Name: detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00
Duration: 7 min 52 s
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Matrices humaines ont été achetées sur le marché avec l’approbation de leur Institutional Review Board (IRB) mais doivent être traités comme potentiellement infectieux. S’assurer que l’environnement de laboratoire utilisé maintienne une culture de sécurité12.
1. avant de commencer le test
<ol><li>Préparer ERT conjugué streptavidine billes magnétiques selon les instructions d'13 du fabricant.</li>
	<li>
Préparer les échantillons de contrôle de la qualité (QCs) : doper un anticorps de contrôle positif (PC) (par exemple, un NAb) dans la matrice spécifique à l’espèce (par exemple, mis en commun CSF ou le sérum). NOTE : Conseils de FDA et EMA recommandent prépare un haut et un bas QC pour la validation du test et de routine1,14.<ol>
<li>Par exemple, pour obtenir un QC à 10 µg/mL, ajouter 10 µL de contrôle positif stock 1 mg/mL en 990 µL de la matrice pertinente (p. ex., CSF) pour un volume total de 1 000 µL.</li>
		<li>Aliquote les échantillons QC dans un volume convenable pour une seule utilisent (p. ex., 50 µL) et geler les aliquotes à -60 à-80 ° C1.</li>
		<li>Aliquote un coupe-point-contrôle (CC), propres à chaque espèce matrice non traité par l’article de test(par exemple, mis en commun CSF ou sérum) pour une seule utilisation (p. ex., 50 µL) et geler les aliquotes à -60 à-80 ° C1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une réaction de conjugaison entre le fluorophore et l’ERT à l’aide d’un kit de protéine-étiquetage selon protocole15 les directives du fabricant. Aliquote l’échantillon dans un volume convenable pour une seule utilisation (p. ex., 50 µL) et geler les aliquotes à -60 à-80 ° C.</li>
</ol>2. jour 1 : Cellule électrodéposition et préparation des échantillons
<ol><li>
Préparation de la plaque cellulaire
	<ol>
<li>Utiliser un capuchon pour culture de tissus et de maintenir un environnement aseptique pour les étapes suivantes. Vaporiser chaque objet qui sera placé dans le capot avec l’éthanol à 70 % et de maintenir un environnement propre16,17,18.</li>
		<li>Chauffer le milieu de culture cellulaire (p. ex., RPMI-1640 avec 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine) dans un bain d’eau ou des perles à 37 ° C19.</li>
		<li>Plaque de culture approprié pour une utilisation sur un cytomètre en flux équipé d’un chargeur plaque de cellules cellules Jurkat de comte l’humain T lymphocytes et plaque 100 µL / puits à 7,5 x 105 cellules/mL dans un fond rond 96 puits.<ol>
<li>Par exemple, utiliser un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées pour compter les cellules20,21.</li>
			<li>Faire en sorte que les cellules aient au moins 70 % viabilité avant de procéder à l’expérimentation (par exemple, évaluer la viabilité de coloration bleu trypan)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité pendant la nuit pendant 14 à 20 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d’échantillons de dépistage
	<ol>
<li>Diluer le sujet ou d’analyse des échantillons de contrôle à l’aide d’un milieu sans sérum (p. ex., RPMI-1640). Dans l’exemple de méthode ici, diluer 1 : 2.5 échantillons en milieu RPMI-1640 en ajoutant 60 µL de l’échantillon à 90 µL de sérum. (par exemple, bande de 8 tubes). Passez à l’étape 3.1 pour le mode opératoire préparer un ERT marqués au fluorophore. Remarque : La dilution de 1 : 2.5 a été déterminée expérimentalement et est optimale pour la méthode présentée ici. Dilutions de l’échantillon optimale doivent être déterminées pour chaque méthode qui est développée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirmation préparation perle et échantillon
	<ol>
<li>Calculer le nombre de perles conjugué ERT requis pour les échantillons de confirmation.<ol>
<li>Par exemple, pour 10 échantillons, utilisez 10 µL d’échantillons x 100 de perles ERT conjugué par exemple + 30 % de bonus pour compenser des pertes pendant l’étape de lavage = 1 300 µL de perles ERT-conjugués.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex les perles soigneusement. Ajouter le nombre de billes dans un tube conique 15 mL pour le lavage.</li>
		<li>Laver les billes magnétiques conjugué ERT en ajoutant 1 300 µL de tampon de couplage ou comme suggéré par le fabricant (p. ex., avec tampon phosphate salin avec 0,1 % de polysorbate 20) suivant les étapes ci-dessous13.</li>
		<li>Vortex le tube soigneusement. Placer le tube dans un portoir magnétique pendant 2 min. Sans déranger les perles, aspirer avec précaution et éliminer le surnageant. Remarque : La solution passe du brun foncé au clair quand les perles sont tirés à l’aimant.</li>
		<li>Remettre en suspension les billes avec 1 300 µL de tampon de couplage. Répétez les étapes de lavage pour un total de quatre lavages.</li>
		<li>Après le lavage final, suspendre les perles dans 1 300 µL de tampon (précédemment calculé à l’étape 2.3.1.1) de couplage. Ajouter 100 µL par puits à un fond rond blanc, 96 puits, plaque de polypropylène non contraignante selon le plan de la plaque (par exemple, une confirmation bien par exemple ou QC ; l’échantillon sera scindé en doublons lorsque incubées avec l’ERT marqués au fluorophore).</li>
		<li>Placer la plaque sur un aimant longe le côté de 96 puits et laisser les perles former une boulette. Soigneusement, aspirer le surnageant clair et jetez-le. Remarque : La solution passe du foncé brune à claire après environ 1 à 2 min sur l’aimant longe le côté. Les perles obtenues sont appelés les perles « sec ».</li>
		<li>Si les échantillons positifs et sont se confirme, ajouter 100 µL de chaque échantillon avec et sans billes conjugué ERT bien dans les lieu/assignés. Sceller la plaque avec un film plastique et l’agiter pendant au moins 60 min sur un agitateur rotatif à environ 800 tr/min à température ambiante (RT). NOTE : Précédemment préparé et congelé positives et négatives QCs et la CC devraient figurer sur chaque plaque.</li>
		<li>Après l’incubation, placer la plaque de confirmation sur l’aimant de longe le côté 96 puits et laisser les perles former une boulette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de titre dilution série
	<ol>
<li>Pour préparer une série de titres, en série de diluer l’échantillon dans la matrice de mise en commun un nombre suffisant de fois pour traverser le titre prédéterminé coupe point1.</li>
		<li>Par exemple, mélanger 30 µL de l’échantillon à 60 µL de matrice regroupée dans une série de dilution de 1:3 pour un total de 8 dilutions (par exemple, bande de 8 tubes). Passez à l’étape 3.1 pour le mode opératoire préparer ERT marqués au fluorophore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. jour 1 : Mode opératoire
<ol><li>
Préparer l’ERT fluorophore marquée dans le milieu sans sérum (par exemple, 60 µL par puits, soit environ 6 mL/plaque).
	<ol>
<li>Par exemple, pour préparer 10 mL de 1 µg/mL marqués au fluorophore ERT, ajouter 10 µL de stock 1 mg/mL marqués au fluorophore ERT à 9,99 mL de milieu sans sérum (p. ex., RPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dans une nouvelle période d’incubation plaque (p. ex., plaque 96 puits, blanc, fond rond, compromettante de polypropylène), ajoutez les échantillons préparés d’après l’étape 2.2, 2.3, ou 2.4 et un fluorophore marqué ERT dans un mélange de 1:1 dans les puits dédoublés (p. ex., transfert 60 µL de chaque préparation échantillon et ajouter 60 µL de l’ERT fluorophore marqués par puits). Remarque : Une carte de plaque expérience exemple est fournie à la Figure 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> Figure 1 : exemple d’un schéma expérience. Échantillons et un ERT fluorophore marqués ont été incubées pendant la nuit à 2 et 8 ° C. Les contrôles tels que le contrôle qualité (HQC), contrôle de qualité médiocre (LQC) et contrôle de la qualité négative (NQC) ont été projetés et confirmés sur les coins opposés de la plaque pour évaluer l’homogénéité de la plaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="3"><li>Mélanger les échantillons et l’ERT fluorophore marqués en pipettant également monter et descendre plusieurs fois avec une pipette multicanaux. Envelopper les plaques dans le clinquant et les incuber pendant la nuit entre 2 et 8 ° C pendant 14 à 20 h.</li>
</ol>4. jour 2 : Ajouter les échantillons préparés aux cellules
<ol><li>Retirer la plaque (s) d’incubation d’échantillon de l’incubation entre 2 et 8 ° C et chauffer les plaques en les plaçant dans un bain de perle à 37 ° C pendant 10 à 15 min.</li>
	<li>Supprimer les cellules de l’incubateur à CO2 . Effectuer une vérification visuelle des cellules plaqués à l’aide d’un microscope inversé pour vérifier que les cellules apparaissent sain et équilibré à travers les puits17,19.</li>
	<li>Ajouter 100 µL des échantillons préalablement mélangés et ERT fluorophore marquée d’une plaque de cellules selon le plan expérimental de plaque.</li>
	<li>Replacez la plaque cellulaire avec les échantillons ajoutés dans l’incubateur à CO2 à 37 ° C. Incuber les plaques pour 3 h et ± 15 min. Remarque : Cette fois a été créée dans le laboratoire comme optimales pour la réponse de signal-bruit dans le dosage.</li>
	<li>Centrifuger la plaque cellulaire pendant 6 min à 320 x g dans une centrifugeuse de table 14 – 18 ° c. Confirmer la présence d’un culot au fond du puits de la plaque.</li>
	<li>Tenir la plaque à un angle de 30 à 45°. Retirer délicatement le surnageant de chaque puit sans déranger le culot cellulaire. Ajouter 200 µL de 1 x DPBS sur le culot cellulaire dans chaque puits pour remettre en suspension les cellules.</li>
	<li>Répétez la cellule lavage des étapes pour un total de 3 lavages. Procéder immédiatement à l’étape 5 pour la coloration de la viabilité cellulaire.</li>
</ol>5. jour 2 : Coloration de la viabilité de cellules
<ol><li>À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 100 µL d’une solution de 1 x tache Live/Dead dans chaque puits, sélectionnés pour une longueur d’onde de d’émission différente de celle de l’ERT marqués au fluorophore et préparé selon instructions22 les directives du fabricant.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 15 minutes à la RT dans l’obscurité. Centrifuger la plaque pendant 6 min à 320 x g dans une centrifugeuse de table 14 – 18 ° c.</li>
	<li>Retirer délicatement le surnageant de chaque puit sans déranger le culot cellulaire. Laver les cellules 1 x avec 1 x DPBS.</li>
</ol>6. jour 2 : Fixation des cellules avec du paraformaldéhyde 1 %
<ol><li>À l’aide d’une pipette multicanaux, administrer 100 µL de paraformaldéhyde réfrigérés (à 2 et 8 ° C) à 1 % (PFA) dans chaque puits.</li>
	<li>Sceller les plaques et les vortex d’impulsion à mélanger doucement. Enveloppez la plaque en fleuret et placez-le à 2 et 8 ° C pendant au moins 10 min pour permettre la fixation. Remarque : Veillez à éviter les éclaboussures sur le joint de la plaque.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de 1 x DPBS dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux haut en bas avant l’analyse.</li>
</ol>7. cytométrie en flux
<ol><li>Placer les plaques sur le cytomètre en flux avec le chargeur de plaque et de les exécuter.</li>
	<li>Acquérir et enregistrer l’intensité de fluorescence médiane mesurée (IMF) en utilisant le logiciel de cytométrie de flux (voir Table des matières). Remarque : Voir la Figure 2 à titre d’exemple pour les paramètres du chargeur. Le débit d’échantillon, volume de l’échantillon, volume, vitesses de mixage et beaucoup de mélanges de mélange sont optimisés pour ce dosage. Ces critères peuvent être ajustées en utilisant les touches «flèches vers le haut» ou «bas» à côté des numéros pour chaque critère, selon l’écoulement cytometry acquisition logiciel23.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> Figure 2 : exemple des paramètres de chargeur cytomètre en flux. Les paramètres du chargeur doivent être optimisés pour chaque série de tests qui est développé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="3"><li>Créer un cytomètre analyse/portes/parcelles, comme illustré à la Figure 3. Remarque : La création de porte et de la demande peuvent différer pour chaque écoulement cytometry logiciel23.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> Figure 3 : cytométrie en flux Gate stratégie. Les cellules Jurkat ont été séparés du nombre total d’événements et recueillies en traçant les avant-scatter (FSC) vs diffusion latérale (SSC) canaux et en dessinant une barrière autour de la population cible. Maillots de corps (cellules individuelles) ont été séparés des doublets ou cellule grand agrégats en utilisant la zone FSC (FSC-A) et FSC (FSC-H) de hauteur canaux. Des cellules vivantes ont été choisis par le blocage sur les cellules de singulet négatifs pour une tache de viabilité. L’intensité de fluorescence médian (MFI) a été mesurée dans des cellules Jurkat simples, direct et est tracée sous forme d’histogramme. Les valeurs de l’IFM des cellules avec l’absorption de drogues bloqué (par exemple, HQC) et des cellules avec le contrôle des quantités d’absorption sont indiquées (rouge et bleu, respectivement). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="4"><li>Exclure les cellules mortes de l’analyse et enregistre environ 10 000 événements23.</li>
</ol>8. analyse des données
<ol><li>Exporter les données (raw MFI) dans le logiciel d’analyse (voir Table des matières). Remarque : Selon l’analyse nécessaire, suivant l’analyse des données peut être effectué à l’aide de logiciels d’analyse.</li>
	<li>Calculer la moyenne MFI de puits dédoublés (QCs et échantillons) et le coefficient de variation (% CV) pour évaluer la variabilité de la propagation des doublons de la moyenne. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>Pour échantillons et QCs qui ont été projeté dans le test, calculer le pourcentage de signaux inhibition (SI %) par rapport à l’IFM moyen de la pour la matrice de mise en commun de QCs CC. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Le cas échéant, calculer les ratios de recouvrement (RR) pour les échantillons par rapport aux valeurs correspondantes écran QCs confirmés. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs sont employés et actionnaires de BioMarin Pharmaceutical Inc.

Les anticorps neutralisants ou autres facteurs qui empêchent l’absorption de l’ERT par CI-M6PR ont le potentiel impact ERT innocuité ou l’efficacité1. Par conséquent, il est important d’évaluer les NAbs dans les échantillons de matière en utilisant un modèle robuste pertinent au mécanisme du médicament d’action. Nous et autres avons trouvé que les performances de certains formats d’essais biologiques (p. ex., la dimérisation du récepteur, expression de la luciférase, etc.) ne sont pas aligné avec recommandations d’autorité de santé pour dosage de précision, la reproductibilité et sensibilité 29. dans la méthode d’analyse biologique décrite ici, des cellules Jurkat exprimant endogène CI-M6PR sont employés pour surveiller les NAbs spécifique à l’absorption ERT lysosomale. Combiné avec une lecture de cytométrie de flux, ce test utilise un modèle de cellulaire physiologique avec le test adéquat précision, sensibilité, reproductibilité et débit de l’échantillon haute. NAb détection avec un écoulement cytometry lecture a également été appliquée aux autres indications. Par exemple, les méthodes ont été développées pour détecter préexistants anticorps contre l’hépatite E et adeno-associated virus (AAV)30,31.
Les étapes critiques du protocole comprennent la sélection un fluorophore adapté, incorporant un LQC que moniteurs dosage sensibilité, assurer un niveau suffisant de viabilité des cellules et maintenir l’adhérence stricte à l’époque d’incubation. Dans l’exemple présenté ici, fluorophores (p. ex., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 et CypHer 5e), conjugué à un ERT lysosomal, variée considérablement dans leurs performances. Alexa Fluor 647, qui était également la plus brillante de fluorophore testé32, a été sélectionné pour le développement ultérieur de dosage. Il est recommandé que plusieurs fluorophores évaluer très tôt dans le développement de l’essai de fournir la meilleure sensibilité et une gamme dynamique. Sensibilité au cours de l’essai d’échantillon doit être surveillée en incluant un LQC qui est assez proche de la limite de sensibilité qu’il échouera dans 1 % des courses test1. Avec le HQC, le LQC agit également comme une aptitude système QC pour surveiller test dérive au fil du temps3. Performances et la viabilité cellulaire optimal est obtenu en préparant une banque de cellules des aliquotes à usage unique et de qualification dans les banques de cellules nouvelles basés sur comparables QC résultats3,18. Cellule et temps d’incubation fluorophore conjugué de drogue sont également centrales à une représentation cohérente de dosage étant donné que l’absorption de la drogue augmente avec la quantité de temps que le médicament est incubé avec des cellules. Afin de réduire la variabilité dans l’absorption de drogues, exemples de données peuvent être normalisées à échantillons témoins matrice regroupées sur chaque plaque (par exemple, les échantillons de contrôle du point de coupure dans la méthode ci-dessus). Un autre facteur important dans la production de données cohérentes avec cette méthode consiste à surveiller l’uniformité de la plaque et minimiser les éventuels effets de bord. Une première expérience peut inclure la réalisation de l’essai en utilisant un seul QC à travers une plaque entière, tandis que des expériences plus robustes peuvent être effectués pendant le test validation (p. ex., précision et exactitude)1. Cela démontre l’importance de la plaque carte mise en page33. Comme illustré dans l’exemple de carte de plaque, des échantillons de contrôle de la qualité placés des deux côtés de l’écran plat une uniformité qui peut être suivie au fil du temps avec des graphiques de Levey-Jennings34.
Alors que ce dosage surveille NAbs et autres facteurs qui peuvent entraver l’absorption ERT lysosomale, expériences supplémentaires peuvent être effectuées pour confirmer une inhibition de l’absorption due à des anticorps. Une option est de traiter des échantillons avec la protéine A/G/L, qui lie non spécifique des immunoglobulines35. Si les échantillons continuent d’un test positif après épuisement A/G/L de protéine, un facteur inhibiteur non-anticorps peut être responsable de la bloquant l’absorption de drogues. La méthode décrite ici a été conçue pour mesurer l’inhibition de l’absorption médiée par les anticorps et le contrôle positif et autre essai paramètres devraient être reconsidérés si un pourcentage élevé d’échantillons présentant des facteurs inhibiteurs non-anticorps est trouvé.
Le test peut également qualifier davantage afin de démontrer les trafics de drogue fluorophore marqués au compartiment cellulaire approprié sur base du mécanisme d’action du médicament. Dans l’exemple présenté ici, un ERT est censée lier CI-M6PR sur la surface de la cellule et ce trafic vers le lysosome. Nous avons déjà indiqué les résultats de plusieurs expériences, ce qui indique que la quasi-totalité du signal fluorescent observé dans les résultats de la méthode de ERT fluorophore marqués dans le lysosome8. Nous avons constaté que le signal ERT fluorophore marqués a été éliminé après un traitement des cellules avec la cytochalasine B, ce qui perturbe l’internalisation par le biais de l’inhibition de la réorganisation de l’actine. Aussi, des expériences trempé fluorophore externe avec le bleu trypan ou internalisation ralentie en plaçant des cellules à 4 ° C, indiquent que l’ERT marqués au fluorophore est rapidement assimilé et très peu de fluorescence est due à un ERT lié à la surface cellulaire. Ciblage lysosomal a été confirmée en visualisant la co-localisation de sensibles au pH lysotracker colorant avec la drogue fluorophore conjugué à l’aide de la microscopie confocale. Une spécificité pour l’absorption par l’intermédiaire de CI-M6PR peut-être également être vérifiée à l’aide de M6P exogène de rivaliser avec les médicaments étiquetés pour la liaison aux récepteurs. Des expériences similaires doivent être effectuées pour vérifier la cinétique d’absorption et de la localisation cellulaire des médicaments conjugué à un fluorophore lors d’autres essais.
Cette plate-forme de test à base de cellules a été utilisée pour étudier les NAbs pour des médicaments thérapeutiques qui utilisent l’endocytose CI-M6PR. Nous avons récemment rapporté les résultats à l’aide de cette plate-forme de test qui a montré aucune corrélation entre le développement d’une efficacité NAb et drogue pour elosulfase alfa36,37. Pour valider l’analyse de prélèvements cliniques de test, les paramètres, y compris la sensibilité, précision, sélectivité, spécificité, accoutumance, robustesse et couper les points, devrait être évalué selon les lignes directrices établies3, 4. il faut aussi noter, lysosomal SRTL, que développent NAbs susceptibles de nuire à l’activité de la drogue via la liaison de près le site catalytique de l’enzyme. En règle générale, nous considérons suivi ce type de NAb à être une priorité plus faible car l’environnement hostile d’acide et protéolytique du lysosome n’est pas favorable à l’anticorps-ERT interactions2,39,40. Toutefois, il est possible que NAbs protéolytique résistant existent et peuvent inhiber la partie catalytique d’une drogue40. Cette absorption Test moniteurs marqués au fluorophore ERT le lysosome, et une limitation du dosage est l’incapacité à contrôler NAbs protéolytique résistant. Si ce type de NAb l'on soupçonne sur l’innocuité ou de données sur l’efficacité, une analyse qui surveille l’activité de l’ERT devrait être développée et utilisée pour tester les échantillons.
L’évaluation de l’immunogénicité est importante pour comprendre les effets de l’ICN sur l’innocuité des médicaments et l’efficacité. L’identification de NAbs capable d’inhiber, in vitro drug absorption via CI-M6PR fournit une opportunité pour comprendre NAb activité in vivo. La méthode présentée ici utilise une lignée cellulaire humaine qui exprime CI-M6PR pour mesurer l’interférence du fluorophore conjugué lysosomal ERT absorption cellulaire. Cette méthode a déjà été utilisée pour surveiller les NAbs pour plusieurs équipes d’experts visant à traiter les maladies lysosomales. Cette plate-forme de test peut-être s’appliquer à d’autres méthodes pour étudier les effets de l’ICN sur les thérapies biologiques nécessitant une internalisation cellulaire pour leur bon fonctionnement.

Évaluation de l’immunogénicité est une partie importante de l’innocuité et l’efficacité, programme de surveillance pour tout produit thérapeutique biologique, y compris les équipes d’experts. Les patients peuvent développer une réponse immunitaire qui peuvent toucher directement les profils pharmacocinétique/pharmacodynamique, d’efficacité et innocuité des médicaments. Un sous-ensemble de ces ADA, appelé NAbs, peut inhiber l’efficacité ERT de deux façons : par l’intermédiaire de l’inhibition de l’absorption de l’ERT dans la cellule cible ou en inhibant l’activité catalytique de l’ERT. La méthode présentée ici est conçue pour mesurer les NAbs qui interfèrent avec l’absorption de l’ERT en cellules. Pour complètement contrôler l’innocuité et l’efficacité de l’ERT thérapeutique, le monitorage continu des ICN est crucial dans l’élucidation des corrélations possibles avec les résultats cliniques ou effets pharmacodynamiques1.
Plateformes d’évaluation NAbs contre les protéines thérapeutiques comprennent l’activité enzymatique, basés sur les cellules et les essais de liaison du ligand1. La plate-forme dosage optimal est sélectionnée selon divers critères : le mécanisme d’action du produit thérapeutique, la sensibilité de plateforme de test, sélectivité, précision et surtout, sa capacité à imiter l’action inhibitrice de NAbs en vivo . Tests de liaison du ligand peuvent convenir dans certains cas (par exemple, lorsqu’une lignée de cellules concernées ne peut être identifiée ou si la sensibilité appropriée ne peut être atteint dans un essai sur les cellules). Toutefois, dans le projet 2016 directives de la FDA pour le document d’industrie et d’autres livres blancs reconnues, NAb basés sur les cellules des essais sont recommandés car ils peuvent mieux refléter le mécanisme biologique de la drogue en vivo1,2 , 3.
Les composants essentiels pour le développement d’un test de NAb basés sur les cellules d’écoulement cytometry comprennent une lignée cellulaire appropriée qui répond à la stimulation de la drogue, un substitut positif-contrôle NAb qui neutralise l’ERT, un fluorophore conjugué ERT et l’espèce de test biologique matrice4,5,6. La sélection de ligne cellulaire repose sur le mécanisme de l’ERT d’action et plusieurs lignées cellulaires devraient être évaluées au cours de l’essai développement3. Dans la méthode décrite ici, des cellules T Jurkat ont été sélectionnés pour leur expression endogène de CI-M6PR sur la surface des cellules et l’absence de récepteurs de fragment d’anticorps (FcRs) qui lient sans discernement la région Fc de la plupart des anticorps7,8 . Au cours du développement de dosage, il est important d’établir un contrôle négatif pour les études de validation et de l’échantillon test, comme le sérum mis en commun par des individus qui n’ont pas été traités avec le test de l’article1. Lignées cellulaires devraient également tolérer des matrices pertinentes provenant de différentes espèces pour assurer la continuité à travers les étapes non cliniques, cliniques et après la commercialisation du médicament développement1. Un autre élément est la sélection du contrôle positif de l’analyse. Le contrôle positif pour la détermination de l’absorption cellulaire ERT a été choisi basée sur sa capacité à lier la thérapeutique et de neutraliser l’absorption par l’intermédiaire de CI-M6PR9,1. Il est souvent difficile d’obtenir des quantités utiles ou durables des antisérums neutralisants de sujets humains pour utilisation comme un témoin de l’essai, en particulier dans les maladies rares populations de patients2. Des solutions de rechange incluent antisérums animaux hyper immunisés ou purifiés par affinité polyclonaux ou monoclonaux anticorps dopés au dosage pertinent matrice1. Tout en utilisant une matrice spécifique à l’espèce, il est possible que les inhibiteurs facteurs autres que les anticorps présents dans la matrice peuvent inhiber l’absorption de l’ERT. Un autre élément crucial du test est l’ERT conjugué à un fluorophore. La sélection du fluorophore pour la conjugaison de l’ERT devrait être évaluée pour chaque ERT, selon les besoins de l’essai pour la luminosité, la stabilité du pH et des chevauchements spectrale dans d’autres chaines sur le cytomètre en flux.
L’essai décrit ici est un exemple pour mesurer un NAb à une protéine thérapeutique, comme un ERT, qui pénètre dans la cellule via CI-M6PR. Plusieurs équipes d’experts, destinés à traiter les troubles de la maladie de surcharge lysosomale (DSL), utiliser cette voie pour l’apport des cellules et le ciblage lysosomal, y compris elosulfase alfa cerliponase alfa pour la maladie de Batten CLN2, syndrome de Morquio A, agalsidase alfa pour la maladie de Fabry, et l’alglucosidase alfa pour la maladie de Pompe10,11. Le but de cette méthode consiste à mesurer les niveaux relatifs de NAbs qui interfèrent avec les drogues liaison et internalisation via CI-M6PR. Cette opération est effectuée en plusieurs niveaux de dépistage, confirmation et titre étapes3. Échantillons sont d’abord projetés pour NAb positivité et ensuite confirmés positifs dans l’étape de confirmation. Enfin, échantillons d’écran et confirment positifs peuvent être dilués en série pour générer un anticorps titre1. Ce dosage de capture flux basé sur la cellule cytometry drogue fournit une méthode sensible et pertinente mécaniquement le in vitro de mesure NAbs spécifiques à cette drogue qui peuvent affecter le profil pharmacologique du médicament. Précédemment, nous avons validé la méthode et testé des échantillons cliniques utilisant cette plate-forme pour les drogues elosulfase alfa8. Nous décrivons ici le protocole détaillé étape par étape qui peut être appliqué à d’autres protéines thérapeutiques ou ERTs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

L’administration de thérapies de remplacement d’enzymes (ERTs) et d’autres thérapies biologiques aux patients peuvent déclencher une réponse immunitaire de lutte contre la drogue. La caractérisation de ces anticorps de lutte contre la drogue (ADA), en particulier ceux qui peuvent neutraliser l’activité biologique de la drogue, appelée anticorps neutralisants (NAbs), est essentielle pour comprendre les effets de ces anticorps sur la drogue Profil pharmacologique. Ce protocole décrit une méthode de cytométrie de flux basé sur la cellule afin de détecter les facteurs qui neutralisent l’assimilation d’un représentant de ERT lysosomal dans la matrice humaine. Le protocole se compose de trois procédures : dépistage, une étape de confirmation et le titre des épreuves pour détecter, identifier et d’établir le niveau relatif du titre d’anticorps dans les échantillons de neutralisation.
Dans cette méthode, les échantillons sont tout d’abord mélangés avec le produit ERT conjugué à un fluorophore, puis incubées en présence de cellules [par exemple, les lymphocytes T humains (cellules Jurkat)] qui expriment un surface cellulaire indépendante des cations mannose-6-phosphate récepteur (CI-M6PR), et Enfin, analysées avec un cytomètre en flux. Un échantillon sans NAbs entraîne l’absorption de la conjugaison fluorophore ERT produit via CI-M6PR, alors que, la présence de NAbs se lier au médicament et interfère avec la liaison de CI-M6PR et l’absorption. Le montant de l’ERT conjugué à un fluorophore internalisé par les cellules Jurkat est mesuré par cytométrie en flux et évalué comme l’inhibition de signal de pourcentage (%) par rapport à la réponse obtenue en présence d’une matrice représentant naïfs. Dans l’étape de confirmation, les échantillons sont préalablement incubées avec ERT conjugué des billes magnétiques pour épuiser les facteurs spécifiques à cette drogue qui se lient à la drogue (par exemple, NAbs) avant une incubation avec des cellules. Échantillons d’écran et confirme positif pour NAbs spécifiques à cette drogue dans le test sont dilués puis en série pour générer un titre d’anticorps. Les titres d’anticorps semi-quantitatives peuvent être corrélés avec des mesures d’innocuité et d’efficacité.

Le premier jour de la méthode, une aliquote congelée de cellules Jurkat a été décongelée et plaquée, et les échantillons d’essai ont été préparées. La figure 1 montre une carte de plaque d’exemple. Le deuxième jour, les échantillons ont été mélangées avec les cellules Jurkat et incubés à 37 ° C pendant environ 3 h et 15 min. Les cellules ont été ensuite lavés, fixe avec PFA et analysés sur un cytomètre en flux. La figure 2 montre exemple flux cytomètre en paramètres.
La cytométrie en flux Gate stratégie visait à mesurer la quantité de médicament conjugué à un fluorophore dans vivre seul Jurkat cellules24 (Figure 3). Les cellules ont été séparés des débris en dessinant une porte qui exclut les débris cellulaires [habituellement, lente avant dispersion (FSC)] et les cellules mortes [habituellement, côté haut scatter (SSC)], laissant seulement des cellules vivantes pour analyse25. Cellules individuelles ont ensuite été séparés d’agrégats cellulaires en dessinant une porte qui exclut la zone haute de la FSC et le FSC faible taille26. Les cellules ont été traitées avec une tache de viabilité qui a marqué toutes les cellules mortes ou insalubres sans une membrane intacte, et une porte supplémentaire a été créée afin d’exclure les cellules mortes22. L’IFM des cellules vivantes unique a été utilisée pour l’analyse de l’absorption ERT conjugué à un fluorophore. Comme un exemple du potentiel de résultats du test de dépistage, la matrice additionnée d’une quantité élevée de substitution anti-drogue positif contrôle anticorps [par exemple, contrôle de qualité (HQC)] inhibe l’absorption du ERT conjugué à un fluorophore, résultant en une faible IMF de environ 300 (Figure 3). En revanche, les cellules incubées avec la matrice en l’absence de l’anticorps de contrôle positif devraient avoir une IMF plus élevée (MFI = 37 830 à la Figure 3), démontrant la captation de l’ERT conjugué à un fluorophore.
Le neutraliser les anticorps de contrôle positif pour l’exemple ici a été choisi basé sur le mécanisme d’action du médicament (p. ex., l’absorption de l’ERT par CI-M6PR). Un panel de fluorophores fut également testé et comparé pour sensibilité optimale et une gamme dynamique1. CypHer 5e a été testé en raison de l’augmentation de la fluorescence à un pH acide, qui pourraient être pertinents pour certaines équipes d’experts comme une mesure supplémentaire de ciblage lysosomal de la drogue27. Un colorant fluorescent vert (p. ex., Alexa Fluor 488) et un colorant fluorescent rouge sombre (p. ex., Alexa Fluor 647) ont aussi été examinés. Un exemple de comment les différents fluorophores peut s’exécuter est présenté dans la Figure 4 a et 4 b. Dans l’exemple, l’Alexa Fluor 647 ERT avait les meilleures performances en raison de sa sensibilité supérieure (par exemple, le plus élevé % SI à la plus faible concentration de PC) et une gamme dynamique (~ 3 ordres de grandeur).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> Figure 4 : exemple résulte de différents fluorophore-ERT conjugués. (A) au cours du développement de dosage, une courbe de dilution du contrôle positif (CP) soit évaluée au moyen différents ERTs conjugué à un fluorophore. Dans l’exemple illustré ici, les deux conjugués fluorophore ERTs (5e Alexa Fluor 488 et CypHer) à 6,25 µg/mL et un meilleur ERT de fluorophore conjugué (Alexa Fluor 647) à 1,56 µg/mL ont été testés en présence de concentrations croissantes de contrôle positif NAbs. (B), ce panneau montre les courbes de panneau A représenté graphiquement, à l’aide de MFI pour montrer l’augmentation importante dans la gamme dynamique à l’aide d’un conjugué Alexa Fluor 647 ERT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La méthode décrite est une approche par paliers pour détecter, confirmant et interpoler un niveau quasi quantitatif de NAb titre3. Pour établir le dosage est prêt pour la validation, les paramètres, y compris la sensibilité, précision, sélectivité, spécificité, accoutumance, robustesse, et de points de coupe doivent être évaluées selon établi des lignes directrices1,3 .
Les échantillons ont été considérés potentiellement positifs dans ce test lorsque les valeurs de % SI supérieurs à la projection coupe point (SCP) ont été obtenus. Le SCP a été déterminé statistiquement naïfs les échantillons provenant d’une population représentative et en mesurant une baisse relative signal intensité (SI)3. Orientation (par exemple de la FDA) recommande que la SCP s’établit à la 95ème percentile de l’ensemble de données distribuée normalement, et les méthodes de calcul du SCP ont été décrites en détail ailleurs1. Tout échantillon qui diminue le signal de test (mesuré par l’augmentation du % SI) égale ou supérieure à la SCP est jugée potentiellement positifs et des échantillons avec des résultats plus élevés que le SCP (avec no modifier ou diminuer le % SI) sont considérés comme négatifs.
Exemples de dépistage positif (% SI au-dessus de la SCP) ont été testés dans le test de confirmation pour déterminer la spécificité de NAbs de l’ERT. Le test de confirmation a été réalisé en incubant des échantillons avec ERT conjugué des billes magnétiques pour éliminer les anticorps spécifiques à cette drogue ou facteurs inhibiteurs. Le RR (le ratio de confirmation IFM aux IMF de contrôle) a été évalué afin de déterminer que le nombre de NAbs retiré de l’échantillon. Un RR supérieur au seuil calculé de positivité [c'est-à-direle point de coupure confirmatif (CCP)] a révélé la présence de NAbs de lutte contre la drogue. Comme dans le test de dépistage, le CCP il faudrait tout d’abord en évaluant des échantillons naïfs de tout traitement d’une population représentative dans le test de confirmation. CCP a été basé sur un taux de faux positifs statistiquement déterminé 1 % et a été le seuil désignant un échantillon positif confirmé (Figure 5)3.
Échantillons présentés et ont été confirmés positifs étaient en série dilués et analysés avec le titre de test pour déterminer le niveau relatif ou titre du NAbs dans chaque échantillon. La dilution la plus élevée au cours de laquelle un échantillon tests positifs lorsqu’il a franchi un seuil désigné [par exemple, le titre coupé point (TCP)] est l’échantillon titre (Figure 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> Figure 5 : exemple exemple résultats des tests. Ces panneaux montre des exemples d’échantillons qui se sont avérés positifs ou négatifs par tamisage au-dessus ou en dessous d’une SCP de 17,51 % SI. Les échantillons positifs ont ensuite été testées dans le dosage de confirmation à l’aide de billes magnétiques conjugué drogue pour épuiser les anticorps spécifiques à cette drogue des échantillons avant l’essai dans le dosage. Les échantillons avec un ratio de recouvrement (RR) supérieur à la confirmation point de coupure (c.-à-d., RR = 1,315) ont été considérés positifs à confirmer. Les échantillons qui ont été confirmés positifs ont été dilués jusqu'à ce que le signal traverse le titre coupé point (TCP) pour établir le titre (facteur de dilution), au cours de laquelle le résultat de l’échantillon est égal à titre coupe point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Test de répétabilité et de la variabilité ont été testés sur plusieurs jours et avec plus d’un analyste. Le QCs ont été initialement préparé en un seul lot et sub-aliquotés pour une utilisation de 1 x. Au cours des 3 d, deux analystes a effectué le test avec plusieurs ensembles de QCs pour démontrer la précision des mesures. Dans les données de l’exemple montrées, le %CV de la précision inter - et intra-essai pour le QCs est inférieure à la recommandation de directives de la FDA de % CV < 20 % (Figure 6)1.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> Figure 6 : exemple de généré plus de trois jours avec deux analystes des données de précision QC. Les données de précision ont été calculées par une analyse de variance (ANOVA) à l’aide de la formule présentée à DeSilva et al. 28. les intra-lot (dans les courses) et les statistiques de l’inter-lot (entre les séries) sont signalés comme % CV <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Nous présentons ici une méthode de cytométrie de flux basé sur la cellule afin de détecter les anticorps neutralisants ou autres facteurs qui interfèrent avec l’absorption cellulaire des thérapies de remplacement enzymatique dans une matrice humaine, comme le liquide céphalo-rachidien (LCR) ou de sérum humain.

Détection des anticorps qui neutralisent l’assimilation de thérapies de remplacement de Enzyme avec un Cell-based Assay

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