikt voor de analyse van de ERT fluorophore-geconjugeerde opname. Als een voorbeeld van potentieel screening test resultaten, de matrix verrijkt met een hoge mate van surrogaat anti-drug antilichaam positieve controle [bijvoorbeeld, kwalitatief hoogwaardige controle (HQC)] fluorophore-geconjugeerde ERT opname, wat resulteert in een lage MFI van geremd ongeveer 300 (Figuur 3). In tegenstelling, cellen geïncubeerd met de matrix in de afwezigheid van het antilichaam van de positieve controle moeten een hogere MFI (MFI = 37,830 in Figuur 3), demonstreren de opname van de ERT fluorophore-geconjugeerde.
De neutraliserende antilichamen van de positieve controle bijvoorbeeld hier werd geselecteerd op basis van het werkingsmechanisme van het geneesmiddel (dat wil zeggen, de ERT opname door middel van CI-M6PR). Een panel van fluorophores werd ook getest en vergeleken voor optimale assay gevoeligheid en dynamisch bereik1. CypHer 5e werd getest als gevolg van de toegenomen fluorescentie bij een zure pH, die wellicht relevant zijn voor sommige ERTs als extra maatregel van lysosomale targeting van de drug-27. Een groen fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488), en een far-red fluorescerende kleurstof (b.v.Alexa Fluor 647) werden eveneens onderzocht. Een voorbeeld van hoe de verschillende fluorophores kunt uitvoeren wordt voorgesteld in figuur 4a en 4b. In het voorbeeld had de Alexa Fluor 647 ERT de beste prestaties vanwege de superieure gevoeligheid (bijvoorbeeld, de hoogste % SI bij de laagste concentratie van de PC) en een breed dynamisch bereik (~ 3 ordes van grootte).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> Figuur 4: voorbeeld resultaten uit verschillende fluorophore-ERT geconjugeerde. (A) tijdens de assay-ontwikkeling, een positieve controle (PC) verdunning curve moet worden geëvalueerd met behulp van verschillende fluorophore-geconjugeerde ERTs. In het voorbeeld hieronder, twee fluorophore-geconjugeerde ERTs (Alexa Fluor 488 en CypHer 5e) bij 6,25 µg/mL en een helderder fluorophore-geconjugeerde ERT (Alexa Fluor 647) bij 1,56 µg/mL werden getest in het bijzijn van de toenemende concentraties van de positieve-control NAbs. (B) dit paneel toont de curven van paneel A opgenomen in een grafiek, met behulp van MFI's aan de aanmerkelijke toename in het dynamisch bereik met behulp van een Alexa Fluor 647-geconjugeerde ERT weergeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De beschreven methode is een trapsgewijze aanpak voor het opsporen, bevestiging, en interpoleren van een semi-kwantitatieve niveau van NAb titer3. Om vast te stellen van de bepaling is klaar voor een validatie, de parameters waaronder assay gevoeligheid, precisie, selectiviteit, specificiteit, drug tolerantie, robuustheid, en gesneden punten moeten worden beoordeeld volgens gevestigde guidances1,3 .
Monsters werden beschouwd als potentieel positieve in deze test, als % SI waarden die groter zijn dan de screening punt (SCP gesneden) werden verkregen. Het SCP was statistisch bepaald door testen van drug-naïeve monsters uit een representatieve populatie en meten van een relatieve afname van de signaal intensiteit (SI)3. Begeleiding (bijvoorbeeld van de FDA) raden het SCP is gehuisvest ophet 95-percentiel van de normaal verdeelde gegevensset en methoden voor de berekening van het SCP geweest1in detail elders beschreven. Een monster dat het assay signaal daalde (gemeten als een toename van de % SI) op of boven het SCP was vastbesloten als mogelijk positief, en monsters met resultaten die hoger is dan het SCP (zonder wijzigen of afname van de % SI) worden als negatief beschouwd.
Monsters die gescreend positief (% SI boven het SCP) werden getest in de bevestigende test om te bepalen van de specificiteit van NAbs aan de ERT. De bevestigende test werd uitgevoerd door vooraf aan het broeden monsters met magnetische kralen ERT-geconjugeerde drug-specifieke antilichamen of remmende factoren te verwijderen. De RR (de verhouding van de confirmatieve MFI aan screening MFI) werd geëvalueerd om te bepalen dat het aantal NAbs verwijderd uit het monster. Een hoger dan de berekende drempel van positiviteit [dat wil zeggen, de confirmatieve geslepen punt (CCP)] de aanwezigheid van anti-drug NAbs aangegeven RR. Zoals in de screening assay, moet CCP eerst worden vastgesteld door behandeling-naïeve monsters uit een representatieve populatie in de bevestigende analyse te evalueren. CCP was gebaseerd op een statistisch bepaald tarief van 1% vals-positieve en was de drempel aanwijzing een positief bevestigde monster (Figuur 5)3.
Monsters die gescreend en bevestigde positieve waren serieel verdund en getest in de titer-test om te bepalen van het relatieve niveau of de titer van NAbs in elk monster. De hoogste verdunning waartegen een steekproef tests positief wanneer het stak een aangewezen drempel [bijvoorbeeld de titer gesneden punt (TCP)] is de steekproef titer (Figuur 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> Figuur 5: voorbeeld monster testresultaten. Deze panelen tonen voorbeelden van monsters die getest positief of negatief door screening boven of onder een SCP 17.51% SI. Positieve monsters werden vervolgens getest in de bevestigende analyse met behulp van magnetische kralen drug-geconjugeerd aan het uitputten van het antilichaam van de drug-specifieke van de monsters vóór de test in de test. Monsters met een ratio van herstel (RR) groter dan de confirmatieve geslepen punt (dat wil zeggen, RR = 1.315) werden bevestigd te worden als positief beschouwd. Monsters die bevestigd positieve waren verdund tot het signaal de titer gesneden punt (TCP doorkruist) om de titer (verdunningsfactor) waartegen de steekproef-resultaat is gelijk aan de titer gesneden punt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Assay herhaalbaarheid en variabiliteit werden getest gedurende een aantal dagen en met meer dan één analist. De QCs werden aanvankelijk bereid in één batch en sub-aliquoted voor 1 x gebruik. In de loop van 3 d uitgevoerd twee analisten de bepaling met verschillende sets van QCs om aan te tonen van de precisie van de bepaling. In de voorbeeldgegevens weergegeven, de % CV van de precisie van de inter - en intra-assay voor het QCs kleiner zijn dan de FDA begeleiding van aanbeveling van % CV < 20% (Figuur 6)1.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> Figuur 6: voorbeeld van QC precisie gegenereerd van meer dan drie dagen met twee analisten. De precisie-gegevens werden berekend door een variantieanalyse (ANOVA) met behulp van de formule in het DeSilva et al. gepresenteerd 28. de intra-batch (binnen loopt) en de Inter batch (tussen runs) statistieken worden gerapporteerd als % CV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescentie te zien op de cellulaire opname van humaan lactoferrine en de Associated antivirale activiteit tegen het hepatitis C virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...