Name: detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

המחברים יש אין התודות.

מטריצות האנושי נרכשו ממקורות מסחריים עם אישור מ שלהם מוסדיים סקירה לוח (IRB) אך יש להתייחס גם פוטנציאל זיהומיות. ודא כי הסביבה מעבדה המשמש שומר על תרבות של בטיחות12.
1. לפני שמתחילים וזמינותו
<ol><li>להכין streptavidin מצומדת ERT beads מגנטי לפי הוראות היצרן13.</li>
	<li>
להכין דגימות בקרת איכות (QCs): ספייק של נוגדן בקרה חיובית (PC) (למשל, NAb) המטריצה ספציפית (למשל, במאגר CSF או סרום). הערה: ה-FDA והדרכה EMA ממליץ על הכנת גבוה ו- QC נמוכה של אימות וזמינותו של שגרת בדיקות1,14.<ol>
<li>לדוגמה, כדי להשיג QC-µg 10/mL, להוסיף 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל מניות שליטה חיובית לתוך 990 µL המטריקס הרלוונטי (למשל, CSF) עבור אמצעי אחסון סך של 1,000 µL.</li>
		<li>Aliquot הדגימות QC באמצעי אחסון מתאים יחיד השתמש (למשל, 50 µL), להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס1.</li>
		<li>Aliquot גזור-נקודת-פקד (CC), מטריקס תלויי מין אינו מטופל באמצעות מבחן במאמר (למשל, במאגר CSF או סרום) בודד (למשל, 50 µL) ולהשתמש להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע תגובה ההטיה בין את fluorophore של ERT באמצעות ערכת תיוג-חלבון על פי פרוטוקול של היצרן15. Aliquot המדגם באמצעי אחסון מתאים יחיד (למשל, 50 µL) ולהשתמש להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. יום 1: ציפוי תא, הכנת הדוגמא
<ol><li>
הכנת צלחת תא
	<ol>
<li>השתמש ברדס תרביות רקמה ולתחזק סביבת aseptic בשלבים הבאים. תרסיס כל אובייקט זה יוצבו בשכונה עם 70% אתנול ולשמור על סביבה נקייה16,17,18.</li>
		<li>חמים (למשל, RPMI-1640 עם 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין) מדיום הגידול תא באמבט מים או חרוז בגיל 37 ° C19.</li>
		<li>ספירת ה-T אנושיים לימפוציטים Jurkat תאים, µL צלחת 100 לכל במעגן 7.5 x 105 תאים למ"ל בשנת 96-ובכן עגול-תחתון התא המתאים לשימוש cytometer זרימה מצויד עם העובדים צלחת צלחת תרבות.<ol>
<li>לדוגמה, השתמש hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטיות לספור תאים20,21.</li>
			<li>ודא כי התאים יש לפחות 70% הכדאיות לפני שתמשיך את הניסוי (למשל, להעריך את הכדאיות עם trypan blue מכתים)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>דגירה התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2 ו- 95% לחות ללילה עבור h 14 – 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הדוגמא ההקרנה
	<ol>
<li>לדלל את הנושא או assay דגימות הבקרה באמצעות מדיה ללא סרום (למשל, RPMI-1640). דוגמה השיטה פה, לדלל דגימות 1:2.5 ב RPMI-1640 על-ידי הוספת µL 60 מדגם µL 90 של מדיה ללא סרום. (למשל, חשפנות-8 צינורות). המשך לשלב 3.1 שהפרוצדורה assay להכין של ERT התווית על-ידי fluorophore. הערה: הדילול של 1:2.5 נקבע ניסיוניים, אופטימאלית השיטה המובאת כאן. צריך להיות נחוש דילולים מדגם אופטימלי עבור כל שיטת שפותחה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מאשרות הכנה חרוז, לדוגמה
	<ol>
<li>לחשב את מספר חרוזים מצומדת ERT לצורך דגימות מאשרות.<ol>
<li>לדוגמה, עבור 10 דגימות, להשתמש µL 10 דוגמאות x 100 של ERT מצומדת חרוזים לכל דגימה + 30% יותר כדי לפצות על ההפסדים במהלך השלב כביסה = 1,300 µL מצומדת ERT החרוזים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מערבולת החרוזים ביסודיות. להוסיף מספר המחושב של חרוזי צינור חרוטי 15 מ"ל לרחצה.</li>
		<li>לשטוף את מצומדת ERT beads מגנטי על-ידי הוספת µL 1,300 צימוד המאגר או כפי שהוצע על ידי היצרן (למשל, עם באגירה פוספט תמיסת מלח עם 0.1% polysorbate 20) השלבים להלן13.</li>
		<li>מערבולת הצינור ביסודיות. מקם את הצינור מתלה מגנטי צינור למשך 2 דקות. מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות תשאף ולמחוק את תגובת שיקוע. הערה: הפתרון יהפוך מן חום כהה כדי לנקות כאשר חרוזים נמשכים למגנט.</li>
		<li>Resuspend את החרוזים עם µL 1,300 מצמד מאגר. חזור על השלבים שטיפת בסך ארבעה שוטף.</li>
		<li>לאחר השטיפה הסופית להשעות את החרוזים ב 1300 µL מצמד מאגר (בעבר שחושבו בצעד 2.3.1.1). הוסף µL 100 לכל טוב 96-ובכן, לבן, עגול-תחתון, צלחת פוליפרופילן מחייב לפי המפה צלחת (למשל, אחד טוב לכל דגימה או QC; הרצון מדגם ניתן לחלק את כפילויות בעת הדגירה עם ERT התווית על-ידי fluorophore).</li>
		<li>מניחים את הצלחת על מגנט בצד הילך 96-ובכן ולאפשר את החרוזים ליצירת גלולה. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע ברור וזורקים אותו. הערה: הפתרון יהפוך מ כהה חום כדי נקי לאחר כ- 1-2 דקות על המגנט הילך בצד. החרוזים שהושג נקראים החרוזים "יבש".</li>
		<li>אם הדגימות החיוביות אשר להיות מאושרות, להוסיף 100 µL של כל דגימה עם ובלי חרוזים מצומדת ERT לתוך המתאים/שהוקצו היטב. לאטום את הצלחת עם סרט פלסטיק ולנער אותו לפחות 60 דקות ב מטרף רוטרי כ 800 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT). הערה: בעבר מוכן, קפוא חיוביים ושליליים QCs ועותק ייכללו על כל צלחת.</li>
		<li>לאחר הדגירה, למקם את הצלחת מאשרות על המגנט הילך בצד 96-ובכן, לאפשר את החרוזים ליצירת גלולה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כייל נוגדנים דילול סדרת הכנה
	<ol>
<li>כדי להכין סדרה כייל נוגדנים, באופן סדרתי לדלל את הדגימה המטריצה במאגר מספר מספיק של פעמים לחצות את כייל מראש לחתוך נקודה1.</li>
		<li>לדוגמה, מערבבים µL 30 לדוגמה כדי µL 60 של מטריקס במאגר בסדרה דילול 1:3 על סך של דילולים 8 (למשל, חשפנות-8 צינורות). המשך לשלב 3.1 שהפרוצדורה assay להכין ERT התווית על-ידי fluorophore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. יום 1: Assay הליך
<ol><li>
הכינו את התווית על-ידי fluorophore ERT במדיום נטול סרום (למשל, µL 60 לכל טוב, או כ מ ל/צלחת 6).
	<ol>
<li>לדוגמה, כדי להכין 10 מ"ל של µg 1/mL התווית על-ידי fluorophore ERT, להוסיף 10 µL של מניות 1 מ"ג/מ"ל התווית על-ידי fluorophore ERT עד מ"ל 9.99 של מדיה ללא סרום (למשל, RPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדגירה החדשה צלחת (למשל, צלחת פוליפרופילן 96-ובכן, לבן, סיבוב המדרגה, מחייב), להוסיף את הדגימות מוכן מכל צעד 2.2, 2.3, או 2.4 ו של ERT התווית על-ידי fluorophore בתערובת 1:1 בבארות כפולות (לדוגמה, העברה 60 µL של כל אחד מוכן מדגם ולהוסיף 60 µL של ERT התווית על-ידי fluorophore לכל טוב). הערה: מפה את הצלחת הניסוי של דוגמה מסופק באיור1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> איור 1: דוגמה של פריסה צלחת של ניסוי. ודוגמאות של ERT התווית על-ידי fluorophore היו מודגרות ללון ב- 2-8 ° C. פקדים כגון שליטה באיכות גבוהה (HQC), שליטה באיכות נמוכה (LQC), בקרת איכות שלילי (NQC) היו מוקרן, אישר על פינות נגדיות של צלחת כדי להעריך את הצלחת אחידות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="3"><li>לערבב את הדגימות ERT את התווית על-ידי fluorophore על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה רב-ערוצי. לעטוף את הצלחות ביותר ברדיד אלומיניום, דגירה אותם בן לילה ב 2-8 ° C עבור h 14 – 20.</li>
</ol>4. יום 2: הוספת הדגימות מוכן לתאים
<ol><li>להסיר את plate(s) הדגירה מדגם הדגירה ב 2-8 ° C, לחמם את הצלחות על-ידי הצבתם באמבט חרוז ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.</li>
	<li>להסיר התאים החממה2 CO. לבצע בדיקה ויזואלית של תאים מצופים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח התאים יופיעו המתפלג ובריאה לאורך בארות17,19.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של דגימות מעורב בעבר, התווית על-ידי fluorophore ERT צלחת תא לפי המפה צלחת ניסיוני.</li>
	<li>מקום לצלחת תא עם הדגימות נוסף בחזרה לתוך החממה2 CO ב 37 º C. דגירה את הצלחת 3 h ו ± 15 דקות. הערה: הפעם הוקמה מעבדה אופטימלי התגובה האות לרעש וזמינותו.</li>
	<li>Centrifuge הלוח התא במשך 6 דקות ב x 320 g ומפרידה שולחן ב- 14-18 מעלות צלזיוס. לאשר הנוכחות של גלולה תא בתחתית הבארות צלחת.</li>
	<li>החזק את הצלחת בזווית של 30 – 45 מעלות. הסר בזהירות את תגובת שיקוע מכל קידוח מבלי להפריע בגדר התא. להוסיף 200 µL של x DPBS 1 אל בגדר תא בכל טוב כדי resuspend את התאים.</li>
	<li>חזור על התא שטיפת מדרגות בסך 3 מנקי. המשך מיד לשלב 5 עבור ההכתמה הכדאיות התא.</li>
</ol>5. יום 2: תא הכדאיות מכתים
<ol><li>באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 100 µL של הפתרון עובד 1 x הכתם חי/מת כל טוב, שנבחר עבור פליטה גל שונה מזו של ERT התווית על-ידי fluorophore, המוכנים לפי הוראות היצרן22.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 15 דקות ב RT בחושך. Centrifuge את הצלחת. בשביל 6 דקות ב x 320 g ומפרידה שולחן ב- 14-18 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע מכל קידוח מבלי להפריע בגדר התא. לשטוף את התאים 1 x עם 1 x DPBS.</li>
</ol>6. יום 2: תיקון התאים עם 1% Paraformaldehyde
<ol><li>באמצעות פיפטה רב-ערוצי, לוותר על 100 µL של 1% צוננת (ב 2-8 ° C) paraformaldehyde (PFA) כל טוב.</li>
	<li>חותם את הצלחות ואת בעדינות דופק מערבולת לערבב. עוטף את הצלחת רדיד האלומיניום ומניחים אותו ב- 2-8 ° C לפחות 10 דקות כדי לאפשר את הקיבעון. הערה: להיות זהירים כדי למנוע מתיז על החותם צלחת.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של 1 x DPBS לבאר כל באמצעות פיפטה רב-ערוצי למעלה ולמטה לפני הניתוח.</li>
</ol>7. דנ
<ol><li>מניחים את הצלחות על cytometer זרימה עם מטעין צלחת ולהפעיל אותם.</li>
	<li>לרכוש ולתעד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני נמדד (MFI) באמצעות התוכנה cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים). הערה: ראה איור 2 כדוגמה עבור ההגדרות מטעין. קצב הזרימה לדוגמה, נפח דגימה, ערבוב נפח, ערבוב מהירויות, ומספר mixes הממוטבות זה וזמינותו. קריטריונים אלה עשוי להיות מותאם באמצעות הלחצנים "חצים למעלה" או "למטה" ליד המספרים לכל קריטריון, בהתאם תוכנה23רכישה cytometry זרימה.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> איור 2: דוגמה של ההגדרות מטעין זרימה cytometer. צריך להיות ממוטב ההגדרות מטעין כל assay שפותחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="3"><li>צור cytometer ניתוח/שערים/מגרשים כמוצג באיור3. הערה: שער והמשך יישום עשויים להיות שונים עבור כל תוכנה cytometry זרימה23.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> איור 3: Flow cytometry gating אסטרטגיה. Jurkat התאים היו מופרדים מן האירועים הכולל, שנאספו על ידי ציור השער סביב אוכלוסית היעד וארגון קדימה-פיזור (FSC) לעומת צד-פיזור (האס) הערוצים. ללבישה (תאים בודדים) הופרדו מן doublets או תא גדול אגרגטים באמצעות האזור FSC (FSC-A) וערוצים גובה (FSC-H) FSC. תאים חיים נבחרו על ידי gating בתאי גופיה שלילית-כתם הכדאיות. עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) נמדדה בתאים Jurkat יחיד, בשידור חי, מותווים כמו היסטוגרמה. MFI הערכים של תאים עם תפיסה סמים חסומה (למשל, HQC), תאים עם בקרת כמויות של ספיגת מוצגים (אדום וכחול, בהתאמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="4"><li>לא לכלול תאים מתים מניתוח והקלטה של 10,000 אירועים23.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים
<ol><li>לייצא את הנתונים (raw MFI) לתוכנה ניתוח (ראה טבלה של חומרים). הערה: בהתאם הניתוח הדרוש, ניתוח הנתונים הבאים ניתן לבצע באמצעות ניתוח תוכנה.</li>
	<li>לחשב את הממוצע MFI של בארות כפולים (QCs ודוגמאות) המקדם של וריאציה (% CV) כדי להעריך את ההשתנות התפשטות של הכפילויות מהממוצע. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>כי QCs זה היו הוקרן וזמינותו, ודוגמאות לחשב האחוז אות עיכוב (% SI) ביחס MFI אכזרי של עבור המטריצה במאגר QCs CC. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>אם יש צורך, לחשב את יחס שחזור (Rr) עבור QCs ודוגמאות מאושרות ביחס ערכי מסך המתאימים. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).</li><li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression.">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li><li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome.">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease.">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li><li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapies+and+therapeutic+concepts+for+lysosomal+storage+diseases.">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li><li>Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> (2012)</li><li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).</li><li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Working+in+the+Hood.">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Basics Handbook. , (2010).</li><li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice.">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li><li>. Introduction to Cell Culture Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018)</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. Counting Cells with Bio-Rad&#39;s TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012)</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).</li><li>Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Flow+Cytometry:+A+Learning+Guide.">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li><li>. A guide to gating in flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016)</li><li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).</li><li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules.">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins.">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus.">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Charles River. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow+Cytometric+Method+to+Assess+Neutralizing+Antibodies+to+AAV+Gene-Therapy+Vectors.">A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors.</a> Charles River Researcher. , (2015).</li><li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays.">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).</li><li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome:+Results+From+MOR-005,+a+Phase+III+Extension+Study.">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li><li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa,+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome:+Results+from+MOR-004,+a+Phase+III+Trial.">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li><li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

המחברים העובדים הינם בעלי המניות של BioMarin פרמצבטיקה בע מ

נוגדנים נטרול או גורמים אחרים המונעים את ספיגת ERT דרך CI-M6PR יש פוטנציאל לפגיעה ERT בטיחות או יעילות1. לכן, חשוב להעריך NAbs בדגימות הנושא באמצעות מודל חזקים הרלוונטיים מנגנון הפעולה של התרופה. אנחנו ואחרים מצאו כי הביצועים של כמה פורמטים bioassay (למשל, קולטן dimerization, ביטוי לוציפראז, וכו ') לא מתיישבת עם המלצות רשות הבריאות עבור דיוק assay הפארמצבטית, רגישות 29. בשיטה bioassay המתוארים כאן, תאים Jurkat אקספרס CI אנדוגני-M6PR הם מועסקים לעקוב אחר NAbs ספציפית כדי תפיסה ERT lysosomal. בשילוב של הבדיקה cytometry זרימה, וזמינותו הזה משתמש במודל תא פיזיולוגיים עם דיוק assay מתאימים, רגישות, הפארמצבטית תפוקה גבוהה לדוגמה. NAb זיהוי עם זרם cytometry readout גם הוחל אינדיקציות אחרות. כך למשל, פותחו שיטות לזהות קיימים נוגדנים נגד צהבת E ו-30,וירוס adeno-הקשורים (AAV)31.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים בחירת fluorophore מתאימים, שילוב של LQC כי צגים assay רגישות, המבטיח רמה מספקת של הכדאיות התא ושמירה של הקפדה על הזמנים הדגירה. בדוגמה המוצגת כאן, fluorophores (למשל, אלקסה עבור חיל הים 488, אלקסה עבור חיל הים 647, סייפר 5e), מצומדת כדי ERT lysosomal, מגוונות בביצועים שלהם. אלקסה עבור חיל הים 647, שהיה גם fluorophore נבדק המבריקים32, נבחר להמשך פיתוח וזמינותו. אנו ממליצים כי מספר fluorophores ניתן להעריך בשלב מוקדם בהתפתחות וזמינותו לספק את הרגישות ביותר ואת טווח דינמי. רגישות assay במהלך בדיקה של דגימות צריך לפקח על-ידי הכללת של LQC זה מספיק קרוב כדי להגביל את רגישות זה שהוא נכשל 1% של מסלולי בדיקה1. יחד עם HQC, LQC פועל גם התאמת מערכת QC לפקח assay להיסחף מעל הזמן3. תא אופטימלית הכדאיות ואת הביצועים מושגת על-ידי הכנת בנק תא aliquots חד-פעמיים במוקדמות בבנקים תא חדש המבוסס על השוואה QC תוצאות3,18. תא fluorophore מצומדת סמים הדגירה פעמים הינם גם מרכזי הופעה assay עקבית מאז ספיגת התרופה עולה עם כמות הזמן שהסם מודגרת עם תאים. כדי למזער את השתנות היומיומית של ספיגת התרופה, נתונים לדוגמה ייתכן אפשרות לנרמל את מטריקס במאגר דגימות הבקרה על כל צלחת (למשל, הדגימות שליטה נקודת חיתוך בשיטה הנ ל). גורם חשוב נוסף בהפקת נתונים עקבי עם שיטה זו היא לפקח על צלחת אחידות ולמזער תופעות אפשריות קצה. ניסוי ראשוני עשוי לכלול ביצוע וזמינותו משתמש ב- QC יחיד על פני צלחת מלאה, בעוד ניתן לבצע ניסויים עמידים יותר במהלך שיטת אימות (לדוגמה, החלטיות, דיוק)1. זה מדגים את החשיבות של פריסת המפה33צלחת. כפי שמוצג בדוגמה מפה צלחת, להציב בקרת איכות דגימות משני צידי המסך צלחת של אחידות זה ניתן לעקוב לאורך זמן עם תרשימים Levey-ג'נינגס34.
בזמן הזה assay מנטרת NAbs וגורמים אחרים אשר עלול לעכב ספיגת ERT lysosomal, ניסויים נוספים עשויים להתנהל כדי לאשר על עיכוב ספיגת עקב נוגדנים. אפשרות אחת היא להתייחס דגימות עם החלבון A/G/L, הכורך הלא ספציפית בנוגדנים35. אם הדגימות ממשיך חיובית לאחר החלבון דלדול A/G/L, שאינם נוגדנים מעכבות פקטור עשויים להיות אחראים חוסם את ספיגת התרופה. השיטה המתוארת כאן נועד למדוד עיכוב ספיגת בתיווך נוגדנים, ואת הפקד חיוביים אחרים assay פרמטרים צריך לשקול מחדש אם אחוז גבוה של הנושא דגימות עם גורמים מעכבים הלא-נוגדן נמצאים.
וזמינותו עשוי גם להיות עוד יותר מאופיין להפגין את התווית על-ידי fluorophore סמים traffics אל תא הסלולר המתאימה מבוסס על מנגנון הפעולה של התרופה. בדוגמה המוצגת כאן, ERT צפוי לאגד CI-M6PR על פני התא, תנועה זה ליזוזום. בעבר דיווחנו תוצאות ניסויים מספר המציין כמעט את כל האות פלורסנט נצפו התוצאות בשיטה של ERT התווית על-ידי fluorophore ב ליזוזום8. מצאנו כי האות ERT התווית על-ידי fluorophore חוסל בעקבות טיפול של התאים עם cytochalasin B, אשר משבשת הפנמה דרך עיכוב של רה-ארגון אקטין. כמו כן, ניסוי מתרצה fluorophore חיצוני עם trypan blue, או הפנמה מואטת על-ידי הצבת תאים ב 4 ° C, מצביעים על כך ERT התווית על-ידי fluorophore הוא במהירות הפנימו מעט מאוד הוא כתוצאה ERT מאוגד על פני התא. מיקוד lysosomal אושר דמיין לוקליזציה שיתוף של pH רגישים lysotracker לצבוע עם התרופה fluorophore מצומדת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ניתן לבירור ירידה לפרטים על ספיגת דרך CI-M6PR גם שימוש M6P אקסוגני להתחרות עם סמים עם תוויות עבור איגוד קולטן. ניסויים דומים צריכה להתבצע כדי לאמת את ספיגת קינטיקה ולוקליזציה הסלולר של תרופות fluorophore מצומדת מבחני אחרים.
פלטפורמה זו מבוססת תא assay שימש ללמוד NAbs לסמים טיפולית לנצל אנדוציטוזה קולטן בתיווך CI-M6PR. אנחנו לאחרונה דיווחו על תוצאות באמצעות הפלטפורמה assay שהראו שאין מתאם בין התפתחות יעילות NAb ו סמים עבור elosulfase-אלפא-36,-37. כדי לאמת את הבדיקה עבור הדגימה הקלינית בדיקות, הפרמטרים, כולל רגישות assay, הדיוק, סלקטיביות, ירידה לפרטים, סבילות, חוסן, ולחתוך נקודות, צריך להיות מוערך על פי הוקמה guidances3, 4. יש גם לציין, עבור lysosomal ארטס, NAbs עלולים לפתח עם פוטנציאל להתערב בפעילות סמים דרך איגוד ליד האתר הפעיל של אנזים. באופן כללי, אנו רואים ניטור סוג זה של NAb להיות בעדיפות נמוכה מאז חומצי ולא הפרוטאוליטי הקשים של ליזוזום אינה חיובית לנוגדן-ERT אינטראקציות2,39,40. עם זאת, ייתכן כי NAbs הפרוטאוליטי עמידים קיימים, עלול לעכב את החלק הקטליטי של סמים40. זה וזמינותו צגים התווית על-ידי fluorophore ERT ספיגת את ליזוזום ולאחר מגבלה של וזמינותו הוא חוסר היכולת לפקח הפרוטאוליטי עמידים NAbs. אם סוג זה של NAb חשוד בהתבסס על בטיחות או נתונים יעילות, וזמינותו מפקח על פעילות ERT עליו להיות מפותח, משמש לבדיקת דגימות.
ההערכה של immunogenicity חשוב להבנת השפעת NAbs על הבטיחות והיעילות. הזיהוי של NAbs מסוגל עיכוב במבחנה סמים ספיגת דרך CI-M6PR מספקת הזדמנות להבנת NAb פעילות בתוך vivo. השיטה המוצגת כאן מנצל קו תא אנושי שיבטא CI-M6PR כדי למדוד ההפרעה של fluorophore מצומדת lysosomal ERT הסלולר ספיגת. כבר היה בשימוש בשיטה זו כדי לעקוב אחר NAbs עבור מספר ארטס מיועד לטיפול במחלות באנזימים. הפלטפורמה assay עשויות לחול על שיטות אחרות ללמוד את ההשפעות של NAbs על הרפוי וחיסונים המחייבים של הפנמה הסלולר לתפקוד תקין שלהם.

Immunogenicity הערכה היא חלק חשוב של בטיחות, יעילות תוכנית עבור כל מוצר טיפולית וחיסונים, כולל ארטס ניטור. המטופלים עלולים לפתח תגובה חיסונית שיכולים להשפיע ישירות בטיחות התרופה, יעילות פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic פרופילים. תת-קבוצה של אלה עדה, הנקרא NAbs, עלול לעכב את היעילות ERT בשתי דרכים: דרך עיכוב של תפיסה ERT לתוך התא יישוב או על-ידי עיכוב פעילות קטליטית ERT. השיטה המוצגת כאן נועד למדוד NAbs להפריע תפיסה ERT לתוך התאים. לפקח באופן מלא את הבטיחות והיעילות של ERT טיפולית, ניטור רציף של NAbs היא חיונית שחקרתי כל מתאמים פוטנציאלי עם התוצאות הקליניות או אפקטים pharmacodynamic1.
פלטפורמות להערכת NAbs נגד חלבון הרפוי כוללים פעילות מבוססת תא, אנזימטי ליגנד מחייב מבחני1. הפלטפורמה האופטימלית assay נבחרה בהתבסס על מגוון קריטריונים: מנגנון הפעולה של המוצר טיפולית, הרגישות פלטפורמה assay, סלקטיביות, דיוק חשוב, יכולתה לחקות את פעילות המעכבת NAbs ויוו . מבחני מחייב ליגנד עשוי להיות מתאים במקרים מסוימים (למשל, כאשר אין אפשרות לזהות את קו תא רלוונטי או אם אינה יכולה להיות מושגת הרגישות המתאימה ב- assay מבוססת-תא). עם זאת, ריו דה ז'ניירו הטיוטה הנחיית ה-FDA עבור המסמך תעשייה וסקירות אחרות מקובלים בתעשייה, מבוססת-תא NAb מבחני מומלץ כי אולי כדאי משקפים את המנגנון הביולוגי של סמים ויוו1,2 , 3.
הרכיבים קריטית לפיתוח לזרום cytometry מבוססת תא NAb assay כוללים קו תא מתאים מגיב סמים גירוי, הפונדקאית חיובי-פקד NAb זה מנטרל את ERT של ERT מצומדת fluorophore, המין מבחן ביולוגי מטריקס4,5,6. בחירת קו התא תלויה ERT מנגנון הפעולה, שורות תאים מרובים צריך תוערך במהלך פיתוח assay3. ב. השיטה המתוארת כאן, תאי Jurkat T אדם נבחרו לביטוי CI-M6PR אנדוגני שלהם על פני השטח של התא, היעדר רצפטורים פרגמנט נוגדנים (FcRs) ללא הבחנה לאגד את האזור Fc של רוב הנוגדנים7,8 . במהלך הפיתוח assay, חשוב ליצור פקד שלילי עבור אימות המחקרים, המדגם החולה בדיקה, כמו סרום איחדו מאנשים אשר לא טופלו עם מבחן ה-מאמר1. שורות תאים צריך לסבול גם מטריצות הרלוונטיים של מינים שונים עבור המשכיות לאורך שלבי פיתוח תרופה1nonclinical קלינית, פוסט-שיווק. רכיב נוסף הוא הבחירה של בקרה חיובית של וזמינותו. הפקד חיובי עבור ERT תא ספיגת וזמינותו נבחרה בהתבסס על היכולת שלה לאגד את טיפולית ולנטרל את ספיגת באמצעות CI-M6PR9,1. לעיתים קרובות קשה להשיג כמויות שימושי או בר-קיימא של אנטיגן נטרול של נושאים אנושיים לשימוש כמו פקד assay, במיוחד אצל אוכלוסיות חולה במחלה נדירה2. חלופות כוללים אנטיגן hyper-חיסון בעלי חיים, או מטוהרים זיקה polyclonal או monoclonal נוגדנים קפץ לתוך מטריצה הרלוונטיים assay1. תוך שימוש במטריצה תלויי מין, זה אפשרי כי מעכבות גורמים אחרים מלבד נוגדנים נוכח המטריקס עלול לעכב את ספיגת ERT עוד רכיב קריטי של וזמינותו היא ERT fluorophore מצומדת. צריך להעריך את מבחר fluorophore עבור הבניין ERT עבור כל ERT, מבוסס על הצורך של וזמינותו בהירות pH ויציבות פוטנציאליים חפיפה ספקטרלי לתוך ערוצים אחרים על cytometer זרימת.
וזמינותו המתוארים כאן הוא דוגמה למדידת של NAb על חלבון הטיפולי, כגון ERT, המוסיפה את התא באמצעות CI-M6PR. מספר ארטס, נועד לטיפול בהפרעות באנזימים (LSDs), לנצל את מסלול זה ספיגת תא, מיקוד lysosomal, כולל אלפא elosulfase תסמונת Morquio A, cerliponase אלפא עבור מחלת באטן CLN2, agalsidase אלפא עבור מחלת פברי, ו אלפא alglucosidase10,מחלת פומפה11. מטרת שיטה זו היא למדוד את רמות היחסי של NAbs להפריע הסמים מחייבים, הפנמה דרך CI-M6PR. זה מבוצע בשכבות הקרנה, מאשרות, כייל נוגדנים שלבים3. דגימות הראשון איבחון NAb חיוביות, ואז אישר חיובי בשלב מאשרות. לבסוף, והמדגמים מסך ואשר חיובית ייתכן מדולל באופן סדרתי ליצור עם כייל נוגדנים1. זה וזמינותו ספיגת סמים cytometry זרימה מבוססת תא מספק שיטה mechanistically רלוונטית ונוגעת במבחנה של מדידה NAbs תרופה ספציפית שעשויים להשפיע על הפרופיל תרופתי של סמים. אנחנו קודם לכן לאמת את שיטת ונבדק קלינית דגימות באמצעות הפלטפורמה עבור סמים elosulfase אלפא8. כאן נתאר את פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט כי ניתן להחיל חלבונים טיפולית או ארטס אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

הממשל של אנזים החלפת טיפולים (ארטס) וטיפולים ביולוגיים אחרים לחולים עשוי להפיק תגובה חיסונית נגד סמים. אפיון אותם נוגדנים נגד סמים (עדה), בעיקר כאלו יכול לנטרל את הפעילות הביולוגית של התרופה, כינה נטרול נוגדנים (NAbs), חיוני להבין את ההשפעות של נוגדנים אלה על התרופה פרופיל תרופתי. פרוטוקול זה מתאר שיטה cytometry זרימה מבוססת תא כדי לזהות גורמים המנטרלים את ספיגת הסלולר של ERT lysosomal נציג במטריצת אנושי. הפרוטוקול מורכב שלושה הליכים: הקרנה צעד מאשרות, מבחני כייל נוגדנים כדי לאתר, לזהות, ולהקים הרמה היחסית של נטרול כייל נוגדנים בדגימות הנושא.
בשיטה זו, דגימות הן מעורבב עם המוצר ERT מצומדת fluorophore, ואחר כך מתפשט עם תאים [למשל, האדם לימפוציטים מסוג T (תאי Jurkat)] המבטאים מנוז הקטיון תלויית התא-פני-6-פוספט קולטן (CI-M6PR), ו לבסוף, ניתח עם cytometer זרימה. דגימה ללא NAbs תגרום ספיגת של fluorophore מצומדת ERT המוצר באמצעות CI-M6PR, ואילו, הנוכחות של NAbs לאגד הסם, מפריעים עם CI-M6PR האיגוד לבין ספיגת. הכמות של ERT מצומדת fluorophore על ידי התאים Jurkat נמדדת cytometry זרימה, מוערכים כמו עיכוב אות באחוזים (אחוז) לעומת התגובה שהושג בנוכחות מטריצה נציג סמים נאיבי. בשלב מאשרות, הדגימות הן מראש incubated עם מצומדת ERT beads מגנטי כדי לרוקן גורמים ספציפיים סמים לאגד התרופה (כגון NAbs) לפני דגירה עם תאים. דוגמאות מסך, לאשר חיובי עבור תרופות ספציפיות NAbs ב וזמינותו ואז מדולל באופן סדרתי ליצור עם כייל נוגדנים. נוגדן הכמותיים למחצה titers ייתכן בקורלציה עם מדידות של סמים הבטיחות והיעילות.

ביום הראשון של השיטה, aliquot הקפוא של תאים Jurkat היה הקרת מצופה ו הדגימות מבחן הוכנו. איור 1 מציג מפה צלחת של דוגמה. ביום השני, הדגימות היו מעורבבים עם תאי Jurkat, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 3 שעות ו-15 דקות. התאים היו אז שטף קבוע עם כדורגלן, מנותח על cytometer זרימה. איור 2 מציג דוגמה זרימה הגדרות cytometer.
Cytometry זרימה gating אסטרטגיה נועד למדוד את כמות fluorophore מצומדת סמים בשידור חי בודד Jurkat תאים24 (איור 3). התאים היו מופרדים הלבלב על ידי ציור השער שתואמות פסולת הסלולר [בדרך כלל, נמוך פיזור קדמי (FSC)] ותאים מתים [בדרך כלל, הצד גבוהה פיזור (האס)], עוזב רק תאים חיים עבור ניתוח25. תאים בודדים הופרדו אז מן התא אשכולות על ידי ציור השער שתואמות האזור FSC גבוה, נמוך FSC גובה26. התאים שטופלו כתם הכדאיות שכותרתו תאים מתים או לא בריאים ללא קרום שלם, דרך שער נוסף נוצר כדי לא לכלול תאים מתים22. MFI של תאי יחידה חיה שימש לניתוח של תפיסה ERT fluorophore מצומדת. כדוגמה של פוטנציאל הקרנת assay תוצאות, המטריקס עם כמות גבוהה של הפונדקאית נוגדן נגד סמים חיוביים שליטה [למשל, שליטה באיכות גבוהה (HQC)] עכבות fluorophore מצומדת ספיגת ERT, וכתוצאה מכך MFI נמוך של וכ-300 (איור 3). לעומת זאת, תאי הדגירה עם המטריצה בהיעדרו של הנוגדן בקרה חיובית צריך MFI גבוה יותר (MFI = 37,830 באיור3), הממחיש את ספיגת ERT fluorophore מצומדת.
נטרול נוגדן בקרה חיובית עבור הדוגמה הבאה נבחר בהתבסס על מנגנון הפעולה של התרופה (קרי, תפיסה ERT דרך CI-M6PR). פאנל של fluorophores היה גם נבדק, בהשוואה assay אופטימלית רגישות וטווח דינמי1. סייפר 5e נבחנה עקב שלה פלורסצנטיות מוגברת ב- pH חומצי, אשר עשוי להיות רלוונטי כמה ארטס כאמצעי נוסף של פילוח lysosomal של סמים27. צבע ירוק פלואורסצנטי (למשל, אלקסה עבור חיל הים 488), של הפלורסנט מרחיקת אדום (למשל, עבור חיל הים אלקסה 647) נבחנו גם. דוגמה fluorophores כמה שונה עשוי לבצע מוצג באיור 4a , 4b. בדוגמה, ERT 647 עבור חיל הים אלקסה הייתה הביצועים הטובים ביותר בשל רגישות מעולה (למשל, האחוזים הגבוהים סי-הריכוז הנמוך ביותר PC) שלה טווח דינמי רחב (~ 3 סדרי גודל).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> איור 4: דוגמה נובעת fluorophore שונים-ERT conjugates. (א) במהלך הפיתוח assay, עיקול דילול בקרה חיובית (PC) צריך להעריך באמצעות ארטס fluorophore מצומדת שונים. בדוגמה המוצגת כאן, שני מצומדת fluorophore ארטס (488 עבור חיל הים אלקסה, סייפר 5e) ב- 6.25 µg/mL, בהיר יותר fluorophore מצומדת ERT (אלכסה עבור חיל הים 647) ב- 1.56 µg/mL נבדקו בנוכחות הגדלת ריכוזים של NAbs חיובי-control. (B) לוח זה מראה עקומות מהחלונית A בגרף, באמצעות MFI כדי להציג את הגידול המשמעותי הטווח הדינמי באמצעות של ERT אלקסה עבור חיל הים 647-מצומדת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
השיטה המתוארת היא גישה בשכבות של גילוי, המאשר ויצירת שינוי רמה ומעין כמותית של NAb כייל נוגדנים3. כדי ליצור וזמינותו יהיה מוכן עבור אימות, הפרמטרים כולל רגישות assay, הדיוק, סלקטיביות, ירידה לפרטים, סבילות, חוסן, נקודות חיתוך צריך להיות מוערך על פי הוקמה guidances1,3 .
דוגמאות נחשבו פוטנציאל חיובי ב- assay הזה כאשר ערכי % SI גדול יותר מאשר ההקרנה לחתוך פוינט (SCP) התקבלו. SCP נקבע מבחינה סטטיסטית על-ידי סמים נאיבי דגימות אוכלוסיה נציג ומדידה ירידה יחסית אות בעוצמה (SI)3. הדרכה (למשל של ה-FDA) ממליצים כי SCP נקבעתבמאיון ה 95 של ערכת הנתונים בדרך כלל מבוזרת , שיטות לחישוב של SCP היו מתוארות בפרוטרוט במקום1. דוגמה זה ירד assay האות (נמדד כ עלייה % SI) או מעל SCP היה נחוש בדעתו להיות פוטנציאל חיובי, דוגמאות עם תוצאות גבוה יותר SCP (ללא שינוי או ירידה % SI) נחשבות שליליות.
דוגמאות שהקרין חיובי (% SI מעל SCP) נבדקו וזמינותו מאשרות כדי לקבוע יחודיות של NAbs ERT. הבדיקה מאשרות בוצע על ידי מראש המקננת דגימות עם מצומדת ERT beads מגנטי כדי להסיר נוגדנים ספציפיים סמים או גורמים מעכבים. RR (היחס בין MFI מאשרות את הקרנת MFI) הוערך כדי לקבוע שמספר NAbs להסיר הדגימה. RR גבוה יותר מאשר סף מחושב חיוביות [כלומר, נקודת החתך מאשרות (המק ס)] הצביעו על הנוכחות של NAbs נגד סמים. כמו וזמינותו ההקרנה, המק ס צריך קודם להיות הוקמה על ידי הערכת הטיפול נאיבי דגימות אוכלוסיה נציג ב וזמינותו מאשרות. המק ס היה מבוסס על שיעור חיובי-false נחוש סטטיסטית של 1% וקביעת היה הסף של דגימה חיובית מאושרות (איור 5)3.
דגימות מוקרן, אישר חיובית באופן סדרתי מדולל, במקצועות וזמינותו כייל נוגדנים כדי לקבוע את רמת יחסי או כייל של NAbs בכל מדגם. הדילול הגבוהה שבה מדגם בדיקות חיובי כאשר זה עבר סף המיועד [למשל, כייל חתך פוינט (TCP)] הוא מדגם כייל נוגדנים (איור 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> איור 5: דוגמה מדגם תוצאות בדיקת. הפאנלים להציג דוגמאות של דגימות נבדק חיובי או שלילי על-ידי הקרנת מעל או מתחת SCP של 17.51% SI. דוגמאות חיוביות נבדקו ואז וזמינותו מאשרות באמצעות סמים מצומדת beads מגנטי כדי לרוקן את הנוגדן בסמים ספציפיים בין הדגימות לפני בדיקות וזמינותו. דוגמאות עם שחזור יחס (RR) גדול מנקודת החתך מאשרות (קריRR = 1.315) נחשבו להיות מאושרות חיובי. דוגמאות שאישרה חיובי היו מדולל עד האות חצה את כייל נוגדנים לחתוך פוינט (TCP) להקים כייל נוגדנים (דילול פקטור) שבו התוצאה הדגימה שווה כייל את חתך נקודת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
הדיר assay ולשינויים נבדקו במשך מספר ימים, עם אנליסט אחד או יותר. QCs היו מוכנים באצווה אחת בתחילה sub-aliquoted לשימוש 1 x. במרוצת ד' 3, שני אנליסטים לבצע את הבדיקה עם כמה סטים של QCs כדי להדגים את מידת הדיוק של וזמינותו. בנתוני הדוגמה המוצג, האחוזים קורות חיים של דיוק אינטר - ו אינטרה-assay עבור QCs נמצאים פחות מ ההמלצה של ה-FDA את ההדרכה של % CV < 20% (איור 6)1.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> איור 6: דוגמה QC דיוק הנתונים שהופקו במשך שלושה ימים עם שני אנליסטים. דיוק הנתונים חושבו על ידי השונות (ANOVA) באמצעות הנוסחה המוצגים דסילבה. et al. 28. מחדש אינטרה-אצווה (בתוך הרצפים) וסטטיסטיקה אצווה אינטר (בין הרצפים) מדווחים כ- % CV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

כאן אנו מציגים שיטה cytometry זרימה מבוססת תא לזהות נוגדנים נטרול או גורמים אחרים להפריע קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים במטריצה אנושי, כגון לנוזל חוט השדרה (CSF) או בנסיוב אדם.

זיהוי נוגדנים המנטרלים את קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים עם Assay מבוססת-תא

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...